Detección de fármacos basados en células para inhibidores de la 4B cisteína peptidasa relacionada con la autofagia

Resumen

Aquí, describimos un protocolo detallado para el uso de un ensayo reportero basado en luciferasa en un formato de cribado semiautomatizado de alto rendimiento.

Resumen

Cada vez hay más pruebas de que el flujo autofágico alto se relaciona con la progresión tumoral y la resistencia a la terapia contra el cáncer. El ensayo de proteínas individuales de autofagia es un requisito previo para las estrategias terapéuticas dirigidas a esta vía. Se ha demostrado que la inhibición de la proteasa de autofagia ATG4B aumenta la supervivencia general, lo que sugiere que ATG4B podría ser una posible diana farmacológica para el tratamiento del cáncer. Nuestro laboratorio ha desarrollado un ensayo selectivo basado en luciferasa para monitorizar la actividad de ATG4B en células. Para este ensayo, el sustrato de ATG4B, LC3B, se marca en el extremo C-terminal con una luciferasa secretable del copépodo marino Gaussia princeps (GLUC). Este reportero está unido al citoesqueleto de actina, manteniéndolo así en el citoplasma de las células cuando no se separa. La escisión mediada por ATG4B da lugar a la liberación de GLUC por secreción no convencional, que luego puede monitorizarse mediante la recolección de sobrenadantes de cultivos celulares como correlato de la actividad celular de ATG4B. En este trabajo se presenta la adaptación de este ensayo basado en luciferasa al cribado automatizado de alto rendimiento. Describimos el flujo de trabajo y la optimización para un análisis ejemplar de alto rendimiento de la actividad celular de ATG4B.

Introducción

La autofagia es un proceso metabólico conservado que permite a las células mantener la homeostasis intracelular y responder al estrés degradando el contenido celular envejecido, defectuoso o innecesario a través de los lisosomas ^1,2,3. En algunas condiciones fisiopatológicas, este proceso actúa como una respuesta celular crucial a la privación de nutrientes y oxígeno, lo que resulta en nutrientes y lípidos reciclados, lo que permite que las células se adapten a sus necesidades metabólicas ^2,3,4. La autofagia también se ha identificado como una respuesta al estrés celular relacionada con varias enfermedades, como trastornos neurodegenerativos, infecciones por patógenos y varios tipos de cáncer. La función de la autofagia en el cáncer es compleja y depende del tipo, el estadio y el estado del tumor. Puede suprimir la tumorigénesis a través de la degradación autofágica de las células dañadas, pero también puede promover la supervivencia de los tumores avanzados al mejorar la supervivencia celular durante condiciones estresantes, como la hipoxia, la privación de nutrientes y el daño citotóxico 2,4,5,6.

Varios estudios han demostrado que la inhibición de la autofagia proporciona un beneficio como estrategia contra el cáncer. Así, la inhibición de pasos críticos, como la formación de autofagosomas o su fusión con el lisosoma, podría ser un método eficaz para el control del cáncer 2,4,5,6. Cada vez hay más pruebas que demuestran que ATG4B está implicado en ciertas condiciones patológicas, y ha ganado atención como una posible diana anticancerígena ^2,3,4. Por ejemplo, se observó que las células de cáncer colorrectal y las células de cáncer de mama positivas para el receptor 2 del factor de crecimiento epidérmico humano (HER2) tenían niveles de expresión de ATG4B significativamente más altos que las células normales adyacentes ^2,4. En las células de cáncer de próstata, la inhibición de ATG4B dio lugar a una susceptibilidad específica de la línea celular a la quimioterapia y la radioterapia⁷. Recientemente, ha surgido evidencia sólida de que el adenocarcinoma ductal pancreático (PDAC) es particularmente vulnerable a la inhibición de ATG4B. Por ejemplo, en un modelo de ratón modificado genéticamente, se demostró que la pérdida intermitente de la función de ATG4B reduce el crecimiento tumoral de PDAC y aumenta la supervivencia ^3,4. En general, ATG4B está altamente sobreexpresado en algunos tipos de cáncer, se relaciona con la progresión del tumor y se relaciona con la resistencia a la terapia contra el cáncer ^2,4,8.

