Otofaji ile İlişkili 4B Sistein Peptidaz İnhibitörleri için Hücre Bazlı İlaç Taraması

Özet

Burada, yarı otomatik, yüksek verimli bir tarama formatında lusiferaz bazlı bir raportör testinin kullanımı için ayrıntılı bir protokol açıklıyoruz.

Özet

Artan kanıtlar, yüksek otofajik akının tümör ilerlemesi ve kanser tedavisi direnci ile ilişkili olduğunu göstermiştir. Bireysel otofaji proteinlerinin tahlili, bu yolu hedefleyen terapötik stratejiler için bir ön koşuldur. Otofaji proteazı ATG4B'nin inhibisyonunun genel sağkalımı arttırdığı gösterilmiştir, bu da ATG4B'nin kanser tedavisi için potansiyel bir ilaç hedefi olabileceğini düşündürmektedir. Laboratuvarımız, hücrelerde ATG4B aktivitesini izlemek için seçici lusiferaz bazlı bir test geliştirmiştir. Bu tahlil için, ATG4B'nin substratı, LC3B, deniz kopepodu Gaussia princeps'ten (GLUC) salgılanabilir bir lusiferaz ile C-terminalinde etiketlenir. Bu raportör, aktin hücre iskeleti ile bağlantılıdır, böylece ayrılmadığında hücrelerin sitoplazmasında tutulur. ATG4B aracılı bölünme, geleneksel olmayan sekresyon yoluyla GLAC'ın salınmasına neden olur, bu daha sonra hücresel ATG4B aktivitesinin bir korelasyonu olarak hücre kültüründen süpernatanların toplanmasıyla izlenebilir. Bu makale, bu lusiferaz bazlı testin otomatik yüksek verimli taramaya uyarlanmasını sunmaktadır. Hücresel ATG4B aktivitesinin örnek niteliğindeki yüksek verimli analizi için iş akışını ve optimizasyonu açıklıyoruz.

Giriş

Otofaji, hücrelerin hücre içi homeostazı korumasına ve lizozomlar 1,2,3 yoluyla yaşlı, kusurlu veya gereksiz hücresel içerikleri parçalayarak strese yanıt vermesine izin veren korunmuş bir metabolik süreçtir. Bazı patofizyolojik koşullar altında, bu süreç, besin ve oksijen yoksunluğuna karşı çok önemli bir hücresel yanıt görevi görür ve geri dönüştürülmüş besinler ve lipitlerle sonuçlanır^ve hücrelerin metabolik ihtiyaçlarına uyum sağlamasına izin verir ^2,3,4. Otofaji ayrıca nörodejeneratif bozukluklar, patojen enfeksiyonu ve çeşitli kanser türleri gibi çeşitli hastalıklarla ilişkili hücresel bir stres tepkisi olarak tanımlanmıştır. Kanserde otofajinin işlevi karmaşıktır ve tümörün tipine, evresine ve durumuna bağlıdır. Hasarlı hücrelerin otofajik bozunması yoluyla tümör oluşumunu baskılayabilir, ancak hipoksi, besin yoksunluğu ve sitotoksik hasar^gibi stresli koşullar sırasında hücre sağkalımını iyileştirerek ileri tümörlerin hayatta kalmasını da teşvik edebilir 2,4,5,6.

Birçok çalışma, otofaji inhibisyonunun bir antikanser stratejisi olarak fayda sağladığını göstermiştir. Bu nedenle, otofagozom oluşumu veya lizozomla füzyonu gibi kritik adımların inhibisyonu, kanser kontrolü için etkili bir yöntem olabilir 2,4,5,6. Artan kanıtlar, ATG4B'nin belirli patolojik durumlarda rol oynadığını göstermiştir ve potansiyel bir antikanser hedefi^olarak dikkat çekmiştir ^2,3,4. Örneğin, kolorektal kanser hücrelerinin ve insan epidermal büyüme faktörü reseptörü 2 (HER2) pozitif meme kanseri hücrelerinin, bitişik normal hücrelere göre önemli ölçüde daha yüksek ATG4B ekspresyon seviyelerine^{sahip olduğu gözlenmiştir 2,4}. Prostat kanseri hücrelerinde, ATG4B'nin inhibisyonu, kemoterapi ve radyoterapiye hücre hattına özgü bir duyarlılıkla sonuçlandı⁷. Son zamanlarda, pankreatik duktal adenokarsinomun (PDAC) ATG4B inhibisyonuna karşı özellikle savunmasız olduğuna dair güçlü kanıtlar ortaya çıkmıştır. Örneğin, genetiği değiştirilmiş bir fare modelinde, ATG4B fonksiyonunun aralıklı kaybının PDAC tümör büyümesini azalttığı ve sağkalımı artırdığı gösterilmiştir ^3,4. Genel olarak, ATG4B bazı kanser türlerinde yüksek oranda aşırı eksprese edilir, tümörün ilerlemesi ile ilgilidir ve kanser tedavisi direnci^ile bağlantılıdır ^2,4,8.

