يتم وصف طريقة الصفائح الدقيقة القائمة على الكثافة الضوئية لتحديد النمو البكتيري على المدى الطويل في وجود البكتيريا ، وهي مناسبة للأكتينوميسيتات وغيرها من البكتيريا بطيئة النمو. تتضمن هذه الطريقة تعديلات لتقليل التبخر وتكثيف الغطاء ورمز R لحساب مقاييس الإصابة بالفيروس ، بما في ذلك المنطقة الواقعة أسفل المنحنى ، والحد الأقصى للنمو ، والفوعة النسبية.
تعد البكتيريا جزءا أساسيا من البيئات الطبيعية ، ولديها قدرة قوية على تشكيل مجموعات البكتيريا. لفهم كيفية تفاعل العاثيات الفردية مع المضيفات البكتيرية بطيئة النمو مثل الفطريات الشعاعية ، هناك حاجة إلى طريقة سهلة وموثوقة لقياس النمو البكتيري على المدى الطويل في وجود العاثيات. تسمح قارئات الصفائح الدقيقة الطيفية بإجراء قياسات متكررة عالية الإنتاجية ، ولكن احتضان حجم صغير لفترة طويلة يمكن أن يمثل تحديات فنية. يتكيف هذا الإجراء مع صفيحة دقيقة قياسية ذات 96 بئرا للسماح بالزراعة المشتركة للعاثيات والبكتيريا دون أخذ عينات فرعية لمدة 96 ساعة ، مع تسجيل نمو البكتيريا كل 8 ساعات باستخدام قيم الامتصاص الطيفي. يتم تحليل قيم الكثافة الضوئية هذه باستخدام R للحصول على مقاييس العدوى ، بما في ذلك تثبيط النسبة المئوية للنمو ، والفوعة النسبية ، ومؤشر Stacy-Ceballos. توفر الطرق الموضحة هنا طريقة فعالة لإجراء وتحليل تجارب منحنى نمو الصفائح الدقيقة طويلة المدة وتتضمن تعديلات لتقليل التبخر وتكثيف الغطاء. تسهل هذه البروتوكولات المقايسات القائمة على الصفائح الدقيقة للتفاعلات بين المضيفات البكتيرية بطيئة النمو والبكتيريا الخاصة بهم.
البكتيريا أو العاثيات هي فيروسات تصيب البكتيريا. إنها أكثر الكيانات البيولوجية عددا على هذا الكوكب1 ، ومن المقبول عموما أن البكتيريا تؤثر على التطور البكتيري وعمليات النظام البيئي2،3،4. توجد عدة طرق لوصف وقياس وتحليل نطاق مضيف البكتيريا 8 وديناميكيات العدوى 5,6 ، بما في ذلك الطرق القائمة على الأجار مثل طريقة أجار مزدوجة الطبقة7 وطرق الصفائح الدقيقة القائمة على الكثافة الضوئية 8،9،10،11،12. كل طريقة لها مزاياها وعيوبها. نظرا لكفاءتها ، فإن اختبارات الطلاء باستخدام طريقة أجار الطبقة المزدوجة هي "المعيار الذهبي" لمقايسات نطاق المضيف ، ولكن هذه الطريقة كثيفة الوقتوالعمالة 9. تعطي طرق الصفائح الدقيقة السريعة ، التي تعود بنتائج في غضون 24 ساعة أو أقل ، نتائج ممتازة للمضيفات البكتيرية سريعة النمو مثل الإشريكية القولونية9،10،11،12 ولكنها قصيرة جدا لإظهار تطور عدوى البكتيريا في المضيفات البكتيرية البطيئة النمو مثل الفطريات الشعاعية7،13،14،15.
لا يمكن تشغيل اختبار الصفائح الدقيقة القائم على الكثافة الضوئية المصمم للبكتيريا سريعة النمو لعدة أيام مطلوبة لتوصيف ديناميكيات العدوى في بكتيريا مضيفة بطيئة النمو دون حدوث تبخر وإعطاء كثافات بكتيرية عالية بشكل مصطنع. وبالتالي ، فإن الحصول على بيانات عالية الإنتاجية قابلة للمقارنة حول ديناميكيات عدوى البكتيريا للأنواع البكتيرية بطيئة النمو يتطلب تقنيات متخصصة تتكيف مع هذه البكتيريا.