Las proteasas de cisteína ATG4 en mamíferos tienen cuatro miembros de la familia, ATG4A-ATG4D. Estas proteínas exhiben cierta selectividad hacia la familia de proteínas LC3/GABARAP (ATG8) 9,10,11 y pueden tener funciones adicionales no relacionadas con su actividad proteasa^12,13. Además, ATG4 funciona en la regulación de un nuevo tipo de modificación postraduccional, la ATG8-ilación de proteínas^11,12. Si bien ATG4B y su sustrato principal LC3B son los más estudiados, está surgiendo un panorama que sugiere un papel complejo para cada miembro de la subfamilia en la regulación de los procesos autofágicos y no autofágicos. Esto se corrobora aún más por una compleja red de modificaciones postraduccionales que regulan la actividad de ATG4B a través de la fosforilación, acetilación, glicosilación y nitrosilación 9,10,11,12,13.

Se han publicado varios inhibidores conocidos de ATG4B 2,4,14,15. Si bien estos son adecuados como herramientas de investigación, su perfil farmacodinámico, selectividad o potencia aún no los han desarrollado como candidatos preclínicos ^4,16. En general, existe una necesidad urgente de identificar compuestos más potentes y selectivos. A menudo, los compuestos son buenos inhibidores bioquímicos de la función de las proteínas, pero su eficacia en los ensayos basados en células es pobre. Existen múltiples ensayos para monitorizar la actividad de ATG4B, incluyendo métodos bioquímicos y ensayos basados en células⁴. Anteriormente hemos desarrollado un ensayo simple, basado en luminiscencia y de alto rendimiento para monitorear la actividad de ATG4B en las celdas ^8,17. Este ensayo utiliza una proteína luciferasa de Gaussia princeps (GLUC) que es estable y activa en el medio extracelular y puede ser liberada induciblemente de las células en respuesta a la actividad proteolítica ATG4B^18,19.

En esta construcción reportera, dNGLUC está ligada al citoesqueleto de actina de las células. Se puede introducir un enlazador específico de proteasa entre el anclaje de β-actina y dNGLUC, haciendo que la secreción dependa de la escisión del enlazador. Utilizamos el marco de lectura abierto de longitud completa de LC3B entre β-actina y dNGLUC, para poder monitorizar la escisión de LC3B^17,18,19. Aunque el mecanismo de secreción de dNGLUC es poco conocido, es específico para monitorizar la actividad de ATG4B, no depende de la autofagia global como ocurre en las células knockout de ATG5 y está mediado por mecanismos no convencionales que no requieren un péptido señal clásico 4,18,19. Hemos utilizado con éxito este reportero para cribar moléculas pequeñas y bibliotecas de siRNA, y hemos identificado nuevos reguladores de la actividad de ATG4B, como las proteínas quinasas^{Akt 8}. En este trabajo se describe un protocolo detallado para el uso de este reportero de luciferasa en un formato de cribado semiautomático y de alto rendimiento.

Protocolo

NOTA: El proceso de ensayo se describe en la Figura 1. Consulte la Tabla de materiales para obtener detalles relacionados con todos los materiales, reactivos y equipos utilizados en este protocolo.

1. Producción de retrovirus

NOTA: El plásmido que codifica la ActinaLC3dNGLUC es pMOWS-ActinLC3dNGLUC²⁰. Utilice un número bajo de células para la producción de virus de alto título (idealmente menos de P20).