Memelilerdeki ATG4 sistein proteazlarının ATG4A-ATG4D olmak üzere dört aile üyesi vardır. Bu proteinler, LC3/GABARAP (ATG8) protein ailesine ^9,10,11 karşı bir miktar hedef seçicilik sergiler ve proteaz aktivitelerine^12,13 bağlı olmayan ek işlevlere sahip olabilir. Ayrıca, ATG4, yeni bir translasyon sonrası modifikasyon türü olan proteinlerin ATG8-ilasyonunu^{düzenlemede işlev görür 11,12}. ATG4B ve ana substratı LC3B en yaygın olarak çalışılanlar olsa da, otofajik ve otofajik olmayan süreçlerin düzenlenmesinde her bir alt aile üyesi için karmaşık bir rol öneren bir resim ortaya çıkmaktadır. Bu, fosforilasyon, asetilasyon, glikozilasyon ve nitrosilasyon yoluyla ATG4B aktivitesini düzenleyen karmaşık bir translasyon sonrası modifikasyon ağı ile daha da desteklenmektedir^{9,10,11,12,13}.

Bilinen birkaç ATG4B inhibitörü yayınlanmıştır 2,4,14,15. Bunlar araştırma araçları olarak uygun olsa da, farmakodinamik profilleri, seçicilikleri veya potansiyelleri, klinik öncesi adaylar olarak gelişmelerini henüz engellemiştir ^4,16. Genel olarak, daha güçlü ve seçici bileşiklerin tanımlanmasına acil bir ihtiyaç vardır. Genellikle, bileşikler protein fonksiyonunun iyi biyokimyasal inhibitörleridir, ancak hücre bazlı tahlillerdeki etkinlikleri zayıftır. Biyokimyasal yöntemler ve hücre bazlı testler dahil olmak üzere ATG4B aktivitesini izlemek için birden fazla test vardır⁴. Daha önce ^8,17 hücrelerinde ATG4B aktivitesini izlemek için basit, lüminesans tabanlı, yüksek verimli bir test geliştirmiştik. Bu test, hücre dışı ortamda stabil ve aktif olan ve ATG4B proteolitik aktivitesine yanıt olarak hücrelerden indüklenebilir şekilde salınabilen Gaussia princeps'ten (GLUC) bir lusiferaz proteini kullanır^18,19.

Bu raportör yapısında dNGLUC, hücrelerin aktin hücre iskeleti ile bağlantılıdır. β-aktin ankrajı ile dNGLUC arasına proteaza özgü bir bağlayıcı eklenebilir ve bu da sekresyonun bağlayıcının bölünmesine bağlı olmasını sağlar. LC3B bölünmesini izleyebilmek için LC3B'nin β-aktin ve dNGLUC arasında tam uzunlukta açık okuma çerçevesini^{kullandık 17,18,19}. dNGLUC'un salgılama mekanizması tam olarak anlaşılamamış olsa da, ATG4B aktivitesini izlemek için spesifiktir, ATG5 nakavt hücrelerinde meydana geldiği gibi genel otofajiye bağlı değildir ve klasik bir sinyal peptidi^{gerektirmeyen} geleneksel olmayan mekanizmalar aracılık eder 4,18,19. Bu raporlayıcıyı küçük molekülleri ve siRNA kütüphanelerini taramak için başarıyla kullandık ve Akt protein kinazları⁸ gibi ATG4B aktivitesinin yeni düzenleyicilerini belirledik. Bu makale, bu lusiferaz raporlayıcının yarı otomatik, yüksek verimli bir tarama formatında kullanımı için ayrıntılı bir protokolü açıklamaktadır.