تقلل طريقة الصفيحة الدقيقة المعروضة هنا من التبخر ، مما يسمح بزراعة البكتيريا بطيئة النمو مع العاثية لفترة ممتدة تبلغ 96 ساعة وتمكين التحقيقات في ديناميكيات عدوى العاثيات ونطاق المضيف. تعرض هذه الطريقة أيضا مؤشر Stacy-Ceballos16 ، وهو مقياس قائم على الكثافة الضوئية يسمح بإجراء مقارنات ضراوة بين أنظمة الفيروسات المضيفة المتباينة.
في حين أن هذا البروتوكول مكتوب ل Gordonia terrae ، فقد تم استخدامه أيضا بنجاح لثغرات Gordonia و Gordonia rubripertincta و Gordonia westfalica.
1. إعداد البكتيريا
2. إعداد العاثية
ملاحظة: تم الحصول على النتائج التمثيلية المبلغ عنها باستخدام Gordonia phage DelRio21 ، وهي بكتيريا معتدلة معزولة على G. terrae. كما تم استخدام هذه الطرق بنجاح مع عاثيات جوردونيا الأخرى.
3. إعداد الصفيحة الدقيقة
ملاحظة: يجب استخدام الألواح الدقيقة ذات القاع المسطح ذات 96 بئرا (انظر جدول المواد) لهذه الطريقة. يجب إكمال جميع عمليات تحضير اللوحة وتحميلها في خزانة السلامة البيولوجية ، ويجب استخدام الممارسة الميكروبيولوجية الجيدة17.
4. تحميل اللوحة بالبكتيريا والعاثيات
ملاحظة: يجب إكمال جميع عمليات تحضير اللوحة وتحميلها في خزانة السلامة البيولوجية ، ويجب استخدام الممارسة الميكروبيولوجية الجيدة17 .
5. قياس الحضانة والامتصاص
6. تحليل البيانات
تكون التجربة ناجحة إذا أظهر منحنى النمو الناتج زيادة في عدد البكتيريا الضابطة الإيجابية بمرور الوقت دون أي تذبذب مفاجئ في الامتصاص. يتم عرض أمثلة على تجربة ناجحة في MOI من 1 مع وبدون عدوى عاثية منتجة في الشكل 2 والشكل 3 ، على التوالي. يتم تمثيل العدوى المنتجة عند MOI من 0.01 في الشكل 4. يشير نمط نمو التحكم الإيجابي (المنحنى الأخضر) الذي شوهد في الأشكال الثلاثة إلى أن البكتيريا تنمو ، ولا تتكتل أثناء النمو ، ولا توجد ملوثات. يشار إلى التكتل والتلوث من خلال امتصاص عالي بشكل غير عادي في نقطة زمنية واحدة. عادة ما تزداد الانحرافات المعيارية على مدار الوقت للتجربة. ومع ذلك ، فإن الزيادة الحادة أو الانحرافات المعيارية المتداخلة بين المنحنيات الضابطة والمصابة قد تشير إلى تلوث أو تكتل في بئر واحد أو أكثر.
يوضح منحنى النمو الذي يصور عدوى العاثية المنتجة، الذي يمثله الشكل 2، انخفاض امتصاص البكتيريا بمرور الوقت في الآبار مع إضافة العاثيات. لن يلاحظ هذا الانخفاض في الكثافة البكتيرية إذا كانت البكتيريا خارج النطاق المضيف للعاثيات، كما هو موضح في الشكل 3.
يتم عرض مقاييس العدوى لجميع التجارب التمثيلية ، مع I SC كبير نسبيا للعدوى المنتجة في الشكل 2 والشكل 4 و I SC صغير جدا في الشكل 3 للعاثية التي لم تصيب البكتيريا المضيفة بكفاءة.
