방선균테리오파지 감염을 특성화하기 위한 적응형 광학 밀도 기반 마이크로플레이트 분석

요약

광학 밀도 기반 마이크로플레이트 방법은 방선균 및 기타 느리게 성장하는 박테리아에 적합한 박테리오파지가 있는 상태에서 장기간 박테리아 성장을 정량화하는 데 설명됩니다. 이 방법에는 증발 및 뚜껑 응축을 줄이기 위한 수정과 곡선 아래 면적, 성장 최대 및 상대적 독성을 포함한 바이러스 감염 메트릭을 계산하기 위한 R 코드가 포함됩니다.

초록

박테리오파지는 자연 환경의 핵심 부분이며 박테리아 개체군을 형성하는 강력한 능력을 가지고 있습니다. 개별 파지가 방선균과 같이 느리게 성장하는 박테리아 숙주와 어떻게 상호 작용하는지 이해하려면 파지가 있는 상태에서 장기 박테리아 성장을 정량화하는 쉽고 신뢰할 수 있는 방법이 필요합니다. 분광광도계 마이크로플레이트 리더를 사용하면 고처리량 반복 측정이 가능하지만, 소량을 장시간 배양하면 기술적인 문제가 발생할 수 있습니다. 이 절차는 표준 96웰 마이크로플레이트를 조정하여 96시간 동안 하위 샘플링 없이 파지와 박테리아의 공동 배양을 허용하며, 분광 광도계 흡광도 값을 사용하여 8시간마다 박테리아 성장을 기록합니다. 이러한 광학 밀도 값은 R을 사용하여 분석되어 성장 억제 비율, 상대 독성 및 Stacy-Ceballos 지수를 포함한 감염 메트릭을 산출합니다. 여기에 설명된 방법은 연장된 기간의 마이크로플레이트 성장 곡선 실험을 수행하고 분석하는 효과적인 방법을 제공하며 증발 및 뚜껑 응축을 줄이기 위한 수정을 포함합니다. 이러한 프로토콜은 느리게 성장하는 박테리아 숙주와 박테리오파지 간의 상호 작용에 대한 마이크로플레이트 기반 분석을 용이하게 합니다.

서문

박테리오파지 또는 파지는 박테리아를 감염시키는 바이러스입니다. 박테리오파지는 지구상에서 가장 많은 생물학적 존재이며¹, 박테리오파지가 박테리아의 진화와 생태계 과정에 영향을 미친다는 것은 일반적으로 받아들여지고 있다 ^2,3,4. 박테리오파지 숙주 범위⁸ 및 감염^역학5,6을 기술, 측정 및 분석하기 위한 몇 가지 방법이 존재하며, 여기에는 이중층 한천법⁷ 및 광학 밀도 기반 마이크로^{플레이트 방법8,9,10,11,12}과 같은 한천 기반 방법이 포함된다 . 각 방법에는 고유한 장점과 단점이 있습니다. 효율성 때문에 이중층 한천 분석법을 사용한 도금 시험은 숙주 범위 분석의 "황금 표준"이지만 이 방법은 시간과 노동력이 많이 소요된다⁹. 24시간 이내에 결과를 반환하는 신속한 마이크로플레이트 방법은 대장균 9,10,11,12 과 같이 빠르게 성장하는 박테리아 숙주에 대해 우수한 결과를 제공하지만 방선균 7,13,14,15와 같이 느리게 성장하는 박테리아 숙주에서 박테리오파지 감염 진행을 보여주기에는 너무 짧습니다.

빠르게 성장하는 박테리아를 위해 설계된 광학 밀도 기반 마이크로플레이트 분석은 증발이 일어나지 않고 인위적으로 높은 박테리아 밀도를 제공하지 않고는 느리게 성장하는 숙주 박테리아의 감염 역학을 특성화하는 데 필요한 며칠 동안 실행할 수 없습니다. 따라서 느리게 성장하는 박테리아 종에 대한 박테리오파지 감염 역학에 대한 비교 가능한 고처리량 데이터를 얻으려면 이러한 박테리아에 적합한 특수 기술이 필요합니다.