Protokol

NOT: Tahlil süreci Şekil 1'de özetlenmiştir. Bu protokolde kullanılan tüm malzemeler, reaktifler ve ekipmanlarla ilgili ayrıntılar için Malzeme Tablosuna bakın.

1. Retrovirüs üretimi

NOT: ActinLC3dNGLUC'u kodlayan plazmid pMOWS-ActinLC3dNGLUC^20'dir. Yüksek titreli virüs üretimi için düşük geçişli hücre sayısı kullanın (ideal olarak P20'den az).

1. Dulbecco'nun modifiye kartal ortamındaki (DMEM) kültür HEK293T hücreleri, nemlendirilmiş bir inkübatörde 37 ° C'de% 10 fetal sığır serumu (FBS) ve% 1 penisilin / streptomisin (P / S) ile desteklenmiş, transfeksiyon için tohumlamadan önce% 80 -% 90 birleşene kadar% 5_CO2 atmosferi ile.
2. Transfeksiyondan bir gün önce, hücreleri 1 × 10 6 hücre / kuyu yoğunluğunda 2 mL / tam büyüme ortamında⁶ oyuklu bir plakaya tohumlayın. Plakayı gece boyunca% 5_CO2 atmosferine sahip nemlendirilmiş bir inkübatörde inkübe edin.
   NOT: Lipozomal bazlı bir transfeksiyon reaktifi kullanıyorsanız üreticinin talimatlarını izleyin. Bu protokol, lipozomal bazlı olmayan bir reaktifin kullanımını açıklar. Transfeksiyona başlamadan önce, DNA transfeksiyon reaktifinin, DNA'nın ve ortamın oda sıcaklığına (~15 dakika) dengelenmesini bekleyin.
3. Her transfeksiyon için, 1.5 mL mikrosantrifüj tüplerine 200 μL serumsuz ortam ekleyin. Her tüpe aşağıdaki miktarlarda plazmit ekleyin: 1.000 ng pMOWS-ActinLC3dNGLUC; 900 ng GagPol; 100 ng VSV-G.
   NOT: Burada listelenen plazmit miktarı ve ortam hacmi 12 oyuklu bir plaka içindir. Farklı bir plaka tipi kullanıyorsanız, 5 ng/μL transfer plazmidi, 4.5 ng/μL ambalaj plazmidi ve 0.5 ng/μL zarf plazmidinin nihai konsantrasyonuna ulaşmak için ortam hacmini ve plazmit miktarlarını ayarlayın. Gag ve pol eksprese eden genleri içeren herhangi bir ambalaj plazmidini ve VSV-G eksprese eden geni içeren herhangi bir zarf plazmidini kullanın.
4. DNA transfeksiyon reaktif şişesini 30 saniye boyunca vorteksleyin. Transfeksiyon reaktifinin 4 μL'sini doğrudan seyreltilmiş DNA'yı içeren ortama pipetleyin. Tüpü hafifçe eğerek hafifçe karıştırın.
   NOT: Plastik tüplerin duvarlarına uçlarla dokunmayın. Yukarı ve aşağı pipetleme veya girdap yapmayın.
5. Reaksiyonu oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edin.
6. Reaksiyonu inkübe ederken, eski ortamı 6 oyuklu plakadan çıkarın ve 2 mL/kuyucuklu taze serumsuz ortamla değiştirin.
7. Her bir transfeksiyon kompleksini her bir kuyucuğa damla damla ekleyin.
8. Tüm kuyu yüzeyine eşit dağılım sağlamak için plakayı hafifçe sallayın veya döndürün.
9. Plakayı gece boyunca 37 °C'de% 5_CO2 atmosferine sahip nemlendirilmiş bir inkübatörde inkübe edin.
10. 24 saat sonra, eski ortamı taze tam ortamla (2 mL / kuyu) değiştirin ve hücreleri 72 saat boyunca% 5_CO2 atmosferi ile nemlendirilmiş inkübatöre geri koyun.
11. 72 saat sonra, süpernatanı 50 mL'lik konik bir tüpte hasat edin ve ölü hücreleri ve kalıntıları gidermek için 4 ° C'de 4.000 × g'de 10 dakika santrifüjleyin. Daha fazla saflaştırma için, süpernatanı 0.20 μm'lik bir filtreden geçirmek için 60 mL'lik büyük bir şırınga kullanın. Hemen 300 μL'lik tek kullanımlık alikotlar hazırlayın ve -80 °C'de saklayın.
    NOT: Maksimum ürün etkinliğini korumak için donma-çözülme döngüsünden kaçının.