الشكل 1: تخطيط الصفيحة الدقيقة. تمتلئ المناطق الرمادية بنسبة 0.1٪ من الأغاروز. الآبار الفارغة في العمود 3 والعمود 4 هي آبار تحكم إيجابية خالية من العاثيات تحتوي فقط على مخزن عاثي وبكتيريا 2.0 × 106 cfu / mL. تحتوي الآبار المنقطة على عاثيات وبكتيريا 2.0 × 106 cfu / mL. تشير النقاط الكبيرة في العمود 5 والعمود 6 إلى MOI من 1 مع 2.0 x 106 pfu / mL phage ؛ تشير النقاط المتوسطة في العمود 7 والعمود 8 إلى MOI 0.1 مع 2.0 × 105 pfu / mL phage ؛ وتشير النقاط الصغيرة في العمود 9 والعمود 10 إلى MOI 0.01 مع 2.0 × 104 pfu / mL phage. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: تجربة منحنى نمو ناجحة مع عاثية في MOI من 1 تصيب البكتيريا المضيفة بشكل منتج. يتم عرض متوسط قيم الامتصاص (± الانحراف المعياري) للبكتيريا غير المصابة (الخضراء) والبكتيريا مع إضافة العاثية (الأزرق). الاختصارات: AUC = المنطقة تحت المنحنى. PIAUC = تثبيط النمو في المئة محسوبة من المنطقة تحت المنحنى ؛ Nمقارب = قيمة ذروة النمو ؛ PImax = تثبيط النمو في المئة محسوبة من قيم نمو الذروة ؛ ISC = مؤشر ستايسي سيبالوس. يمثل هذا الرسم البياني عاثية Gordonia المعتدلة DelRio التي تصيب G. terrae ، وهي البكتيريا التي تم عزلها عليها. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: تجربة منحنى نمو ناجحة مع عاثية في MOI من 1 لا تصيب البكتيريا المضيفة بكفاءة. يتم عرض متوسط قيم الامتصاص (± الانحراف المعياري) للبكتيريا غير المصابة (الخضراء) والبكتيريا مع إضافة العاثية (الأزرق). الاختصارات: AUC = المنطقة تحت المنحنى. PIAUC = تثبيط النمو في المئة محسوبة من المنطقة تحت المنحنى ؛ Nمقارب = قيمة ذروة النمو ؛ PImax = تثبيط النمو في المئة محسوبة من قيم نمو الذروة ؛ ISC = مؤشر ستايسي سيبالوس. يمثل هذا الرسم البياني عدوى G. rubripertincta بواسطة DelRio. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: تجربة منحنى نمو ناجحة مع عاثية عند MOI 0.01. يتم عرض متوسط قيم الامتصاص (± الانحراف المعياري) للبكتيريا غير المصابة (الخضراء) والبكتيريا مع إضافة العاثية (الأزرق). الاختصارات: AUC = المنطقة تحت المنحنى. PIAUC = تثبيط النمو في المئة محسوبة من المنطقة تحت المنحنى ؛ Nمقارب = قيمة ذروة النمو ؛ PImax = تثبيط النمو في المئة محسوبة من قيم نمو الذروة ؛ ISC = مؤشر ستايسي سيبالوس. يمثل هذا الرسم البياني عدوى G. terrae بواسطة DelRio. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
تسمح طريقة الصفيحة الدقيقة القائمة على الكثافة الضوئية هذه بالتحقيق في نطاق مضيف البكتيريا وديناميكيات العدوى11 وتظهر فائدة مؤشر Stacy-Ceballos16 كمقياس لضراوة البكتيريا. في حين يمكن استخدام هذه الطريقة مع أي نظام مضيف للبكتيريا ، فقد تم تصميمه خصيصا لتكييف فحوصات نمو الصفائح الدقيقةالسريعة 9،10،11 للاستخدام مع البكتيريا البطيئة النمو مثل الفطريات الشعاعية. لا يمكن استخدام مقايسات الصفائح الدقيقة السريعة للبكتيريا بطيئة النمو دون تعديلات لمعالجة التبخر وتكثيف الغطاء. تصف هذه الطريقة هذه التعديلات الضرورية وتوضح ، لأول مرة ، استخدام مؤشر Stacy-Ceballos والمقاييس ذات الصلة16 لوصف عدوى البكتيريا.
يمكن أن يمثل التبخر تحديا كبيرا في مقايسات منحنى نمو الصفيحة التي تبلغ 96 بئرا لعدة أيام ؛ تحل هذه الطريقة هذه المشكلة عن طريق إضافة الأغاروز إلى الآبار الحدودية والمسافات بين الآبار. يوفر هامش الأغاروز ، جنبا إلى جنب مع معالجة الغطاء المضادللضباب 22 ، الرطوبة اللازمة داخل الصفيحة الدقيقة ويسمح بقياسات كثافة بصرية موثوقة. بدون الرطوبة المضافة ، يحدث تبخر كبير لتأثير الحافة23 خلال فترة الحضانة الطويلة المطلوبة ، مما يؤدي إلى قراءات كثافة بصرية عالية بشكل مصطنع. تعد معالجة الغطاء المضاد للضباب تعديلا ضروريا لأن تكثيف الغطاء يمكن أن يرفع أيضا قيم الكثافة الضوئية بشكل مصطنع. يعد هز الألواح خلال فترة الحضانة تعديلا موصى به ، حيث قد تتجمع بكتيريا الأكتينوميسيت أثناء النمو ، مما يعطي قيم كثافة بصرية عالية بشكل مصطنع ويقلل بشكل فعال من تعدد العدوى.
