Aktinobakteriyofaj enfeksiyonunu karakterize etmek için uyarlanmış optik yoğunluk tabanlı mikroplaka testi

Özet

Aktinomisetler ve diğer yavaş büyüyen bakteriler için uygun olan bakteriyofajların varlığında uzun süreli bakteri büyümesini ölçmek için optik yoğunluğa dayalı bir mikroplaka yöntemi tanımlanmıştır. Bu yöntem, buharlaşmayı ve kapak yoğuşmasını azaltmak için modifikasyonlar ve eğrinin altındaki alan, büyüme maksimumu ve göreceli virülans dahil olmak üzere virüs enfeksiyonu ölçümlerini hesaplamak için R kodunu içerir.

Özet

Bakteriyofajlar doğal ortamların önemli bir parçasıdır ve bakteri popülasyonlarını şekillendirmek için güçlü bir yeteneğe sahiptirler. Bireysel fajların aktinomisetler gibi yavaş büyüyen bakteri konakçılarıyla nasıl etkileşime girdiğini anlamak için, fajların varlığında uzun süreli bakteriyel büyümeyi ölçmek için kolay ve güvenilir bir yönteme ihtiyaç vardır. Spektrofotometrik mikroplaka okuyucular, yüksek verimli tekrarlanan ölçümlere izin verir, ancak küçük bir hacmi uzun süre inkübe etmek teknik zorluklar doğurabilir. Bu prosedür, 96 saat boyunca alt örnekleme yapmadan fajların ve bakterilerin birlikte kültürlenmesine izin vermek için standart bir 96 delikli mikroplakayı uyarlar ve bakteri büyümesi spektrofotometrik absorbans değerleri kullanılarak her 8 saatte bir kaydedilir. Bu optik yoğunluk değerleri, yüzde büyüme inhibisyonu, göreceli virülans ve Stacy-Ceballos indeksi dahil olmak üzere enfeksiyon ölçümlerini elde etmek için R kullanılarak analiz edilir. Burada özetlenen yöntemler, uzatılmış süreli mikroplaka büyüme eğrisi deneylerini yürütmek ve analiz etmek için etkili bir yol sağlar ve buharlaşmayı ve kapak yoğuşmasını azaltmak için modifikasyonlar içerir. Bu protokoller, yavaş büyüyen bakteri konakçıları ve bakteriyofajları arasındaki etkileşimlerin mikroplaka tabanlı tahlillerini kolaylaştırır.

Giriş

Bakteriyofajlar veya fajlar, bakterileri enfekte eden virüslerdir. Bunlar gezegen^1'deki en çok sayıda biyolojik varlıktır ve bakteriyofajların bakteriyel evrimi ve ekosistem süreçlerini etkilediği genel olarak kabul edilir ^2,3,4. Bakteriyofaj konakçı aralığı 8 ve enfeksiyon dinamiği^5,6'yı tanımlamak, ölçmek ve analiz etmek için, çift katmanlı agar yöntemi⁷ gibi agar tabanlı yöntemler ve optik yoğunluğa dayalı mikroplaka yöntemleri^8,9,10,11,12 dahil olmak üzere çeşitli yöntemler mevcuttur. Her yöntemin kendine özgü avantajları ve dezavantajları vardır. Verimlilikleri nedeniyle, çift katmanlı agar yöntemini kullanan kaplama testleri, konakçı aralığı testleri için "altın standart" tır, ancak bu yöntem zaman ve emek yoğun^9'dur. Sonuçları 24 saat veya daha kısa sürede döndüren hızlı mikroplaka yöntemleri, Escherichia coli 9,10,11,12 gibi hızlı büyüyen bakteri konakçıları için mükemmel sonuçlar verir, ancak aktinomisetler^7,13,14,15 gibi daha yavaş büyüyen bakteri konakçılarında bakteriyofaj enfeksiyonu ilerlemesini göstermek için çok kısadır.

Hızlı büyüyen bakteriler için tasarlanmış optik yoğunluğa dayalı bir mikroplaka testi, yavaş büyüyen bir konakçı bakterideki enfeksiyon dinamiklerini karakterize etmek için gereken birkaç gün boyunca, buharlaşma meydana gelmeden ve yapay olarak yüksek bakteri yoğunlukları vermeden çalıştırılamaz. Bu nedenle, yavaş büyüyen bakteri türleri için bakteriyofaj enfeksiyonu dinamikleri hakkında karşılaştırılabilir yüksek verimli veriler elde etmek, bu bakteriler için uyarlanmış özel teknikler gerektirir.