2. Retroviral transdüksiyon

1. Hücrelerin transdüksiyonundan bir gün önce, hedef hücreleri orta yoğunlukta (1 × 10⁵ hücre/kuyucukta PANC1) 12 oyuklu bir plakada %10 FBS ve %1 P/S ile desteklenmiş 1 mL/oyuklu ortamda tohumlayın_.
   NOT: Farklı hücre tipleri farklı bağlanma yeteneklerine sahip olduğundan, en iyi hücre yoğunluğu önceden belirlenmelidir. İdeal olarak, %40-50 birleşme elde etmek için bir hücre yoğunluğu kullanın.
2. Dondurulmuş retrovirüs alikotlarını -80 °C dondurucudan çıkarın ve her kullanımdan önce buz üzerinde çözdürün.
   NOT: Kullanılmayan alikotları tekrar dondurmayın.
3. 50 mL'lik konik bir tüpte, 8 μg/mL'lik bir nihai konsantrasyonda viral süpernatan ve polibren karışımı hazırlayın.
   NOT: Sonraki hacimler, 500 μL/kuyucuk nihai hacmi içeren 12 oyuklu bir plakanın transdüksiyonu için geçerlidir. Nihai viral süpernatan hacmi, polibren varlığında bir dizi viral dilüsyonun test edilmesiyle tahmin edilebilir. Transgenin istenen ekspresyon seviyelerine ve kullanılan damarın boyutuna bağlı olarak daha yüksek veya daha düşük dilüsyonlar kullanılabilir.
4. Eski ortamı 12 oyuklu plakadan çıkarın ve her oyuğa 500 μL karışım ekleyin. Hücreleri, %5_CO2 atmosferine sahip nemlendirilmiş bir inkübatörde 37 ° C'de gece boyunca viral süpernatan ile inkübe edin.
   NOT: Seçim için bir kontrol olarak kullanmak üzere tam besiyeri (viral süpernatan yok) olan iki kuyu tutun.
5. Virüs içeren ortamı taze tam büyüme ortamı (1 mL / kuyu) ile değiştirin. Hücreleri, 48 saat boyunca% 5_CO2 atmosferi olan nemlendirilmiş inkübatöre geri yerleştirin.

3. Havuzlanmış nüfus seçimi ve bakımı

1. Büyüme ortamını seçim ortamı ile değiştirin (nihai konsantrasyon 1 μg / mL puromisin ile tam büyüme ortamı). Hücrelerin büyümesini izleyin ve seçim ortamını her 2-3 günde bir değiştirin. Birleşme noktasında, 6 oyuklu bir tabağa ve ardından 10 cm çapında bir doku kültürü kabına genişletin.
2. Hücreleri, en azından kontrol (dönüştürülmemiş) hücrelerin tamamen ölmesi için gereken süre boyunca seçim ortamında tutun.
   NOT: Başarılı sonuçlar için, deneysel projeye başlamadan önce optimal puromisin konsantrasyonlarının belirlenmesi önerilir. Bunun için, 3 ila 10 gün arasında transdüksiyonsuz hücreleri öldürmek için gereken minimum konsantrasyonu belirlemek için bir puromisin öldürme eğrisi oluşturun.
3. Hücreler seçim ortamında büyüdükten sonra, hücreleri tam büyüme ortamında genişletin ve deneysel proje için stok alikotlarını dondurun.
   NOT: Geçiş numarasını kaydedin ve geçiş numaraları beşten yüksek olan donmuş stoklardan havuzlanmış popülasyonlarla çalışmaktan kaçının. Testi gerçekleştirmeden önce mikoplazma kontaminasyonunu düzenli olarak kontrol edin. İdeal olarak, maksimum lusiferaz sinyalini elde etmek için her testten önce taze bir hücre partisi kullanın.
4. Hücreleri seçim ortamında tutun ve tahlilden bir gün önce istenen yoğunluğa ulaşmak için yeterli hücreyi tohumlayın.