여기에 제시된 마이크로플레이트 방법은 증발을 줄여 느리게 성장하는 박테리아를 연장된 96시간 동안 파지와 함께 배양할 수 있도록 하고 파지 감염 역학 및 숙주 범위에 대한 조사를 가능하게 합니다. 이 방법은 또한 서로 다른 숙주 바이러스 시스템 간의 독성 비교를 허용하는 광학 밀도 기반 메트릭인 Stacy-Ceballos 지수¹⁶을 보여줍니다.

프로토콜

이 프로토콜은 Gordonia terrae용으로 작성되었지만 Gordonia lacunae, Gordonia rubripertincta 및 Gordonia westfalica에도 성공적으로 사용되었습니다.

1. 박테리아 준비

1. 생물 안전 캐비닛에서 Good Microbiological Practice 17을 사용하여 Gordonia terrae CAG3의 단일 콜로니를 0.01mg/mL 시클로헥시미드가 포함된 펩톤 효모 칼슘 브로스¹⁸(PYCa) 200mL와 함께^1L 멸균 배플 플라스크에 접종합니다(재료 표 참조).
2. 플라스크를 30°C에서 배양물이 포화될 때까지 또는 3일 동안 250 rpm으로 진탕하면서 인큐베이션한다⁷.
3. 포화 G. terrae 배양액을 PYCa 배지에 연속적으로 희석하고, PYCa 플레이트 19,20에 10-4^{, 10-5} 및 ^10-6 희석액을 각각 ¹⁰⁰ μL를 스프레드 플레이트로 희석한다. 희석되지 않은 포화 배양액을 4°C에서 냉장 보관한다.
4. 확산 플레이트를 30°C에서 3일 동안 거꾸로 배양한다.
5. 배양 후, 20-200 개의 콜로니가있는 플레이트 인 "셀 수있는 플레이트"를 확인하십시오. 그 판에 있는 집락의 수를 세고 밀리리터당 집락 형성 단위(cfu/mL)를 계산하십시오^.19,20.
6. PYCa 배양액으로 포화 배양액을 4.0 x 10⁶ cfu/mL 박테리아로 희석합니다.

2. 파지 준비

참고: 보고된 대표적인 결과는 G. terrae에서 분리된 온대 박테리오파지인 Gordonia 파지 DelRio²¹로 얻은 것입니다. 이들 방법은 또한 다른 고르도니아 파지와 함께 성공적으로 사용되었다.

1. 분리된 박테리오파지로 시작하여, 파지 완충액⁷에서 파지 샘플을 1 x ^10-8 희석액으로 연속적으로 희석한다. 0.3 mL의 포화 G. terrae 배양물을 각 파지 희석액 10 μL로 감염시켜 이중층 한천 파지 역가 분석⁷을 수행하였다. 5-10 분 실온 배양 후, 박테리아 - 파지 혼합물을 3 mL의 PYCa 상단 한천과 결합하고, PYCa 한천 플레이트에 부어 넣는다.
2. 30°C에서 3일 동안 또는 플라크가 형성될 때까지 거꾸로 된 플레이트를 인큐베이션^{한다 7}.
3. 배양 후, 20-200 개의 플라크가있는 플레이트 인 "셀 수있는 플레이트"를 확인하십시오. 해당 플레이트의 플라크 수를 세고 밀리리터당 플라크 형성 단위(pfu/mL)⁷를 계산합니다.

3. 마이크로플레이트 준비

알림: 이 방법에는 바닥이 평평한 96웰 마이크로플레이트( 재료 표 참조)를 사용해야 합니다. 모든 플레이트 준비 및 로딩은 생물 안전 캐비닛에서 완료되어야 하며 Good Microbiological Practice¹⁷을 사용해야 합니다.

