Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

سير عمل تحليلي يعتمد على الكروماتوغرافيا السائلة ، ومطياف حركة الأيونات المحاصرة ، وقياس الطيف الكتلي لوقت الرحلة (LC-TIMS-ToF MS / MS) للحصول على ثقة عالية وتحليل "من أسفل إلى أعلى" قابل للتكرار للغاية لتعديلات الهستون وتحديد الهوية بناء على المعلمات الرئيسية (وقت الاحتفاظ [RT] ، المقطع العرضي للتصادم [CCS] ، ونسبة الكتلة إلى الشحنة الدقيقة [m / z]).

Abstract

بروتينات هيستون وفيرة للغاية ومحفوظة بين حقيقيات النوى وتلعب دورا كبيرا في تنظيم الجينات نتيجة للهياكل المعروفة باسم تعديلات ما بعد الترجمة (PTMs). إن تحديد موضع وطبيعة كل PTM أو نمط من PTMs بالإشارة إلى العوامل الخارجية أو الوراثية يسمح بربط هذه المعلومات إحصائيا بالاستجابات البيولوجية مثل نسخ الحمض النووي أو التكرار أو الإصلاح. في العمل الحالي ، تم وصف بروتوكول تحليلي عالي الإنتاجية للكشف عن PTMs هيستون من العينات البيولوجية. يتيح استخدام الكروماتوغرافيا السائلة التكميلية ، ومطياف الحركة الأيونية المحاصرة ، وقياس الطيف الكتلي لوقت الرحلة (LC-TIMS-ToF MS / MS) فصل وتعيين PTM للتعديلات الأكثر صلة بيولوجيا في تحليل واحد. يستفيد النهج الموصوف من التطورات الأخيرة في الحصول على البيانات التابعة (DDA) باستخدام التراكم المتوازي في فخ التنقل ، يليه التجزئة المتسلسلة والتفكك الناجم عن الاصطدام. يتم تعيين Histone PTMs بثقة بناء على وقت الاحتفاظ والتنقل ونمط التجزئة.

Introduction

في الخلايا الحقيقية النوى، يحزم الحمض النووي (DNA) في صورة كروماتين في صورة كروماتين في وحدات وظيفية تسمى النيوكليوسومات. تتكون هذه الوحدات من ثماني من أربعة هيستون أساسية (اثنان من كل من H2A و H2B و H3 و H4) 1،2،3،4. تعد الهستونات من بين البروتينات الأكثر وفرة وحفظا في حقيقيات النوى ، والتي تكون مسؤولة إلى حد كبير عن تنظيم الجينات5. تلعب تعديلات هيستون بعد الترجمة (PTMs) دورا كبيرا في تنظيم ديناميكيات الكروماتين وتلاعب العمليات البيولوجية المختلفة مثل نسخ الحمض النووي والنسخ المتماثل والإصلاح6. تحدث PTMs بشكل أساسي على السطح الذي يمكن الوصول إليه للمناطق الطرفية N من الهستونات التي تتلامس مع DNA 3,7. ومع ذلك ، تؤثر تعديلات الذيل واللب على بنية الكروماتين ، وتغيير التفاعلات بين النوكليوسوم وتجنيد بروتينات معينة 3,8.

يتمثل التحدي الحالي خلال البروتيوميات القائمة على قياس الطيف الكتلي للكروماتوغرافيا السائلة (LC-MS) في الشطف المشترك المحتمل للتحليلات ذات الأهمية. وفي حالة التحليلات المعتمدة على البيانات، يترجم ذلك إلى فقدان محتمل للعديد من أيونات السلائف أثناء عملية اقتناء MS/MS 9. تكتسب أجهزة وقت الطيران (ToF) أطيافا بتردد عال جدا 9,10 (حتى عشرات kHz)11 ؛ وهذا يجعلها قادرة على المسح السريع لإجمالي أيونات السلائف داخل عينة معقدة (MS1) ، مما يعد بالحساسية المثلى ومعدلات تسلسل MS / MS (حتى 100 هرتز)9 ويجعلها مثالية لتحليل العينات البيولوجية10. ومع ذلك ، فإن الحساسية المتاحة في معدلات الفحص العالية هذه محدودة بمعدل MS / MS9. تم استخدام إضافة مطياف الحركة الأيونية المحبوسة (TIMS) بالاقتران مع مطياف الكتلة المتعامد رباعي الأقطاب (qToF) للتخفيف من هذه القيود. في TIMS ، تتراكم جميع أيونات السلائف جنبا إلى جنب ويتم استخلاصها كدالة لحركتها ، بدلا من اختيار كتل سليفة مفردة ذات رباعيالقطب 9. يسمح التراكم المتوازي - التجزئة التسلسلية (PASEF) بمئات أحداث MS / MS في الثانية دون أي فقدان للحساسية9.