4. Bileşik ekleme

NOT: Selleckchem küçük molekül kütüphanesi, dimetil sülfoksit (DMSO) içinde 10 mM stok konsantrasyonunda elli 96 oyuklu plakada sekiz sıra ve 10 sütun halinde düzenlenmiş yaklaşık 4.000 bileşikten oluşur.

1. 30 μL bileşiği, nano ölçekli bir akustik sıvı dağıtıcı ile uyumlu bir kaynak plakasının uygun kuyusuna ekleyin. 384 oyuklu bir polipropilen plaka (384PP plaka) kullanın. Bu plakaları kapalı tutun ve -20 °C'de saklayın.
   NOT: Burada açıklanan tarama protokolü, günde toplam 10 test plakası içindir; 24 saatlik bir inkübasyon periyodu ile birlikte son tahlil konsantrasyonu olarak 10 μM'lik sabit bir konsantrasyon kullanıldı.
2. Bileşik kitaplık plakalarını oda sıcaklığında çözdürün.
   NOT: Plakanın tamamen çözüldüğünden ve oda sıcaklığına dengelendiğinden emin olun. Plaka boyunca bir sıcaklık gradyanı, sıvının işlenmesini etkileyebilir.
3. Nano ölçekli bir akustik sıvı dağıtıcı kullanarak 50 nL / kuyuyu 384 oyuklu bir tahlil plakasına dağıtın.
   NOT: Programda seçilen kaynak ve hedef plakaların bu adım için kullanılanlarla eşleştiğinden emin olun.
4. Elektronik tabloda bir dağıtım programı oluşturun.
5. Yazılımı açın.
6. Yeni bir protokol açın. Protokol sekmesinden aşağıdaki seçenekleri belirleyin: Numune plakası formatı, 384PP; Numune plakası tipi, 384PP_DMSO2; ve Hedef plaka tipi, CellCarrier-384 Ultra PN (Şekil 2A).
7. Seçim Listesi altında, dağıtım programını içeren elektronik tabloyu içe aktarmak için içe aktarma seçeneğini (Şekil 2B) seçin (Şekil 2C).
8. Protokolü çalıştır seçeneğini seçin (Şekil 2D), görüntülenen bilgilerin doğru olup olmadığını doğrulayın ve Çalıştır'a tıklayın.
9. Çalıştırma durumu (Şekil 2E) adlı yeni pencerede, Başlat'a tıklayın ve istem pencerelerinde görüntülenen adımları izleyin (Şekil 2F,G).

5. Hücre tohumlama

1. Hücreleri bir hücre kültürü şişesinden veya hücre kültürü Petri kaplarından tripsinize edin ve FBS içeren ortam ekleyerek tripsini nötralize edin.
2. Hücre süspansiyonunu 50 mL'lik konik bir tüpe aktarın ve oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 390 × g'da santrifüjleyin. Daha sonra, süpernatanı nazikçe çıkarın ve hücre peletini 10 mL tam büyüme ortamında yeniden süspanse edin.
3. Hücre sayımı gerçekleştirin.
4. Hücre süspansiyonunu 230 mL tam kültür ortamında 4.6 × 10⁷ hücre ile hazırlayın.
   NOT: Bu hacim ve hücre yoğunluğu, 10x 384 oyuklu tahlil plakası artı iki 384 oyuklu plakanın ölü hacmi içindir.
5. Bölüm 4'te hazırlanan 384 oyuklu bir tahlil plakasının her bir oyuğuna 50 μL hücre süspansiyonu dağıtın.
   NOT: Hücre tohumlama, manuel olarak veya toplu dağıtıcı kullanılarak yapılabilir.
6. Hücreleri, 24 saat boyunca% 5_CO2 atmosferine sahip nemlendirilmiş bir inkübatörde 37 ° C'de inkübe edin.

6. Hücresel süpernatantın hasat edilmesi

NOT: Burada kullanılan sıvı işleme robotik platformu, 96 uç için çok kanallı bir kol ile sıvı işleme gerçekleştirir. Sıvı işleme otomasyonu mevcut değilse, protokol çok kanallı pipetler kullanılarak düşük verimli formata uyarlanabilir.