Burada sunulan mikroplaka yöntemi buharlaşmayı azaltır, böylece yavaş büyüyen bakterilerin 96 saatlik uzun bir süre boyunca bir fajla birlikte kültürlenmesine izin verir ve faj enfeksiyonu dinamikleri ve konakçı aralığı hakkında araştırmalar yapılmasını sağlar. Bu yöntem aynı zamanda farklı konakçı-virüs sistemleri arasında virülans karşılaştırmalarına izin veren optik yoğunluğa dayalı bir metrik olan Stacy-Ceballos indeks^16'yı da göstermektedir.

Protokol

Bu protokol Gordonia terrae için yazılmış olsa da, Gordonia lacunae, Gordonia rubripertincta ve Gordonia westfalica için de başarıyla kullanılmıştır.

1. Bakteri preparatı

1. Bir biyogüvenlik kabininde, Gordonia terrae CAG3'ün tek bir kolonisini, 0.01 mg / mL sikloheksimid içeren 200 mL pepton maya kalsiyum suyu 18 (PYCa) içeren 1 L steril şaşkın bir şişeye aşılamak için iyi mikrobiyolojik uygulama^17'yi kullanın (Malzeme Tablosuna bakınız).
2. Şişeyi 30 ° C'de, kültür doygunluğa ulaşana kadar veya 3 gün boyunca 250 rpm'de çalkalayarak inkübe edin⁷.
3. Doymuş G. terrae kültürünü PYCa suyunda seri olarak seyreltin ve PYCa plakaları 19,20 üzerindeki 10⁻⁴, 10−⁵ ve 10⁻⁶ seyreltmelerin her biri¹⁰⁰ μL yayılmış plaka ^19,20. Seyreltilmemiş doymuş kültürü 4 °C'de soğutun.
4. Yayılmış plakaları 30 ° C'de 3 gün boyunca ters çevrilmiş olarak inkübe edin.
5. Kuluçkadan sonra, 20-200 kolonili bir plaka olan "sayılabilir bir plaka" tanımlayın. Bu plakadaki koloni sayısını sayın ve mililitre başına koloni oluşturan birimleri hesaplayın (cfu / mL)^19,20.
6. Doymuş kültürü PYCa suyu ile 4.0 x 10⁶ cfu / mL bakteriye seyreltin.

2. Faj hazırlama

NOT: Bildirilen temsili sonuçlar, G. terrae üzerinde izole edilen ılıman bir bakteriyofaj olan Gordonia fajı DelRio²¹ ile elde edilmiştir. Bu yöntemler diğer Gordonia fajlarıyla da başarıyla kullanılmıştır.

1. İzole edilmiş bir bakteriyofajla başlayarak, faj örneğini faj tamponu^7'de seri olarak 1 x 10⁻⁸ seyreltmeye kadar seyreltin. Doymuş G. terrae kültürünün 0.3 mL'sini her faj seyreltmesinin 10 μL'si ile^{enfekte ederek çift} katmanlı bir agar faj titresi testi 7 gerçekleştirin. 5-10 dakikalık oda sıcaklığında bir inkübasyonun ardından, bakteri-faj karışımını 3 mL PYCa üst agar ile birleştirin ve PYCa agar plakalarına dökün.
2. 30 ° C'de ters çevrilmiş plakaları 3 gün boyunca veya plaklar⁷ oluşana kadar inkübe edin.
3. Kuluçkadan sonra, 20-200 plakalı bir plaka olan "sayılabilir bir plaka" tanımlayın. Bu plakadaki plak sayısını sayın ve mililitre başına plak oluşturan birimleri hesaplayın (pfu/mL)⁷.

3. Mikroplaka hazırlama

NOT: Bu yöntem için düz tabanlı 96 kuyucuklu mikroplakalar ( Malzeme Tablosuna bakınız) kullanılmalıdır. Tüm plaka hazırlama ve yükleme bir biyogüvenlik kabininde tamamlanmalı ve iyi mikrobiyolojik uygulama¹⁷kullanılmalıdır.