1. Triton-X 100 100 μL, 100% 이소프로판올 40mL, 탈이온수²² 160mL를 혼합하여 김서림 방지 뚜껑 코팅 용액을 준비합니다. 섞이도록 저어주고 실온에서 보관하십시오.
2. 생물 안전 캐비닛에서 멸균 된 6 웰 마이크로 플레이트 뚜껑의 내부 표면에 96 mL의 뚜껑 코팅 용액을 넣고 뚜껑의 가장자리를 잡고 회전시켜 용액으로 덮이도록합니다. 용액을 뚜껑에 20초 동안 그대로 둔 다음 용액을 붓고 뚜껑이 완전히 마를 때까지 오토클레이브 종이 타월로 뚜껑을 비스듬히 뒤집습니다(일반적으로 35-45분 소요). 뚜껑의 가장자리를 잡으십시오.
3. 각 96-웰 마이크로플레이트에 대해 물 중 0.1% 아가로스 20 mL를 준비하고, 전자레인지에 돌려 아가로스를 녹인다.
4. 일단 아가로오스가 50-60°C로 냉각되면, 100 μL의 0.1% 아가로스를 플레이트의 웰 사이의 모든 공간으로 피펫하고, 200 μL의 아가로스를 열 A 및 열 H 및 열 1, 열 2, 열 11, 및 열 12의 웰 내로²³ 번 피펫한다(도 1).

4. 플레이트에 박테리아와 파지 넣기

알림: 모든 플레이트 준비 및 로딩은 생물 안전 캐비닛에서 완료되어야 하며 우수한 미생물 실습¹⁷ 을 사용해야 합니다.

1. 96웰 플레이트에는 각 웰에 2.0 x 10^6cfu/mL 박테리아 75μL이 포함됩니다⁹. 4.0 x 10 6 cfu/mL 세균 배양액을 2x PYCa 배양액으로 1:1로 2.0 x 10⁶ cfu/mL로 희석합니다. 96웰 플레이트당 5mL를 준비합니다.
2. 파지 버퍼⁷ 을 사용하여 파지 용해물을 희석하여 각각 2.0 x 10⁶ pfu/mL, 2.0 x 10⁵ pfu/mL 및 2.0 x 10⁴ pfu/mL 농도의 1mL를 만듭니다. 이것은 마이크로플레이트⁹ 내에서 1, 0.1 및 0.01의 감염 다중도(MOI)를 허용합니다.
3. 마이크로플레이트를 로드하려면 김서림 방지 용액과 아가로스로 준비된 플레이트를 가져와서 그림 1에 따라 2.0 x 10^6cfu/mL 박테리아 75μL를 컬럼 3-10에 피펫합니다.
4. 컬럼 3과 컬럼 4에 75μL의 멸균 파지 버퍼를 각 웰에 추가하여 그림 1에 따라 파지가 없는 양성 대조군으로 사용하고 각 첨가 후 피펫을 위아래로 혼합합니다. 컬럼 5 및 컬럼 6에 2.0 x 10⁶ pfu/mL 파지 75 μL, 컬럼 7 및 컬럼 8에 2.0 x 10⁵ pfu/mL 파지 75 μL, 컬럼 9 및 컬럼 10에 2.0 x 10 4 pfu/mL 파지 75 μL를 추가하고, 각 첨가 후 혼합하기 위해 위아래로 피펫팅합니다.
5. 플레이트의 양쪽 짧은 면을 0.5인치 라벨링 테이프로 테이프로 감아 가스 교환을 허용하면서 플레이트를 부분적으로 밀봉합니다.

5. 배양 및 흡광도 측정

1. 플레이트에 박테리아와 파지가 로드되면 250rpm의 마이크로플레이트 셰이커에 놓고 30°C에서 배양합니다.
2. 플레이트를 96시간 동안 배양하고 16시간부터 8시간마다 마이크로플레이트 리더에서 600nm에서 광학 밀도를 측정합니다. 측정 사이에 플레이트를 셰이커로 되돌립니다.
   참고: 0시간부터 4시간, 6시간, 8시간 및 12시간의 측정 기간을 평가했으며, 감염 후 16시간에서 시작하는 8시간 샘플링 기간이 고르도니아-파지 상호작용을 가장 잘 포착한 것으로 확인되었습니다.
3. 실험 내내 뚜껑에 응결이 있는지 모니터링합니다. 응결이 관찰되면 3.2단계에 따라 코팅된 다른 뚜껑으로 뚜껑을 교체하십시오.
4. 프로토콜 섹션 6에 따라 대조군 및 감염된 성장 곡선을 생성합니다.