1. Laboratuvar otomasyonu iş istasyonunun destesini Şekil 3'te gösterildiği gibi yapılandırın.
2. Tek kullanımlık 96 uçlu yığını P1 konumuna yerleştirin (Şekil 3A).
   NOT: Her 96 uçlu yığın, sekiz adet tek kullanımlık raftan oluşur. 96 uçlu çok kanallı bir kol kullanıldığında, 384 oyuklu plaka dört çeyreğe bölünür. Bu nedenle, her bir uç yığını, süpernatanı iki tahlil plakasından iki boş, katı siyah, 384 oyuklu plakaya aktarmak için yeterlidir. Her iki plaka çalışmasından sonra tüm uç yığınının değiştirilmesi gerekir.
3. Tahlil plakalarını P2 ve P4 konumlarına yerleştirin (Şekil 3A).
4. Boş, düz siyah, 384 oyuklu plakaları P3 ve P5 konumlarına yerleştirin (Şekil 3A).
   NOT: Bu esnek ve yetenekli robotik platform bu test için uyarlanmış ve özel bir program yazılmıştır (Şekil 3B).
5. P1 konumundan ipuçlarını alın.
6. P2 pozisyonundaki plakadan 10 μL süpernatan aspire edin ve P3 pozisyonundaki boş, katı siyah plakaya aktarın.
   NOT: Uçlar, kuyu dibindeki hücre tek tabakasını bozmadan süpernatanı aspire etmek için kuyucukların içinde uygun bir derinlikte konumlandırılmalıdır.
7. Uçları P6 konumuna bırakın (Şekil 3A).
8. P2 konumundaki plakanın kalan oyukları için 6.5-6.7 adımlarını tekrarlayın ve ardından süpernatanı P4 konumundan P5 konumuna aktarmak için aynı adımları tekrarlayın.
   NOT: Süpernatanı topladığınızdan ve ilgili kuyucuklara boş, katı siyah plakaya dağıttığınızdan emin olun (Şekil 3C,D). Salgılanan dNGLUC, hücre kültürü ortamında çok kararlı olduğundan, plakalar kapatılabilir ve karanlıkta 4 ° C'de 7 güne kadar saklanabilir.

7. Lusiferaz testi

NOT: Raporlayıcıda kullanılan dNGLUC, hızlı sinyal bozulması ile flaş kinetiği sergiler. Alt tabaka (coelenterazine) eklendikten sonra lüminesansın hızlı bir şekilde bozulması nedeniyle, plaka okuyucu süpernatantlardaki lüminesans sinyalini ölçecek şekilde ayarlanmalıdır; Alt tabakayı bir kuyuya enjekte edin ve birkaç saniye sonra o kuyuyu okuyun. Bu nedenle, enjeksiyon ve okuma adımları arasındaki sürenin tüm numuneler için aynı olmasını sağlamak için lüminesansı izleyebilen ve bir alt tabaka enjektörü ile donatılmış bir plaka okuyucu kullanın. Plaka okuyucuda kullanılan ayarlar Şekil 4'te bulunabilir.

1. Asitlendirilmiş metanol (10 μL 3 M HCl ila 1 mL metanol) içinde 1 mg/mL stok çözeltisi olarak doğal coelenterazine hazırlayın.
   NOT: Laboratuvarda metanolün işlenmesiyle ilgili yerel sağlık ve güvenlik yönergelerine uyun ve cilt ile temasından kaçının. Tahlil başlamadan önce taze çalışma substratı çözeltisini hazırlayın.
2. Enjektör pompasını çalıştırın (Şekil 5A).
3. Hortumu deiyonize suyla durulayın (Şekil 5B-D).
4. Boruyu metanol ile durulayın.
5. Boruyu durularken, substratı 1:100 oranında seyrelterek çalışma substratı çözeltisini hazırlayın (384 oyuklu bir plaka için, substrat stok çözeltisinden 220 μL'yi 21.8 mL 1x fosfat tamponlu salin [PBS]'ye ekleyin).
6. Boruyu alt tabaka çalışma solüsyonu ile durulayın (Şekil 5B-D).
7. Plakayı okuyucuya yükleyin ve Şekil 4'te açıklanan ayarları kullanarak ölçümü başlatın.
8. Tüm tahlil plakaları için 7.6-7.7 arasındaki adımları tekrarlayın.
9. Tüm tahlil plakaları ile işiniz bittiğinde, boruyu metanol ile durulayın.
10. Hortumu deiyonize suyla durulayın.
    NOT: Bu adımın sonunda, hücresel ATG4B aktivitesine karşılık gelen ham lusiferaz değerleri elde edilir. Hücre sayılarının normalizasyonu için, floresan mikroskobu ile her bir oyuktaki hücre sayısını sayarak sonraki adımlar gereklidir.