1. 100 μL Triton-X 100, 40 mL %100 izopropanol ve 160 mL deiyonize su^22'yi birleştirerek buğu önleyici kapak kaplama çözeltisini hazırlayın. Karıştırmak için karıştırın ve oda sıcaklığında saklayın.
2. Bir biyogüvenlik kabininde, steril 96 delikli bir mikroplaka kapağının iç yüzeyine 6 mL kapak kaplama çözeltisi ekleyin, kapağı kenarlarından tutun ve çözelti tarafından kaplandığından emin olmak için döndürün. Çözeltinin kapağın üzerine 20 saniye boyunca oturmasına izin verin, ardından çözeltiyi dökün ve kapağı otoklavlanmış bir kağıt havlu üzerinde, kapak tamamen kuruyana kadar bir açıyla ters çevirin, bu da tipik olarak 35-45 dakika sürer. Kapağı kenarlarından tutmaya dikkat edin.
3. Her 96 delikli mikroplaka için suda 20 mL% 0.1 agaroz hazırlayın, agarozu eritmek için mikrodalga fırınlayın.
4. Agaroz 50-60 ° C'ye soğuduktan sonra, plakanın kuyucukları ile 200 μL agaroz arasındaki tüm boşluklara %0,1 agarozun 100 μL'sini A sırası ve H satırı ve sütun 1, sütun 2, sütun 11 ve sütun 12^23'teki kuyucuklara pipet edin (Şekil 1).

4. Plakanın bakteri ve fajla yüklenmesi

NOT: Tüm plaka hazırlama ve yükleme işlemleri bir biyogüvenlik kabininde tamamlanmalı ve iyi mikrobiyolojik uygulama¹⁷ kullanılmalıdır.

1. 96 delikli plaka, her bir kuyucuk^9'da 75 μL 2.0 x 10⁶ cfu / mL bakteri içerecektir. 4.0 x 10 6 cfu/mL bakteri kültürü 1:1'i 2x PYCa suyu ile 2.0 x 10⁶ cfu/mL'ye seyreltin. 96 delikli plaka başına 5 mL hazırlayın.
2. Her biri 2.0 x 10⁶ pfu / mL, 2.0 x 10⁵ pfu / mL ve 2.0 x 10⁴ pfu / mL konsantrasyonlarında 1 mL yapmak için faj tamponu⁷ kullanarak faj lizatını seyreltin. Bu, mikroplaka⁹ içinde 1, 0.1 ve 0.01'lik bir enfeksiyon çokluğuna (MOI) izin verecektir.
3. Mikroplakayı yüklemek için, buğu önleyici çözelti ve agaroz ile hazırlanmış bir plaka alın ve Şekil 1'i takip eden 2.0 x 10⁶ cfu / mL bakterilerinin 75 μL'sini 3-10 numaralı sütunlara pipetin.
4. Sütun 3 ve sütun 4'e, Şekil 1'i izleyerek fajsız pozitif kontrol görevi görmesi için her bir kuyucuğa 75 μL steril faj tamponu ekleyin ve her eklemeden sonra karıştırmak için pipeti yukarı ve aşağı doğru çekin. Sütun 5 ve sütun 6'ya 2,0 x 10⁶ pfu/mL fajın 75 μL'sini, sütun 7 ve sütun 8'e 2,0 x 10⁵ pfu/mL fajın 75 μL'sini ve sütun 9 ve sütun 10'a 2,0 x 10^{4 pfu} /mL fajın 75 μL'sini ekleyin ve her eklemeden sonra karıştırmak için yukarı ve aşağı pipetleyin.
5. Gaz değişimine izin verirken plakayı kısmen kapatmak için plakanın her iki kısa tarafını etiketleme bandında 0,5 ile bantlayın.

5. Kuluçka ve absorbans ölçümü

1. Plakalar bakteri ve fajla yüklendikten sonra, bunları 250 rpm'de bir mikroplaka çalkalayıcıya yerleştirin ve 30 ° C'de inkübe edin.
2. Plakaları 96 saat boyunca inkübe edin, saat 16'dan başlayarak her 8 saatte bir mikroplaka okuyucuda 600 nm'de optik yoğunluk ölçümü yapın. Plakaları ölçümler arasında çalkalayıcıya geri döndürün.
   NOT: Saat 0'dan başlayarak 4, h 6 saat, 8 saat ve 12 saatlik ölçüm periyotları değerlendirilmiş ve enfeksiyon sonrası 16 saatte başlayan 8 saatlik bir örnekleme periyodunun Gordonia-faj etkileşimlerini en iyi şekilde yakaladığı belirlenmiştir.
3. Deney boyunca kapağı yoğuşma açısından izleyin. Yoğuşma gözlenirse, kapağı adım 3.2'ye göre kaplanmış başka bir kapakla değiştirin.
4. Protokol bölüm 6'yı izleyerek kontrol ve enfekte büyüme eğrileri oluşturun.