6. 데이터 분석

1. 스프레드시트 프로그램을 사용하여 Stacy-Ceballos-Index GitHub 리포지토리(https://github.com/eichristenson/Stacy-Ceballos-Index)의 스프레드시트 레이아웃에 따라 각 파지 희석에 대한 평균 및 표준 편차를 계산합니다.
2. DescTools²⁴, dplyr²⁵, ggplot2 26 및 readxl²⁷ 패키지와 함께 Stacy-Ceballos-Index GitHub 리포지토리(https://github.com/eichristenson/Stacy-Ceballos-Index)의 R 스크립트에 따라 R(재료 표 참조)을 사용하여 대조군 및 감염된 성장 곡선을 만들고 감염 지표를 계산합니다.
   1. AUC_con 은 감염되지 않은 대조군 곡선 아래 면적이고, AUC_inf 는 감염 곡선 아래 면적이다¹⁶. AUC를 계산한 다음 다음 방정식을 사용하여 곡선 아래 면적 값인 PI_AUC¹⁶을 기준으로 성장 억제율을 계산합니다.
      (1 - [AUC_inf/AUC_con]) × 100
   2. 각 곡선의 수평선 점선은 N 점근선(con)으로 표시된 감염되지 않은 성장 피크와 N 점근선_(inf)으로 표시된 감염되지 않은 성장 피크와 함께 최대 성장을 나타냅니다_. N_점근선 값을 식별한 다음, 다음 방정식을 사용하여 이러한 피크 성장 값, PIMAX¹⁶을 기반으로 성장 억제 백분율을 계산합니다.
      (1 - [N_점근선(inf)/ N_{점근선(con})]) × 100
   3. 다음과 같이 PI_AUC 및 PI_max 값으로부터 Stacy-Ceballos 지수 I_SC¹⁶을 계산한다.
      (PI_AUC × PI_max) ^0.5
      시간 경과에 따른 Stacy-Ceballos 지수를 적분하여 상대적 독성을 계산합니다¹⁶.

토론

이 광학 밀도 기반 마이크로플레이트 방법은 박테리오파지 숙주 범위 및 감염 역학(¹¹)에 대한 조사를 가능하게 하고 박테리오파지 독성의 척도로서 Stacy-Ceballos 지수⁽¹⁶)의 유용성을 보여줍니다. 이 방법은 모든 박테리오파지 숙주 시스템에서 사용할 수 있지만 방선균과 같이 느리게 성장하는 박테리아에 사용하기 위해 빠른 마이크로플레이트 성장 분석 9,10,11을 적용하도록 특별히 설계되었습니다. 신속한 마이크로플레이트 분석은 증발 및 뚜껑 응축을 해결하기 위한 수정 없이는 느리게 성장하는 박테리아에 사용할 수 없습니다. 이 방법은 이러한 필요한 수정을 설명하고, 박테리오파지 감염을 설명하기 위해 Stacy-Ceballos 지수 및 관련 메트릭¹⁶의 사용을 처음으로 보여줍니다.

증발은 여러 날의 96웰 플레이트 성장 곡선 분석에서 상당한 도전이 될 수 있습니다. 이 방법은 경계 우물과 우물 사이의 공간에 아가로스를 추가하여 문제를 해결합니다. 김서림 방지 뚜껑 처리⁽²²)와 조합된 아가로스 마진은 마이크로플레이트 내에 필요한 습도를 제공하고 신뢰할 수 있는 광학 밀도 측정을 가능하게 합니다. 습도가 추가되지 않으면, 상당한 에지 효과 증발이 필요한 긴 배양 기간 동안 발생하여(²³ ), 인위적으로 높은 광학 밀도 판독값을 유도한다. 김서림 방지 뚜껑 처리는 뚜껑 응결이 광학 밀도 값을 인위적으로 높일 수 있기 때문에 필요한 수정입니다. 방선균 박테리아가 성장하는 동안 뭉쳐서 인위적으로 높은 광학 밀도 값을 제공하고 감염의 다양성을 효과적으로 감소시킬 수 있으므로 배양 기간 동안 플레이트를 흔드는 것이 좋습니다.