8. Hücre fiksasyonu ve boyama

NOT: Bu adım, çok kanallı bir pipet yardımıyla veya bir yığın dağıtıcı kullanılarak manuel olarak gerçekleştirilebilir.

1. Hücreleri 15 dakika boyunca% 4 paraformaldehit (1x PBS'de) ile sabitleyin.
   NOT: Laboratuvarda paraformaldehitin kullanımıyla ilgili yerel sağlık ve güvenlik yönergelerine uyun ve cilt ile temasından kaçının. Mümkünse bu adımı bir güvenlik başlığında gerçekleştirin.
2. 1x PBS ile üç kez yıkayın.
3. Çekirdekleri Hoechst 33342 ile 15x PBS'de 1: 5.000 seyreltilmiş olarak boyayın.
4. 1x PBS ile üç kez yıkayın.

9. Görüntü edinme

NOT: Otomatik bir mikroskop kullanarak görüntü alımı gerçekleştirin. Hücre sayısını belirlemek için görüntü elde etmeye alternatif olarak, hücre içi lusiferaz aktivitesi de belirlenebilir. Aşağıda tartışılan hücre sayılarına veya hücre içi lusiferaz aktivitesine normalleşip normalleşmediği konusunda avantajlar ve dezavantajlar vardır. Hücre sayılarını belirlemenin daha az invaziv olduğunu ve hücre içi lusiferaz değerlerini belirlemekten daha düşük değişkenlikle sonuçlandığını bulduk.

1. Mikroskop işletim yazılımını başlatın (Şekil 6).
2. Kurulum sekmesinde, önceden tanımlanmış doğru plaka tipini seçin. Plaka tipi önceden ayarlanmamışsa, plaka boyutlarını manuel olarak girin.
3. Çıkar ve Yükle seçeneğine tıklayarak plakayı mikroskoba yükleyin.
4. Ardından, 20x Air (sayısal açıklık [NA]: 0,4) hedefini seçin.
   NOT: Farklı plaka türlerinde doğru odaklanmaya izin verecek şekilde objektif bileziğinin doğru değere ayarlandığından emin olun.
5. Kanal Seçimi altında, Hoechst 33342'yi seçin.
   NOT: Zaman, güç ve yükseklik için kanal ayarları, kullanılan plaka tipine göre optimize edilmelidir.
6. Düzeni Tanımla'da, plakadan tüm kuyucukları ve kuyudan dört alanı seçin.
7. Çevrimiçi İşler'de, verileri analiz yazılımına aktarmak için ilgili klasörü seçin.

10. Görüntü analizi

NOT: Elde edilen görüntülerden hücre çekirdeklerini segmentlere ayırmak ve saymak için herhangi bir görüntü analiz yazılımı kullanılabilir. Burada, birden fazla otomatik mikroskop dosyasıyla uyumlu belirli bir çevrimiçi yazılımı kullanma adımlarını açıklıyoruz.

1. Görüntü analizi yazılımını başlatın.
2. Görüntü segmentasyonunu başlatmak için Görüntü Analizi sekmesine gidin (Şekil 7A).
3. Giriş Görüntüsü sekmesinde, yeni bir yapı taşı eklemek için + işaretine tıklayın (Şekil 7A).
4. Listeden Çekirdek Bul seçeneğini seçin (Şekil 7A) ve kanal seçeneği olarak Hoechst 33342'yi seçin (Şekil 7B).
5. Görüntüdeki bölümlere ayrılmış nesneleri görsel olarak inceleyin ve en doğru bölümleme yöntemini seçin.
   NOT: Bu deney için C yöntemini kullandık (Şekil 7C). Her yöntem seçeneğinin, mümkün olan en iyi segmentasyonu elde etmek için ayarlanabilen alt kategorileri vardır.
6. Ardından, Sonuçları Tanımla sekmesine tıklayın (Şekil 7C) ve Yöntem seçeneği olarak Standart Çıktı'yı seçin.
7. Alt kategoriden, Nesnelerin çekirdek sayısı ve Nesne sayısı'nı seçin (Şekil 7C).
8. Analizi Diske Kaydet veya Analizi Veritabanına Kaydet seçeneğini kullanarak analiz işlem hattını kaydedin.
9. Toplu Analiz sekmesi altında, ağaçtan analiz edilecek verileri seçin.
10. Yöntem'in altında, adım 10.8'de kaydedilen analiz işlem hattını seçin.
    NOT: Başvurulan yazılımın dışından bir komut dosyası yüklemek veya veritabanına kaydedilmiş mevcut bir analizi yüklemek de mümkündür.
11. Analizi başlatmak için Analizi Çalıştır'a tıklayın (Şekil 7D). Bu iş akışının sonunda iki veri kümesi oluşturulur: süpernatantlardan gelen ham lusiferaz değerleri ve her bir oyuktaki hücre sayısı. Hücre başına lusiferaz değerini normalleştirmek için her ikisini de kullanın.