تعد نسبة البكتيريا إلى العاثية في التجارب التي تميز ديناميكيات العدوى أمرا بالغ الأهمية ، حيث يجب أن يكون هناك ما يكفي من العاثيات لإظهار تأثير العدوى ولكن ليس كثيرا لدرجة أن عدد البكتيريا المضيفة يتعطل على الفور9 أو يزداد تواتر التحلل بشكل كبير28. في هذه الطريقة ، وجد أن النسبة الأكثر فعالية للحصول على نتائج متسقة كانت MOI من 1 ، ولكن تم الحصول على نتائج قابلة للاستخدام أيضا مع MOIs من 0.1 و 0.01. عند تنفيذ هذه الطريقة ، يوصى باختيار تركيز واحد من البكتيريا واختبار تركيزات متعددة من العاثيات في نطاق MOI من 0.01-19،10،11.
تسمح هذه التقنية الموصوفة هنا بتقييم التفاعلات بين البكتيريا والمضيف بحثا عن البكتيريا بطيئة النمو في مقايسات الصفائح الدقيقة عالية الإنتاجية بدلا من أخذ العينات الفرعية من قارورة مزرعة أكبر في كل فترةقياس 29. علاوة على ذلك ، من خلال توضيح كيفية تكييف فحوصات نمو الصفائح الدقيقة9،10،11 ، تزيد هذه التقنية من فائدة فحوصات البكتيريا الأخرى القائمة على الصفائح الدقيقة للبكتيريا البطيئة النمو ، بما في ذلك توصيف العاثيات5،6،12 ودراسات التطور 30،31. أخيرا ، توضح هذه الطريقة استخدام مؤشر Stacy-Ceballos16 لوصف عدوى البكتيريا. تم تطوير هذا المقياس في البداية باستخدام بيانات من نظام نموذج فيروس قديم ويتم حسابه من قيم الكثافة الضوئية ، مما يمنحه فائدة واسعة النطاق عبر أنظمة الفيروسات المتباينة.
ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.
تم دعم هذا العمل من خلال منحة معهد تكامل الأحياء NSF DBI (BII) (الجائزة رقم 2119968; PI-Ceballos) ومن خلال برنامج Arkansas INBRE ، بمنحة من المعهد الوطني للعلوم الطبية العامة ، (NIGMS) ، P20 GM103429 من المعاهد الوطنية للصحة. يقدر المؤلفون أيضا دعم برنامج باترسون الصيفي للأبحاث الجامعية في جامعة أواتشيتا المعمدانية.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Agarose | Omni-Pur | 2090 | for filling border wells of microplate |
Costar 96 Well Lid Low Evaporation Corner Notch | Corning | 3931 | replacement microplate lid |
Isopropanol | Fisher Chemical | A461-4 | for lid coating |
Microplate reader | Tecan Spark 20M | ||
Microplate Shaker with 4-Place Platform | Thermo Fisher Scientific | 88-861-023 | to shake plates during incubation |
Non-Tissue Culture-Treated Plate 96 well | Falcon (a Corning Brand) | 351172 | microplate for growth curve assay |
Peptone yeast calcium (PYCa) agar | Homemade | 1 g peptone 15 g yeast extract 15 g agar 990 mL dd H2O 4.5 mL 1 M CaCl2 2.5 mL 40% dextrose 1 mL 10 mg/mL cycloheximide | |
Peptone yeast calcium (PYCa) broth | Homemade, from Reference 16 | 1 g peptone 15 g yeast extract 990 mL dd H2O 4.5 ml 1 M CaCl2 2.5 mL 40% dextrose 1 mL 10 mg/mL cycloheximide | |
Peptone yeast calcium (PYCa) top agar | Homemade | 1 g peptone 15 g yeast extract 4 g agar 990 mL dd H2O 4.5 mL 1M CaCl2 2.5 mL 40% dextrose | |
Petri plates | Thermo Fisher Scientific | FB0875713 | for determination of bacterial concentration and phage titer assay |
Phage Buffer | Homemade, from Reference 7 | 10 mL 1 M Tris, pH 7.5 10 mL 1 M MgSO4 4 g NaCl 980 ml dd H2O | |
R software | https://www.r-project.org/ | version 4.3.0 | |
Sterile Disposable PETG Flask Baffled Bottom w/Vented Closure | Thermo Fisher Scientific | 4116-1000 | for bacterial culture |
Triton X-100 | Sigma Aldrich | 9036-19-5 | for lid coating |
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionExplore More Articles
This article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved