基于细胞的自噬相关 4B 半胱氨酸肽酶抑制剂的药物筛选

摘要

在这里，我们描述了在半自动、高通量筛选形式中使用基于荧光素酶的报告基因测定的详细方案。

摘要

越来越多的证据表明，高自噬通量与肿瘤进展和癌症治疗耐药性有关。测定单个自噬蛋白是针对该途径的治疗策略的先决条件。抑制自噬蛋白酶ATG4B已被证明可以增加总生存期，这表明ATG4B可能是癌症治疗的潜在药物靶点。我们的实验室开发了一种基于荧光素酶的选择性检测方法，用于监测细胞中的ATG4B活性。对于该测定，ATG4B 的底物 LC3B 在 C 末端用来自海洋桡足类 Gaussia princeps （GLUC） 的可分泌荧光素酶标记。该报告基因与肌动蛋白细胞骨架相连，因此在未解脱时将其保留在细胞的细胞质中。ATG4B 介导的裂解导致非常规分泌释放 GLUC，然后可以通过从细胞培养物中收获上清液作为细胞 ATG4B 活性的相关性来监测。本文介绍了这种基于荧光素酶的检测方法对自动化高通量筛选的适应。我们描述了细胞ATG4B活性的示例性高通量分析的工作流程和优化。

引言

自噬是一种保守的代谢过程，它允许细胞保持细胞内稳态，并通过溶酶体降解老化、有缺陷或不必要的细胞内容物来应对压力 ^1,2,3。在某些病理生理条件下，该过程是细胞对营养和缺氧的关键反应，导致循环的营养物质和脂质，使细胞能够适应其代谢需求^2,3,4。自噬也被确定为与多种疾病相关的细胞应激反应，例如神经退行性疾病、病原体感染和各种类型的癌症。自噬在癌症中的功能很复杂，取决于肿瘤的类型、分期和状态。它可以通过受损细胞的自噬降解来抑制肿瘤发生，但也可以通过在缺氧、营养剥夺和细胞毒性损伤等应激条件下提高细胞存活率来促进晚期肿瘤的存活 2,4,5,6。

几项研究表明，自噬抑制作为一种抗癌策略是有益的。因此，抑....

研究方案

注：测定过程如图 1所示。有关本协议中使用的所有材料、试剂和设备的详细信息，请参阅 材料表 。

1. 逆转录病毒生产

注：编码ActinLC3dNGLUC的质粒是pMOWS-ActinLC3dNGLUC²⁰。使用低传代数的细胞来生产高滴度病毒（理想情况下小于 P20）。

1. 在37°C下，在5%CO₂ 气氛中，在补充有10%胎牛血清（FBS）和1%青霉素/链霉素（P / S）的Dulbecco改良的Eagle培养基（DMEM）中培养HEK293T细胞，直到它们在80%-90%汇合后接种进行转染。
2. 转染前一天，将细胞以 1 × 10^个细胞/ 孔的密度接种到 6 孔板中，溶于 2 mL/孔的完全生长培养基中。将板在气氛为5%CO₂的加湿培养箱中孵育过夜。
   注：如果使用基于脂质体的转染试剂，请遵循制造商的说明。该方案描述了使用非脂质体试剂。在开始转染之前，让 DNA 转染试剂、DNA 和培养基平衡至室温（~15 分钟）。
3. 对于每次转染，向 1.5 mL 微量离心管中加入 200 μL 无血清培养基。在每个试管中，加入以下量的质粒....

讨论

该协议描述了一种基于细胞的报告基因测定，用于鉴定ATG4B抑制剂。原发性命中的鉴定基于处理表达 β-肌动蛋白和 dNGLUC 之间 LC3B 全长开放阅读框的细胞时的荧光素酶活性。该测定的一些优点是它灵敏、高度定量和非侵入性，因为它可以在不裂解细胞的情况下检测 dNGLUC。本文提出了用于生成稳定细胞系和初步筛选的详细方案。协议中有几个关键步骤。

首先，本文描述的方?.......

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
50 µL Disposable Tips - Non-filtered, Pure, Nested 8 Stack (Passive Stack)	Tecan	30038609	Disposable 96-tip rack
BioTek MultiFlo	BioTek		bulk dispenser
Coelenterazine	Santa Cruz Biotechnology	sc-205904	substrate
Columbus Image analysis software	Perkin Elmer	Version 2.9.1	image analysis software
DPBS (1x)	Gibco	14190-144
Echo Qualified 384-Well Polypropylene Microplate, Clear, Non-sterile	Beckman Coulter	001-14555	384PP plate
EnVision II	Perkin Elmer		luminescence plate reader
Express pick Library (96-well)-L3600-Z369949-100µL	Selleckchem	L3600	Selleckchem
FMK9A	MedChemExpress	HY-100522
Greiner FLUOTRAC 200 384 well plates	Greiner Bio-One	781076	solid-black 384-well plates
Harmony Imaging software	Perkin Elmer	Version 5.1	imaging software
Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate - 10 mg/mL Solution in Water	ThermoFisher	H3570	Hoechst 33342
Labcyte Echo 550 series with Echo Cherry Pick software	Labcyte/Beckman Coulter		nanoscale acoustic liquid dispenser
Milli-Q water			deionized water
Opera Phenix High-Content Screening System	Perkin Elmer		automated microscope
Paraformaldehyde solution 4% in PBS	Santa Cruz Biotechnology	sc-281692
PhenoPlate 384-well, black, optically clear flat-bottom, tissue-culture treated, lids	Perkin Elmer	6057300	CellCarrier-384 Ultra PN
pMOWS-ActinLC3dNGLUC			Obtained from Dr. Robin Ketteler (Department of Human Medicine, Medical School Berlin)
Polybrene Infection / Transfection Reagent	Merck	TR-1003-G	polybrene
Puromycin dihydrochloride, 98%, Thermo Scientific Chemicals	ThermoFisher	J61278.ME	Puromycin
Tecan Freedom EVO 200 robot	Tecan		liquid handling robotic platform
X-tremeGENE HP DNA Transfection Reagent Roche	Merck	6366244001	DNA transfection reagent