Sonuçlar

Önceki bir yayında⁸, bu testi küçük molekül ve siRNA kütüphanelerini taramak için başarıyla kullandık ve ATG4B'nin yeni düzenleyicilerini tanımladık. Burada, bu lusiferaz raporlayıcının protokolünü ve temsili sonuçlarını yarı otomatik, yüksek verimli bir tarama formatında açıklıyoruz. Şekil 8 , hem hücre çekirdeği hem de lüminesans için ham veri analizinin bir örneğini göstermektedir. Lüminesans ölçümünün tipik bir sonucu

Tartışmalar

Bu protokol, ATG4B inhibitörlerinin tanımlanması için hücre bazlı bir raportör gen testini tanımlar. Birincil isabetlerin tanımlanması, β-aktin ve dNGLUC arasında LC3B'nin tam uzunlukta açık okuma çerçevesini eksprese eden hücrelerin işlenmesi üzerine lusiferaz aktivitesine dayanır. Bu testin bazı avantajları, hücreleri parçalamadan dNGLUC'u tespit edebildiği için hassas, oldukça kantitatif ve noninvaziv olmasıdır. Bu makale, kararlı bir hücre hattı ve birincil tarama oluşturmak için ayr...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
50 µL Disposable Tips - Non-filtered, Pure, Nested 8 Stack (Passive Stack)	Tecan	30038609	Disposable 96-tip rack
BioTek MultiFlo	BioTek		bulk dispenser
Coelenterazine	Santa Cruz Biotechnology	sc-205904	substrate
Columbus Image analysis software	Perkin Elmer	Version 2.9.1	image analysis software
DPBS (1x)	Gibco	14190-144
Echo Qualified 384-Well Polypropylene Microplate, Clear, Non-sterile	Beckman Coulter	001-14555	384PP plate
EnVision II	Perkin Elmer		luminescence plate reader
Express pick Library (96-well)-L3600-Z369949-100µL	Selleckchem	L3600	Selleckchem
FMK9A	MedChemExpress	HY-100522
Greiner FLUOTRAC 200 384 well plates	Greiner Bio-One	781076	solid-black 384-well plates
Harmony Imaging software	Perkin Elmer	Version 5.1	imaging software
Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate - 10 mg/mL Solution in Water	ThermoFisher	H3570	Hoechst 33342
Labcyte Echo 550 series with Echo Cherry Pick software	Labcyte/Beckman Coulter		nanoscale acoustic liquid dispenser
Milli-Q water			deionized water
Opera Phenix High-Content Screening System	Perkin Elmer		automated microscope
Paraformaldehyde solution 4% in PBS	Santa Cruz Biotechnology	sc-281692
PhenoPlate 384-well, black, optically clear flat-bottom, tissue-culture treated, lids	Perkin Elmer	6057300	CellCarrier-384 Ultra PN
pMOWS-ActinLC3dNGLUC			Obtained from Dr. Robin Ketteler (Department of Human Medicine, Medical School Berlin)
Polybrene Infection / Transfection Reagent	Merck	TR-1003-G	polybrene
Puromycin dihydrochloride, 98%, Thermo Scientific Chemicals	ThermoFisher	J61278.ME	Puromycin
Tecan Freedom EVO 200 robot	Tecan		liquid handling robotic platform
X-tremeGENE HP DNA Transfection Reagent Roche	Merck	6366244001	DNA transfection reagent