1. Cultivo HEK293T células en medio de águila modificado de Dulbecco (DMEM) suplementado con 10% de suero fetal bovino (FBS) y 1% de penicilina/estreptomicina (P/S) a 37 °C en una incubadora humidificada, con una atmósfera de 5% de CO₂ hasta que estén 80%-90% confluentes antes de la siembra para la transfección.
2. El día antes de la transfección, siembre las células en una placa de 6 pocillos a una densidad de 1 × 10⁶ células/pocillo en 2 mL/pocillo de medio de crecimiento completo. Incubar la placa durante la noche en una incubadora humidificada con una atmósfera de 5% de CO₂.
   NOTA: Siga las instrucciones del fabricante si utiliza un reactivo de transfección a base de liposomas. Este protocolo describe el uso de un reactivo no liposomal. Antes de comenzar la transfección, deje que el reactivo de transfección de ADN, el ADN y los medios se equilibren a temperatura ambiente (~15 min).
3. Para cada transfección, añadir 200 μL de medio libre de suero a tubos de microcentrífuga de 1,5 mL. En cada tubo, añadir las siguientes cantidades de plásmidos: 1.000 ng de pMOWS-ActinLC3dNGLUC; 900 ng de GagPol; 100 ng de VSV-G.
   NOTA: La cantidad de plásmidos y el volumen de medios indicados aquí son para una placa de 12 pocillos. Si utiliza un tipo de placa diferente, ajuste el volumen del medio y las cantidades de plásmido para alcanzar la concentración final de 5 ng/μL de plásmido de transferencia, 4,5 ng/μL de plásmido de empaquetamiento y 0,5 ng/μL de plásmido de envoltura. Utilice cualquier plásmido de empaquetamiento que contenga genes que expresen gag y pol, y cualquier plásmido de envoltura que contenga el gen que expresa VSV-G.
4. Vortex el vial de reactivo de transfección de ADN durante 30 s. Pipetear 4 μL del reactivo de transfección directamente en el medio que contiene el ADN diluido. Mezcle suavemente inclinando suavemente el tubo.
   NOTA: No toque las paredes de los tubos de plástico con las puntas. No pipetee hacia arriba y hacia abajo ni haga vórtices.
5. Incubar la reacción durante 15 minutos a temperatura ambiente.
6. Mientras incuba la reacción, retire el medio viejo de la placa de 6 pocillos y reemplácelo con 2 ml/pocillo de medio fresco sin suero.
7. Agregue cada complejo de transfección a cada pocillo gota a gota.
8. Agite o agite suavemente la placa para asegurar una distribución uniforme en toda la superficie del pocillo.
9. Incubar la placa durante la noche a 37 °C en una incubadora humidificada con una atmósfera de 5% de CO₂.
10. Después de 24 h, reemplace el medio viejo por medio completo fresco (2 mL/pocillo) y devuelva las células a la incubadora humidificada con una atmósfera de 5% de CO₂ durante 72 h.
11. Después de 72 h, recolectar el sobrenadante en un tubo cónico de 50 mL y centrifugar durante 10 min a 4.000 × g a 4 °C para eliminar las células muertas y los residuos. Para una mayor purificación, utilice una jeringa grande de 60 ml para pasar el sobrenadante a través de un filtro de 0,20 μm. Preparar inmediatamente alícuotas de un solo uso de 300 μL y conservar a -80 °C.
    NOTA: Evite un ciclo de congelación y descongelación para mantener la máxima actividad del producto.

2. Transducción retroviral

1. El día antes de la transducción de las células, siembre las células diana a una densidad media (PANC1 a 1 × 10 5 células/pocillo) en una placa de 12 pocillos en 1 mL/pocillo de medio suplementado con 10% de FBS y 1% de P/S. Incubar la placa durante la noche a 37 °C en una incubadora humidificada con una atmósfera de⁵ % de CO₂.
   NOTA: La mejor densidad celular debe establecerse de antemano, ya que los diferentes tipos de células tienen diferentes capacidades de adhesión. Lo ideal es utilizar una densidad celular para obtener una confluencia del 40%-50%.
2. Retire las alícuotas de retrovirus congeladas del congelador a -80 °C y descongele con hielo antes de cada uso.
   NOTA: No vuelva a congelar las alícuotas no utilizadas.
3. En un tubo cónico de 50 ml, preparar una mezcla de sobrenadante viral y polibreno a una concentración final de 8 μg/ml.
   NOTA: Los volúmenes subsiguientes se aplican a la transducción de una placa de 12 pocillos que contiene un volumen final de 500 μL/pocillo. El volumen final del sobrenadante viral se puede estimar probando un rango de diluciones virales en presencia de polibreno. Se pueden utilizar diluciones más altas o más bajas dependiendo de los niveles de expresión deseados del transgén y del tamaño del vaso utilizado.
4. Retire el medio viejo de la placa de 12 pocillos y agregue 500 μL de la mezcla a cada pocillo. Incubar las células con el sobrenadante viral durante la noche a 37 °C en una incubadora humidificada con una atmósfera de 5% de CO₂.
   NOTA: Mantenga dos pocillos con medio completo (sin sobrenadante viral) para usarlos como control para la selección.
5. Reemplace el medio que contiene virus con un medio de crecimiento completo fresco (1 ml/pocillo). Vuelva a colocar las células en la incubadora humidificada con una atmósfera de 5% de CO₂ durante 48 h.