كان الهدف الرئيسي من هذا العمل هو إظهار التطورات الأخيرة ل DDA باستخدام التراكم المتوازي في فخ التنقل الذي يتبعه التجزئة المتتالية والتفكك الناجم عن الاصطدام (CID). تم تعيين Histone PTMs بثقة بناء على أوقات الاحتفاظ (RTs) ، والتنقلات ، وأنماط التجزئة.

Protocol

ملاحظة: تم استخراج عينات هيستون باستخدام طريقة مقتبسة من Bhanu et al. (2020) 12.

1. إعداد العينة

  1. حصاد الخلايا المستزرعة
    1. عندما تكون الخلايا متقاربة بنسبة 80٪ ، تأكد من أنها قابلة للحياة باستخدام استبعاد التريبان الأزرق.
      ملاحظة: تم استخدام خط خلايا HeLa S3 لهذه التجارب ، ولكن يمكن تطبيق هذه الطريقة على أي خلايا مستزرعة.
    2. نضح الوسائط ، ثم ضع 5 مل من 1x محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) على كل لوحة.
    3. قم بتدوير اللوحة (اللوحات) لشطف جميع الوسائط المتبقية ، ثم قم بشفط PBS وتطبيق 5 مل من 1x PBS.
    4. افصل الخلايا برفق عن اللوحة عن طريق كشطها باستخدام رافع خلية يمكن التخلص منه.
    5. انقل كل تعليق خلية إلى أنبوب مخروطي سعة 15 مل.
    6. بيليه الخلايا عن طريق الطرد المركزي في 800 × غرام لمدة 5 دقائق.
    7. نضح برنامج تلفزيوني من بيليه الخلية.
    8. انتقل إلى استخراج هيستون.
      ملاحظة: قم بتجميد حبيبات الخلية في النيتروجين السائل إذا تعذر معالجتها على الفور. قم بتخزين الكريات في درجة حرارة -80 درجة مئوية حتى تصبح جاهزة للمتابعة.
  2. استخراج هيستون
    1. تقدير حجم كل بيليه الخلية ووضع علامة على الغضروف المفصلي مع علامة دائمة.
    2. تحضير ما يكفي من عازلة العزل النووي (NIB ؛ 15 mM Tris-HCl (درجة الحموضة 7.5) ، 15 mM NaCl ، 60 mM KCl ، 5 mM MgCl2 ، 1 mM CaCl2 ، و 250 mM السكروز) لجميع العينات. بدلا من ذلك ، إذا كانت هناك حاجة إلى معالجة العديد من العينات بمرور الوقت ، فقم بعمل المخزن المؤقت بكميات كبيرة وتخزينه في درجة حرارة 2-8 درجة مئوية لمدة تصل إلى 6 أشهر ، أو قم بتجميد القسمة وتجميدها عند -15 درجة مئوية إلى -25 درجة مئوية إلى أجل غير مسمى عن طريق إذابة الكمية اللازمة فقط لكل عملية استخراج.
      ملاحظة: يجب أن يظل المخزن المؤقت واضحا أثناء التخزين. إذا اتخذ المخزن المؤقت مظهرا غائما أو غير طبيعي في أي وقت ، فتخلص من المخزن المؤقت الجديد وقم بإعداده.
    3. تحضير 50 ضعف حجم كريات الخلية من العازلة للغسيل وإضافة مثبطات على النحو التالي (حوالي 10 مل من العازلة للغسيل لكل 2 عينات).
      1. لتحضير 10 مل من محلول الغسيل ، امزج 10 مل من NIB ، 30 ميكرولتر من 200 mM 4- (2-aminoethyl) بنزين سلفونيل فلوريد هيدروكلوريد [AEBSF] ، 10 ميكرولتر من 1 M dithiothreitol [DTT] ، 20 ميكرولتر من 5 ميكروسيستين ميكرومتر ، 20 ميكرولتر من 5 M زبدات الصوديوم.
    4. قم بإزالة 1/5 من المخزن المؤقت للغسيل لتحضير المخزن المؤقت للتحلل (حجم 1/5 من المخزن المؤقت للغسيل ، 0.3٪ NP-40 أو بديل NP-40).
