Otofaji ile İlişkili 4B Sistein Peptidaz İnhibitörleri için Hücre Bazlı İlaç Taraması

Özet

Burada, yarı otomatik, yüksek verimli bir tarama formatında lusiferaz bazlı bir raportör testinin kullanımı için ayrıntılı bir protokol açıklıyoruz.

Özet

Artan kanıtlar, yüksek otofajik akının tümör ilerlemesi ve kanser tedavisi direnci ile ilişkili olduğunu göstermiştir. Bireysel otofaji proteinlerinin tahlili, bu yolu hedefleyen terapötik stratejiler için bir ön koşuldur. Otofaji proteazı ATG4B'nin inhibisyonunun genel sağkalımı arttırdığı gösterilmiştir, bu da ATG4B'nin kanser tedavisi için potansiyel bir ilaç hedefi olabileceğini düşündürmektedir. Laboratuvarımız, hücrelerde ATG4B aktivitesini izlemek için seçici lusiferaz bazlı bir test geliştirmiştir. Bu tahlil için, ATG4B'nin substratı, LC3B, deniz kopepodu Gaussia princeps'ten (GLUC) salgılanabilir bir lusiferaz ile C-terminalinde etiketlenir. Bu raportör, aktin hücre iskeleti ile bağlantılıdır, böylece ayrılmadığında hücrelerin sitoplazmasında tutulur. ATG4B aracılı bölünme, geleneksel olmayan sekresyon yoluyla GLAC'ın salınmasına neden olur, bu daha sonra hücresel ATG4B aktivitesinin bir korelasyonu olarak hücre kültüründen süpernatanların toplanmasıyla izlenebilir. Bu makale, bu lusiferaz bazlı testin otomatik yüksek verimli taramaya uyarlanmasını sunmaktadır. Hücresel ATG4B aktivitesinin örnek niteliğindeki yüksek verimli analizi için iş akışını ve optimizasyonu açıklıyoruz.

Giriş

Otofaji, hücrelerin hücre içi homeostazı korumasına ve lizozomlar 1,2,3 yoluyla yaşlı, kusurlu veya gereksiz hücresel içerikleri parçalayarak strese yanıt vermesine izin veren korunmuş bir metabolik süreçtir. Bazı patofizyolojik koşullar altında, bu süreç, besin ve oksijen yoksunluğuna karşı çok önemli bir hücresel yanıt görevi görür ve geri dönüştürülmüş besinler ve lipitlerle sonuçlanır^ve hücrelerin metabolik ihtiyaçlarına uyum sağlamasına izin verir ^2,3,4.

Protokol

NOT: Tahlil süreci Şekil 1'de özetlenmiştir. Bu protokolde kullanılan tüm malzemeler, reaktifler ve ekipmanlarla ilgili ayrıntılar için Malzeme Tablosuna bakın.

1. Retrovirüs üretimi

NOT: ActinLC3dNGLUC'u kodlayan plazmid pMOWS-ActinLC3dNGLUC^20'dir. Yüksek titreli virüs üretimi için düşük geçişli hücre sayısı kullanın (ideal olarak P20'den az).

1. Dulbecco'nun modifiye kartal ortamındaki (DMEM) kültür HEK293T hücreleri, nemlendirilmiş bir inkübatörde 37 ° C'de% 10 fetal sığır serumu (FBS) ve% 1 penisilin / streptomisin ....

Tartışmalar

Bu protokol, ATG4B inhibitörlerinin tanımlanması için hücre bazlı bir raportör gen testini tanımlar. Birincil isabetlerin tanımlanması, β-aktin ve dNGLUC arasında LC3B'nin tam uzunlukta açık okuma çerçevesini eksprese eden hücrelerin işlenmesi üzerine lusiferaz aktivitesine dayanır. Bu testin bazı avantajları, hücreleri parçalamadan dNGLUC'u tespit edebildiği için hassas, oldukça kantitatif ve noninvaziv olmasıdır. Bu makale, kararlı bir hücre hattı ve birincil tarama oluşturmak için ayr.......

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
50 µL Disposable Tips - Non-filtered, Pure, Nested 8 Stack (Passive Stack)	Tecan	30038609	Disposable 96-tip rack
BioTek MultiFlo	BioTek		bulk dispenser
Coelenterazine	Santa Cruz Biotechnology	sc-205904	substrate
Columbus Image analysis software	Perkin Elmer	Version 2.9.1	image analysis software
DPBS (1x)	Gibco	14190-144
Echo Qualified 384-Well Polypropylene Microplate, Clear, Non-sterile	Beckman Coulter	001-14555	384PP plate
EnVision II	Perkin Elmer		luminescence plate reader
Express pick Library (96-well)-L3600-Z369949-100µL	Selleckchem	L3600	Selleckchem
FMK9A	MedChemExpress	HY-100522
Greiner FLUOTRAC 200 384 well plates	Greiner Bio-One	781076	solid-black 384-well plates
Harmony Imaging software	Perkin Elmer	Version 5.1	imaging software
Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate - 10 mg/mL Solution in Water	ThermoFisher	H3570	Hoechst 33342
Labcyte Echo 550 series with Echo Cherry Pick software	Labcyte/Beckman Coulter		nanoscale acoustic liquid dispenser
Milli-Q water			deionized water
Opera Phenix High-Content Screening System	Perkin Elmer		automated microscope
Paraformaldehyde solution 4% in PBS	Santa Cruz Biotechnology	sc-281692
PhenoPlate 384-well, black, optically clear flat-bottom, tissue-culture treated, lids	Perkin Elmer	6057300	CellCarrier-384 Ultra PN
pMOWS-ActinLC3dNGLUC			Obtained from Dr. Robin Ketteler (Department of Human Medicine, Medical School Berlin)
Polybrene Infection / Transfection Reagent	Merck	TR-1003-G	polybrene
Puromycin dihydrochloride, 98%, Thermo Scientific Chemicals	ThermoFisher	J61278.ME	Puromycin
Tecan Freedom EVO 200 robot	Tecan		liquid handling robotic platform
X-tremeGENE HP DNA Transfection Reagent Roche	Merck	6366244001	DNA transfection reagent