3. Selección y mantenimiento de la población agrupada

1. Sustituya el medio de cultivo por un medio de selección (medio de cultivo completo con una concentración final de 1 μg/ml de puromicina). Controle el crecimiento de las células y cambie el medio de selección cada 2-3 días. En la confluencia, expanda en una placa de 6 pocillos y luego en una placa de cultivo de tejidos de 10 cm de diámetro.
2. Mantenga las células en medio de selección durante al menos el tiempo que tarden las células de control (no transducidas) en morir por completo.
   NOTA: Para obtener resultados exitosos, se recomienda que se determinen las concentraciones óptimas de puromicina antes de iniciar el proyecto experimental. Para ello, genere una curva de muerte de puromicina para determinar la concentración mínima requerida para matar las células no transducidas entre 3 y 10 días.
3. Una vez que las células estén creciendo en el medio de selección, expanda las células en un medio de crecimiento completo y congele las alícuotas de stock para el proyecto experimental.
   NOTA: Registre el número de pasaje y evite trabajar con poblaciones agrupadas de poblaciones congeladas con números de pasaje superiores a cinco. Compruebe regularmente si hay contaminación por micoplasma antes de realizar el ensayo. Lo ideal es utilizar un lote de células frescas antes de cada ensayo para obtener la máxima señal de luciferasa.
4. Mantenga las células en el medio de selección y siembre suficientes células para alcanzar la densidad deseada el día antes del ensayo.

4. Adición de compuestos

NOTA: La biblioteca de moléculas pequeñas de Selleckchem consta de aproximadamente 4.000 compuestos dispuestos en ocho filas y 10 columnas en cincuenta placas de 96 pocillos a una concentración de 10 mM en dimetilsulfóxido (DMSO).

1. Alícuota 30 μL de compuesto en el pocillo apropiado de una placa fuente que sea compatible con un dispensador de líquido acústico a nanoescala. Utilice una placa de polipropileno de 384 pocillos (placa de 384PP). Mantenga estas placas selladas y almacenadas a -20 °C.
   NOTA: El protocolo de detección descrito aquí es para un total de 10 placas de ensayo por día; se utilizó una concentración fija de 10 μM como concentración final del ensayo junto con un período de incubación de 24 h.
2. Descongele las placas de la biblioteca compuesta a temperatura ambiente.
   NOTA: Asegúrese de que la placa esté completamente descongelada y equilibrada a temperatura ambiente. Un gradiente de temperatura a través de la placa puede afectar el manejo de líquidos.
3. Dispense 50 nL/pocillo en una placa de ensayo de 384 pocillos utilizando un dispensador de líquido acústico a nanoescala.
   NOTA: Asegúrese de que las placas de origen y destino seleccionadas en el programa coincidan con las utilizadas para este paso.
4. Cree un programa de dispensación en una hoja de cálculo.
5. Abra el software.
6. Abra un nuevo protocolo. En la pestaña Protocolo , seleccione las siguientes opciones: Formato de placa de muestra, 384PP; Tipo de placa de muestra, 384PP_DMSO2; y el tipo de placa de destino, CellCarrier-384 Ultra PN (Figura 2A).
7. En Lista de selección, seleccione la opción de importación (Figura 2B) para importar la hoja de cálculo que contiene el programa de dispensación (Figura 2C).
8. Seleccione la opción Ejecutar protocolo (Figura 2D), compruebe si la información mostrada es correcta y haga clic en Ejecutar.
9. En la nueva ventana llamada Estado de ejecución (Figura 2E), haga clic en Inicio y siga los pasos que se muestran en las ventanas de solicitud (Figura 2F, G).