감염 역학을 특징짓는 실험에서 박테리아와 파지의 비율은 매우 중요한데, 그 이유는 감염 효과를 나타내기에 충분한 파지가 있어야 하지만 숙주 박테리아 개체군이 즉시 충돌하거나^용원성 빈도가 급격히 증가할 정도로 많지는 않기^{때문이다 28}. 이 방법에서 일관된 결과를 얻는 데 가장 효과적인 것으로 밝혀진 비율은 MOI가 1이었지만 MOI가 0.1과 0.01인 사용 가능한 결과도 얻었습니다. 이 방법을 구현할 때 하나의 농도의 박테리아를 선택하고 0.01-1 9,10,11의 MOI 범위에서 여러 파지 농도를 테스트하는 것이 좋습니다.

여기에 설명된 이 기술은 박테리오파지-숙주 상호작용이 각 측정 간격에서 더 큰 배양 플라스크로부터의 서브-샘플링(sub-sampling)을 사용하는 것이 아니라, 고-처리량 마이크로플레이트 분석(high-throughput microplate assay)에서 느리게 성장하는 박테리아에 대해 평가될 수 있게 한다²⁹. 또한, 마이크로플레이트 성장 분석법 9,10,11이 어떻게 적용될 수 있는지를 입증함으로써, 이 기술은 파지 특성화 5,6,12 및 진화 연구 ^30,31을 포함하여^, 느리게 성장하는 박테리아에 대한 다른 마이크로플레이트 기반 박테리오파지 분석의 유용성을 증가시킨다. 마지막으로, 이 방법은 박테리오파지 감염을 설명하기 위해 Stacy-Ceballos 지수¹⁶을 사용하는 것을 보여줍니다. 이 메트릭은 처음에 고세균 바이러스 모델 시스템의 데이터로 개발되었으며 광학 밀도 값에서 계산되므로 서로 다른 바이러스 시스템 전반에 걸쳐 널리 유용합니다.

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agarose	Omni-Pur	2090	for filling border wells of microplate
Costar 96 Well Lid Low Evaporation Corner Notch	Corning	3931	replacement microplate lid
Isopropanol	Fisher Chemical	A461-4	for lid coating
Microplate reader	Tecan Spark 20M
Microplate Shaker with 4-Place Platform	Thermo Fisher Scientific	88-861-023	to shake plates during incubation
Non-Tissue Culture-Treated Plate 96 well	Falcon (a Corning Brand)	351172	microplate for growth curve assay
Peptone yeast calcium (PYCa) agar	Homemade		1 g peptone 15 g yeast extract 15 g agar 990 mL dd H2O 4.5 mL 1 M CaCl2 2.5 mL 40% dextrose 1 mL 10 mg/mL cycloheximide
Peptone yeast calcium (PYCa) broth	Homemade, from Reference 16		1 g peptone 15 g yeast extract 990 mL dd H2O 4.5 ml 1 M CaCl2 2.5 mL 40% dextrose 1 mL 10 mg/mL cycloheximide
Peptone yeast calcium (PYCa) top agar	Homemade		1 g peptone 15 g yeast extract 4 g agar 990 mL dd H2O 4.5 mL 1M CaCl2 2.5 mL 40% dextrose
Petri plates	Thermo Fisher Scientific	FB0875713	for determination of bacterial concentration and phage titer assay
Phage Buffer	Homemade, from Reference 7		10 mL 1 M Tris, pH 7.5 10 mL 1 M MgSO4 4 g NaCl 980 ml dd H2O
R software	https://www.r-project.org/	version 4.3.0
Sterile Disposable PETG Flask Baffled Bottom w/Vented Closure	Thermo Fisher Scientific	4116-1000	for bacterial culture
Triton X-100	Sigma Aldrich	9036-19-5	for lid coating