      ملاحظة: لا تستخدم Triton-X 100 بدلا من بديل NP-40 أو NP-40 ، لأنه قد يكون كاشطا جدا لأنواع معينة من الخلايا.
    5. اغسل حبيبات الخلية جيدا عن طريق تعليقها في 5 أعمدة من المخزن المؤقت للغسيل والطرد المركزي عند 800 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. أكمل هذه الخطوة مرتين ، مع شفط والتخلص من المادة الطافية بين الغسلات.
    6. تأكد من أن حجم حبيبات الخلية لا يزال مميزا بعلامة دائمة. إعادة التعليق في 10 مجلدات من المخزن المؤقت للتحلل.
    7. اخلطي كل حبة جيدا لإنعاشها ، ثم احتضانها لمدة 15 دقيقة على الثلج.
    8. بعد 15 دقيقة ، أجهزة الطرد المركزي عند 800 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
    9. نضح وتجاهل طاف.
      ملاحظة: يجب أن تقلل الحبيبات إلى ≤ 1/2 حجم الحبيبات الأصلي (كما هو موضح بخط العلامة). إذا لم تنخفض الحبيبات بشكل كاف ، كرر إجراء التحلل وقم بتضمين خطوة تجانس لطيفة باستخدام مدقة لفتح الخلايا.
    10. بمجرد اكتمال التحلل ، أعد تعليق الحبيبات في 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت للغسيل ، ثم الطرد المركزي عند 800 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. نضح وتخلص من المادة الطافية ، ثم كرر خطوة الغسيل مرة أخرى لإزالة جميع آثار NP-40.
      ملاحظة: في هذه المرحلة ، تتكون الحبيبات من الكروماتين الذي يحتوي على هستونات.
    11. أعد تعليق الحبيبات في 5 مجلدات (من حجم حبيبات الخلية الأصلي) من 0.4 N H2SO4.
    12. احتضان لمدة 2 ساعة في غرفة باردة أو ثلاجة باستخدام المحرض.
    13. بعد 2 ساعة ، قم بطرد مركزي للعينة (العينات) عند 3400 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. لا تتخلص من المادة الطافية.
    14. نقل المادة الطافية إلى أنابيب جديدة ، ورفع حمض ثلاثي كلورو الخليك بنسبة 100٪ (TCA) إلى 1/3 حجم المحتويات (سيكون تركيز TCA النهائي حوالي 20٪).
    15. اقلب الأنبوب برفق ولاحظ أن المحلول الصافي عديم اللون يتحول إلى اللون الأبيض و / أو الغائم ، مما يشير إلى ترسيب البروتين.
      ملاحظة: بالنسبة للمحاليل ذات تركيزات الهستون المنخفضة ، قد لا يكون ترسيب البروتين ملحوظا على الفور ، ولكن يجب أن يكون الراسب مرئيا بعد الحضانة طوال الليل.
    16. احتضان دون اضطراب بين عشية وضحاها (12-18 ساعة) عند 4 درجات مئوية لترسيب بروتينات الهستون تماما.
    17. في اليوم التالي ، أجهزة الطرد المركزي عند 3400 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
    18. نضح الطافع ، مع الحرص على عدم لمس جوانب الأنبوب بطرف الماصة. في هذه المرحلة ، يتم ترسيب الهستونات بشكل أساسي كفيلم حول جوانب الأنبوب (الأنابيب).
