Detección de fármacos basados en células para inhibidores de la 4B cisteína peptidasa relacionada con la autofagia

Resumen

Aquí, describimos un protocolo detallado para el uso de un ensayo reportero basado en luciferasa en un formato de cribado semiautomatizado de alto rendimiento.

Resumen

Cada vez hay más pruebas de que el flujo autofágico alto se relaciona con la progresión tumoral y la resistencia a la terapia contra el cáncer. El ensayo de proteínas individuales de autofagia es un requisito previo para las estrategias terapéuticas dirigidas a esta vía. Se ha demostrado que la inhibición de la proteasa de autofagia ATG4B aumenta la supervivencia general, lo que sugiere que ATG4B podría ser una posible diana farmacológica para el tratamiento del cáncer. Nuestro laboratorio ha desarrollado un ensayo selectivo basado en luciferasa para monitorizar la actividad de ATG4B en células. Para este ensayo, el sustrato de ATG4B, LC3B, se marca en el extremo C-terminal con una luciferasa secretable del copépodo marino Gaussia princeps (GLUC). Este reportero está unido al citoesqueleto de actina, manteniéndolo así en el citoplasma de las células cuando no se separa. La escisión mediada por ATG4B da lugar a la liberación de GLUC por secreción no convencional, que luego puede monitorizarse mediante la recolección de sobrenadantes de cultivos celulares como correlato de la actividad celular de ATG4B. En este trabajo se presenta la adaptación de este ensayo basado en luciferasa al cribado automatizado de alto rendimiento. Describimos el flujo de trabajo y la optimización para un análisis ejemplar de alto rendimiento de la actividad celular de ATG4B.

Introducción

La autofagia es un proceso metabólico conservado que permite a las células mantener la homeostasis intracelular y responder al estrés degradando el contenido celular envejecido, defectuoso o innecesario a través de los lisosomas ^1,2,3. En algunas condiciones fisiopatológicas, este proceso actúa como una respuesta celular crucial a la privación de nutrientes y oxígeno, lo que resulta en nutrientes y lípidos reciclados, lo que permite que las células se adapten a sus necesidades metabólicas ^2,3,4

Protocolo

NOTA: El proceso de ensayo se describe en la Figura 1. Consulte la Tabla de materiales para obtener detalles relacionados con todos los materiales, reactivos y equipos utilizados en este protocolo.

1. Producción de retrovirus

NOTA: El plásmido que codifica la ActinaLC3dNGLUC es pMOWS-ActinLC3dNGLUC²⁰. Utilice un número bajo de células para la producción de virus de alto título (idealmente menos de P20).

1. Cultivo HEK293T células en medio de águila modificado de Dulbecco (DMEM) suplementado con 10% de suero fetal bovino....

Discusión

Este protocolo describe un ensayo de genes reporteros basado en células para la identificación de inhibidores de ATG4B. La identificación de los aciertos primarios se basa en la actividad de la luciferasa en el tratamiento de las células que expresan el marco de lectura abierto de longitud completa de LC3B entre la β-actina y el dNGLUC. Algunas ventajas de este ensayo son que es sensible, altamente cuantitativo y no invasivo, ya que puede detectar dNGLUC sin lisar las células. En este trabajo se presenta un protoco.......

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
50 µL Disposable Tips - Non-filtered, Pure, Nested 8 Stack (Passive Stack)	Tecan	30038609	Disposable 96-tip rack
BioTek MultiFlo	BioTek		bulk dispenser
Coelenterazine	Santa Cruz Biotechnology	sc-205904	substrate
Columbus Image analysis software	Perkin Elmer	Version 2.9.1	image analysis software
DPBS (1x)	Gibco	14190-144
Echo Qualified 384-Well Polypropylene Microplate, Clear, Non-sterile	Beckman Coulter	001-14555	384PP plate
EnVision II	Perkin Elmer		luminescence plate reader
Express pick Library (96-well)-L3600-Z369949-100µL	Selleckchem	L3600	Selleckchem
FMK9A	MedChemExpress	HY-100522
Greiner FLUOTRAC 200 384 well plates	Greiner Bio-One	781076	solid-black 384-well plates
Harmony Imaging software	Perkin Elmer	Version 5.1	imaging software
Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate - 10 mg/mL Solution in Water	ThermoFisher	H3570	Hoechst 33342
Labcyte Echo 550 series with Echo Cherry Pick software	Labcyte/Beckman Coulter		nanoscale acoustic liquid dispenser
Milli-Q water			deionized water
Opera Phenix High-Content Screening System	Perkin Elmer		automated microscope
Paraformaldehyde solution 4% in PBS	Santa Cruz Biotechnology	sc-281692
PhenoPlate 384-well, black, optically clear flat-bottom, tissue-culture treated, lids	Perkin Elmer	6057300	CellCarrier-384 Ultra PN
pMOWS-ActinLC3dNGLUC			Obtained from Dr. Robin Ketteler (Department of Human Medicine, Medical School Berlin)
Polybrene Infection / Transfection Reagent	Merck	TR-1003-G	polybrene
Puromycin dihydrochloride, 98%, Thermo Scientific Chemicals	ThermoFisher	J61278.ME	Puromycin
Tecan Freedom EVO 200 robot	Tecan		liquid handling robotic platform
X-tremeGENE HP DNA Transfection Reagent Roche	Merck	6366244001	DNA transfection reagent