6. Veri analizi

1. Stacy-Ceballos-Index GitHub deposundaki (https://github.com/eichristenson/Stacy-Ceballos-Index) elektronik tablo düzenini izleyerek her faj seyreltmesinin ortalama ve standart sapmasını hesaplamak için bir elektronik tablo programı kullanın.
2. DescTools²⁴, dplyr 25, ggplot2 26 ve readxl²⁷ paketleriyle ve Stacy-Ceballos-Index GitHub deposundaki (https://github.com/eichristenson/Stacy-Ceballos-Index) R betiğini izleyerek kontrol ve virüslü büyüme eğrileri oluşturun ve R kullanarak (Malzeme Tablosuna bakın) enfeksiyon ölçümlerini hesaplayın.
   1. AUC_con , enfekte olmamış kontrol eğrisinin altındaki alandır, AUC_inf ise enfekte eğri^16'nın altındaki alandır. AUC'yi hesaplayın ve ardından aşağıdaki denklemi kullanarak PI_AUC¹⁶ eğri değerleri altındaki alana göre yüzde büyüme inhibisyonunu hesaplayın:
      (1 - [AUC_inf/AUC_con]) × 100
   2. Her eğrideki kesikli yatay çizgiler, enfekte olmayan büyüme zirvesi N_{asimptote (con} ) ve enfekte büyüme zirvesi N_{asimptote (inf} ) etiketli olarak tepe büyümesini gösterir. N_asimptot değerlerini tanımlayın ve ardından aşağıdaki denklemi kullanarak bu tepe büyüme değerlerine (PI_max¹⁶) dayanarak yüzde büyüme inhibisyonunu hesaplayın:
      (1 - [N asimptote(inf)/ N_{asimptote(con})]₎ × 100
   3. PI_AUC ve PI_max değerlerinden Stacy-Ceballos endeksi I_SC^16'yı aşağıdaki gibi hesaplayın:
      (PI_AUC × PI_maks.) ^0.5
      Stacy-Ceballos endeksini zaman içinde entegre ederek göreceli virülansı hesaplayın¹⁶.

Tartışmalar

Bu optik yoğunluğa dayalı mikroplaka yöntemi, bakteriyofaj konakçı aralığı ve enfeksiyon dinamikleri^11'in araştırılmasına izin verir ve Stacy-Ceballos indeksi^16'nın bakteriyofaj virülansının bir ölçüsü olarak faydasını gösterir. Bu yöntem herhangi bir bakteriyofaj-konakçı sistemi ile kullanılabilirken, aktinomisetler gibi daha yavaş büyüyen bakterilerle kullanım için^hızlı mikroplaka büyüme tahlilleri ^9,10,11'i uyarlamak için özel olarak tasarlanmıştır. Hızlı mikroplaka analizleri, buharlaşma ve kapak yoğuşmasını ele almak için modifikasyonlar yapılmadan yavaş büyüyen bakteriler için kullanılamaz. Bu yöntem, bu gerekli modifikasyonları açıklar ve ilk kez, bakteriyofaj enfeksiyonunu tanımlamak için Stacy-Ceballos indeksinin ve ilgili metriklerin¹⁶ kullanımını gösterir.

Evaporasyon, çok günlük 96 kuyucuklu plaka büyüme eğrisi tahlillerinde önemli bir zorluk olabilir; Bu yöntem, sınır kuyularına ve kuyular arasındaki boşluklara agaroz ekleyerek bu sorunu çözer. Agaroz marjı, buğu önleyici kapak işlemi²² ile birleştiğinde, mikroplaka içinde gerekli nemi sağlar ve güvenilir optik yoğunluk ölçümlerine izin verir. Eklenen nem olmadan, gerekli uzun inkübasyon süresi boyunca önemli kenar etkisi buharlaşması²³ meydana gelir ve yapay olarak yüksek optik yoğunluklu okumalara yol açar. Buğu önleyici kapak işlemi gerekli bir modifikasyondur, çünkü kapak yoğuşması optik yoğunluk değerlerini yapay olarak da yükseltebilir. Kuluçka döneminde plakaların çalkalanması, aktinomisit bakterileri büyüme sırasında kümelenebileceğinden, yapay olarak yüksek optik yoğunluk değerleri verebileceğinden ve enfeksiyonun çokluğunu etkili bir şekilde azaltabileceğinden, önerilen bir modifikasyondur.