5. Siembra celular

1. Tripsinar las células de un matraz de cultivo celular o de placas de Petri de cultivo celular y neutralizar la tripsina añadiendo medios que contengan FBS.
2. Transfiera la suspensión celular a un tubo cónico de 50 ml y centrifugue a 390 × g durante 5 min a temperatura ambiente. A continuación, retire suavemente el sobrenadante y vuelva a suspender el gránulo celular en 10 ml de medio de crecimiento completo.
3. Realice el recuento de células.
4. Preparar la suspensión celular con 4,6 × 10⁷ células en 230 mL de medio de cultivo completo.
   NOTA: Este volumen y densidad celular es para 10 placas de ensayo de 384 pocillos más un volumen muerto de dos placas de 384 pocillos.
5. Dispense 50 μL de suspensión celular en cada pocillo de una placa de ensayo de 384 pocillos, preparada en la sección 4.
   NOTA: La siembra de células se puede realizar manualmente o mediante el uso de un dispensador a granel.
6. Incubar las células a 37 °C en una incubadora humidificada con una atmósfera de 5% de CO₂ durante 24 h.

6. Recolección del sobrenadante celular

NOTA: La plataforma robótica de manejo de líquidos utilizada aquí realiza el manejo de líquidos con un brazo multicanal para 96 puntas. Si no se dispone de una automatización para la manipulación de líquidos, el protocolo se puede adaptar a un formato de bajo rendimiento mediante el uso de pipetas multicanal.

1. Configure la plataforma de la estación de trabajo de automatización de laboratorio como se muestra en la Figura 3.
2. Coloque la pila desechable de 96 puntas en la posición P1 (Figura 3A).
   NOTA: Cada pila de 96 puntas está formada por ocho rejillas desechables. Cuando se utiliza un brazo multicanal para 96 puntas, la placa de 384 pocillos se divide en cuatro cuadrantes. Por lo tanto, cada pila de puntas es suficiente para transferir el sobrenadante de dos placas de ensayo a dos placas vacías, de color negro sólido, de 384 pocillos. Toda la pila de puntas debe reemplazarse después de cada ejecución de dos placas.
3. Coloque las placas de ensayo en las posiciones P2 y P4 (Figura 3A).
4. Coloque las placas vacías, de color negro sólido, de 384 pocillos en las posiciones P3 y P5 (Figura 3A).
   NOTA: Esta plataforma robótica flexible y capaz ha sido adaptada para este ensayo y se ha escrito un programa especial (Figura 3B).
5. Obtén las puntas desde la posición P1.
6. Aspirar 10 μL de sobrenadante de la placa en la posición P2 y transferir a la placa vacía de color negro sólido en la posición P3.
   NOTA: Las puntas deben colocarse a una profundidad adecuada dentro de los pocillos para aspirar el sobrenadante sin alterar la monocapa celular en el fondo del pocillo.
7. Deje caer las puntas en la posición P6 (Figura 3A).
8. Repita los pasos 6.5-6.7 para los pocillos restantes de la placa en la posición P2 y, a continuación, repita los mismos pasos para transferir el sobrenadante de la posición P4 a la posición P5.
   NOTA: Asegúrese de recoger el sobrenadante y dispensarlo en los pocillos correspondientes en la placa vacía de color negro sólido (Figura 3C, D). Como el dNGLUC secretado es muy estable en el medio de cultivo celular, las placas pueden sellarse y conservarse hasta 7 días a 4 °C en la oscuridad.

7. Ensayo de luciferasa

NOTA: El dNGLUC utilizado en el reportero exhibe una cinética de destello con un rápido decaimiento de la señal. Debido a la rápida disminución de la luminiscencia después de agregar sustrato (celenterazina), el lector de placas debe configurarse para medir la señal de luminiscencia en los sobrenadantes; Inyecte el sustrato en un pocillo y lea ese pozo después de unos segundos. Por esta razón, utilice un lector de placas que sea capaz de monitorear la luminiscencia y esté equipado con un inyector de sustrato para garantizar que el tiempo entre los pasos de inyección y lectura sea uniforme para todas las muestras. Los ajustes utilizados en el lector de placas se pueden encontrar en la Figura 4.