Enfeksiyon dinamiklerini karakterize eden deneylerde bakterilerin fajlara oranı kritiktir, çünkü bir enfeksiyon etkisi göstermek için yeterli faj olması gerekir, ancak konakçı bakteri popülasyonunun hemen^9'a çarpması veya lizojen sıklığının çarpıcı bir şekilde artması²⁸ kadar fazla değildir. Bu yöntemde, tutarlı sonuçlar elde etmek için en etkili olduğu tespit edilen oran 1'lik bir MOI idi, ancak 0.1 ve 0.01'lik MOI'lerle de kullanılabilir sonuçlar elde edildi. Bu yöntemi uygularken, bir bakteri konsantrasyonu seçmeniz ve 0.01-1 ^9,10,11 MOI aralığında çoklu faj konsantrasyonlarının test edilmesi önerilir.

Burada açıklanan bu teknik, bakteriyofaj-konakçı etkileşimlerinin, her ölçüm aralığında daha büyük bir kültür şişesinden alt örnekleme yerine, yüksek verimli mikroplaka tahlillerinde yavaş büyüyen bakteriler için değerlendirilmesine izin verir²⁹. Ayrıca, mikroplaka büyüme tahlilleri 9,10,11'in nasıl uyarlanabileceğini göstererek, bu teknik, faj karakterizasyonu 5,6,12 ve evrim çalışmaları ^30,31 dahil olmak üzere daha yavaş büyüyen bakteriler için diğer mikroplaka bazlı bakteriyofaj tahlillerinin faydasını arttırmaktadır. Son olarak, bu yöntem bakteriyofaj enfeksiyonunu tanımlamak için Stacy-Ceballos indeks^16'nın kullanımını göstermektedir. Bu metrik başlangıçta bir arkeal virüs modeli sisteminden elde edilen verilerle geliştirilmiştir ve optik yoğunluk değerlerinden hesaplanmıştır, böylece farklı virüs sistemlerinde yaygın bir fayda sağlamıştır.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agarose	Omni-Pur	2090	for filling border wells of microplate
Costar 96 Well Lid Low Evaporation Corner Notch	Corning	3931	replacement microplate lid
Isopropanol	Fisher Chemical	A461-4	for lid coating
Microplate reader	Tecan Spark 20M
Microplate Shaker with 4-Place Platform	Thermo Fisher Scientific	88-861-023	to shake plates during incubation
Non-Tissue Culture-Treated Plate 96 well	Falcon (a Corning Brand)	351172	microplate for growth curve assay
Peptone yeast calcium (PYCa) agar	Homemade		1 g peptone 15 g yeast extract 15 g agar 990 mL dd H2O 4.5 mL 1 M CaCl2 2.5 mL 40% dextrose 1 mL 10 mg/mL cycloheximide
Peptone yeast calcium (PYCa) broth	Homemade, from Reference 16		1 g peptone 15 g yeast extract 990 mL dd H2O 4.5 ml 1 M CaCl2 2.5 mL 40% dextrose 1 mL 10 mg/mL cycloheximide
Peptone yeast calcium (PYCa) top agar	Homemade		1 g peptone 15 g yeast extract 4 g agar 990 mL dd H2O 4.5 mL 1M CaCl2 2.5 mL 40% dextrose
Petri plates	Thermo Fisher Scientific	FB0875713	for determination of bacterial concentration and phage titer assay
Phage Buffer	Homemade, from Reference 7		10 mL 1 M Tris, pH 7.5 10 mL 1 M MgSO4 4 g NaCl 980 ml dd H2O
R software	https://www.r-project.org/	version 4.3.0
Sterile Disposable PETG Flask Baffled Bottom w/Vented Closure	Thermo Fisher Scientific	4116-1000	for bacterial culture
Triton X-100	Sigma Aldrich	9036-19-5	for lid coating