1. Preparar celenterazina nativa como solución madre de 1 mg/ml en metanol acidificado (10 μl de HCl 3 M por 1 ml de metanol).
   NOTA: Siga las pautas locales de salud y seguridad con respecto a la manipulación de metanol en el laboratorio y evite el contacto con la piel. Prepare la solución de sustrato de trabajo fresca antes de comenzar el ensayo.
2. Inicialice la bomba inyectora (Figura 5A).
3. Enjuague el tubo con agua desionizada (Figura 5B-D).
4. Enjuague el tubo con metanol.
5. Mientras enjuaga la tubería, prepare la solución de sustrato de trabajo diluyendo el sustrato 1:100 (para una placa de 384 pocillos, agregue 220 μL de la solución madre de sustrato a 21,8 ml de solución salina tamponada con fosfato [PBS]).
6. Enjuague el tubo con la solución de trabajo del sustrato (Figura 5B-D).
7. Cargue la placa en el lector e inicie la medición utilizando los ajustes descritos en la Figura 4.
8. Repita los pasos 7.6-7.7 para todas las placas de ensayo.
9. Una vez que haya terminado con todas las placas de ensayo, enjuague el tubo con metanol.
10. Enjuague el tubo con agua desionizada.
    NOTA: Al final de este paso, se obtienen valores brutos de luciferasa que son correlativos a la actividad celular ATG4B. Para la normalización del número de células, los siguientes pasos son necesarios contando el número de células en cada pocillo mediante microscopía de fluorescencia.

8. Fijación y tinción celular

NOTA: Este paso se puede realizar manualmente con la ayuda de una pipeta multicanal o utilizando un dispensador a granel.

1. Fije las células con paraformaldehído al 4% (en 1x PBS) durante 15 min.
   NOTA: Siga las pautas locales de salud y seguridad con respecto a la manipulación de paraformaldehído en el laboratorio y evite el contacto con la piel. Realice este paso con una capucha de seguridad si es posible.
2. Lavar tres veces con 1x PBS.
3. Tiñir los núcleos con Hoechst 33342 diluido 1:5.000 en 1x PBS durante 15 min.
4. Lavar tres veces con 1x PBS.

9. Adquisición de imágenes

NOTA: Realice la adquisición de imágenes con un microscopio automatizado. Como alternativa a la adquisición de imágenes para determinar el número de células, también se puede determinar la actividad de la luciferasa intracelular. Hay ventajas y desventajas con respecto a si uno se normaliza al número de células o a la actividad de la luciferasa intracelular, que se discute a continuación. Encontramos que la determinación del número de células es menos invasiva y da como resultado una menor variabilidad que la determinación de los valores de luciferasa intracelular.

1. Inicie el software operativo del microscopio (Figura 6).
2. En la pestaña Configuración , elija el tipo de placa predefinida correcto. Si el tipo de placa no está preestablecido, introduzca las dimensiones de la placa manualmente.
3. Cargue la placa en el microscopio haciendo clic en la opción Expulsar y cargar .
4. A continuación, elija el objetivo de aire 20x (apertura numérica [NA]: 0,4).
   NOTA: Asegúrese de que el collar del objetivo esté ajustado al valor correcto, lo que permite un enfoque adecuado con diferentes tipos de placas.
5. En Selección de canal, elija Hoechst 33342.
   NOTA: Los ajustes de canal para el tiempo, la potencia y la altura deben optimizarse de acuerdo con el tipo de placa utilizada.
6. En Definir diseño, seleccione todos los pozos de la placa y cuatro campos del pozo.
7. En Trabajos en línea, seleccione la carpeta correspondiente para transferir los datos al software de análisis.

10. Análisis de imágenes

NOTA: Se puede utilizar cualquier software de análisis de imágenes para segmentar y contar núcleos celulares a partir de las imágenes adquiridas. A continuación, describimos los pasos para utilizar un software en línea específico que sea compatible con múltiples archivos de microscopios automatizados.

1. Inicie el software de análisis de imágenes.
2. Vaya a la pestaña Análisis de imagen para iniciar la segmentación de la imagen (Figura 7A).
3. En la pestaña Imagen de entrada , haga clic en el signo + para agregar un nuevo bloque de creación (Figura 7A).
4. En la lista, seleccione la opción Buscar núcleos (Figura 7A) y seleccione Hoechst 33342 como opción de canal (Figura 7B).
5. Inspeccione visualmente los objetos segmentados en la imagen y seleccione el método de segmentación más preciso.
   NOTA: Para este experimento, utilizamos el método C (Figura 7C). Cada opción de método tiene subcategorías que se pueden ajustar para obtener la mejor segmentación posible.
6. A continuación, haga clic en la pestaña Definir resultados (Figura 7C) y seleccione Salida estándar como opción Método .
7. En la subcategoría, seleccione Número de núcleos de objetos y Recuento de objetos (Figura 7C).
8. Guarde la canalización de análisis mediante la opción Guardar análisis en disco o Guardar análisis en base de datos .
9. En la pestaña Análisis por lotes , seleccione los datos que se van a analizar en el árbol.
10. En Método, seleccione la canalización de análisis guardada en el paso 10.8.
    NOTA: También es posible cargar un archivo de script desde fuera del software al que se hace referencia o cargar un análisis existente guardado en la base de datos.
11. Haga clic en Ejecutar análisis para iniciar el análisis (Figura 7D). Al final de este flujo de trabajo, se generan dos conjuntos de datos: los valores brutos de luciferasa de los sobrenadantes y el número de celdas en cada pocillo. Utilice ambos para normalizar el valor de luciferasa por célula.

Resultados

En una publicación anterior⁸, utilizamos con éxito este ensayo para cribar bibliotecas de moléculas pequeñas y siRNA e identificamos nuevos reguladores de ATG4B. A continuación, describimos el protocolo y los resultados representativos de este reportero de luciferasa en un formato de cribado semiautomatizado y de alto rendimiento. La Figura 8 muestra un ejemplo del análisis de datos brutos tanto para los núcleos celulares como para la luminiscencia. Un resultad...

Discusión

Este protocolo describe un ensayo de genes reporteros basado en células para la identificación de inhibidores de ATG4B. La identificación de los aciertos primarios se basa en la actividad de la luciferasa en el tratamiento de las células que expresan el marco de lectura abierto de longitud completa de LC3B entre la β-actina y el dNGLUC. Algunas ventajas de este ensayo son que es sensible, altamente cuantitativo y no invasivo, ya que puede detectar dNGLUC sin lisar las células. En este trabajo se presenta un protoco...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
50 µL Disposable Tips - Non-filtered, Pure, Nested 8 Stack (Passive Stack)	Tecan	30038609	Disposable 96-tip rack
BioTek MultiFlo	BioTek		bulk dispenser
Coelenterazine	Santa Cruz Biotechnology	sc-205904	substrate
Columbus Image analysis software	Perkin Elmer	Version 2.9.1	image analysis software
DPBS (1x)	Gibco	14190-144
Echo Qualified 384-Well Polypropylene Microplate, Clear, Non-sterile	Beckman Coulter	001-14555	384PP plate
EnVision II	Perkin Elmer		luminescence plate reader
Express pick Library (96-well)-L3600-Z369949-100µL	Selleckchem	L3600	Selleckchem
FMK9A	MedChemExpress	HY-100522
Greiner FLUOTRAC 200 384 well plates	Greiner Bio-One	781076	solid-black 384-well plates
Harmony Imaging software	Perkin Elmer	Version 5.1	imaging software
Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate - 10 mg/mL Solution in Water	ThermoFisher	H3570	Hoechst 33342
Labcyte Echo 550 series with Echo Cherry Pick software	Labcyte/Beckman Coulter		nanoscale acoustic liquid dispenser
Milli-Q water			deionized water
Opera Phenix High-Content Screening System	Perkin Elmer		automated microscope
Paraformaldehyde solution 4% in PBS	Santa Cruz Biotechnology	sc-281692
PhenoPlate 384-well, black, optically clear flat-bottom, tissue-culture treated, lids	Perkin Elmer	6057300	CellCarrier-384 Ultra PN
pMOWS-ActinLC3dNGLUC			Obtained from Dr. Robin Ketteler (Department of Human Medicine, Medical School Berlin)
Polybrene Infection / Transfection Reagent	Merck	TR-1003-G	polybrene
Puromycin dihydrochloride, 98%, Thermo Scientific Chemicals	ThermoFisher	J61278.ME	Puromycin
Tecan Freedom EVO 200 robot	Tecan		liquid handling robotic platform
X-tremeGENE HP DNA Transfection Reagent Roche	Merck	6366244001	DNA transfection reagent