    19. أضف 500 ميكرولتر من الأسيتون المثلج + 0.1٪ حمض الهيدروكلوريك (الأسيتون الحمضي) إلى كل أنبوب ، باستخدام ماصة باستور الزجاجية ، ثم اقلب الأنبوب (الأنابيب) برفق عدة مرات. رتب العينات بالترتيب (1 ، 2 ، 3 ، إلخ) أثناء القيام بذلك ، لأن أي أسيتون خاطئ قد يزيل العلامات الموجودة على الأنابيب. جهاز طرد مركزي عند 3400 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية وصب المادة الطافية برفق.
    20. كرر خطوة الشطف هذه مع 500 ميكرولتر من الأسيتون المثلج 100٪ ، أيضا باستخدام ماصة باستور زجاجية. جهاز طرد مركزي عند 3400 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية وصب المادة الطافية برفق.
    21. اترك الأنابيب مفتوحة لتجف في درجة حرارة الغرفة حتى يتبخر الأسيتون المتبقي.
    22. عندما تجف ، أضف 100 ميكرولتر من ماء قياس الطيف الكتلي (MS) إلى كل أنبوب. استخدم هذه القطرة لمسح جميع جوانب الحاوية لإعادة تعليق فيلم هيستون بالكامل. افعل ذلك عن طريق سحب القطرة على جانب الأنبوب وتدويرها أثناء السحب لأعلى ولأسفل أو توزيع نصف 100 ميكرولتر واستخدام الطرف لتحريكها في كل مكان. مزيج من كلتا الطريقتين يعمل بشكل أفضل. الهستونات قابلة للذوبان في الماء بسهولة وستكون في المحلول.
    23. بعد تعليق جميع العينات ، إذا كان هناك أي مادة صلبة بيضاء متبقية ، صوتنة في الحمام في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق.
    24. أجهزة الطرد المركزي عند 800 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. نقل الحل واضحة إلى أنابيب جديدة. تخلص من أي حبيبات غير قابلة للذوبان متبقية.
    25. قم بتشغيل SDS-PAGE تحت ظروف التقليل للتحقق من أن الاستخراج نظيف.
      ملاحظة: يمكن تشغيل المواد الهلامية باستخدام أي تركيز مناسب من بولي أكريلاميد طالما أنه يمكن أن يميز البروتينات في حدود 10-20 كيلو دالتون. انظر جدول المواد للمواد الهلامية المستخدمة في هذا البروتوكول.
    26. قم بإجراء فحص تركيز البروتين (أي برادفورد أو BCA) لتحديد تركيز البروتين الكلي.
  3. الاشتقاق الكيميائي (البروبيونيلاتيون) لبقايا اللايسين
    1. نقل 20 ميكروغرام من الهستونات (يحددها فحص البروتين) إلى أنبوب نظيف. جفف هذه العينة إلى <5 ميكرولتر باستخدام مكثف فراغ ، ثم أعد التعليق باستخدام 20 ميكرولتر من بيكربونات الأمونيوم 100 مللي متر (NH4CO3) (~ 1 ميكروغرام / ميكرولتر محلول). اضبط الرقم الهيدروجيني على ~ 8 باستخدام هيدروكسيد الأمونيوم إذا لزم الأمر.
      تنبيه: لا تستخدم هيدروكسيد الأمونيوم (NH4OH) للإنعاش ، فقط لضبط درجة الحموضة إذا لزم الأمر. خلاف ذلك ، سوف تتشوه البروتينات وتترسب.
      ملاحظة: للتحقق من الرقم الهيدروجيني بأقل قدر من فقدان العينة، استخدم طرف ماصة للغمس في العينة وربت على شريط الأس الهيدروجيني. سيكون إجراء الاختبار هذا مفيدا خلال خطوات تحضير العينة المتبقية.
    2. تحضير كاشف البروبيونيلات عن طريق إضافة أنهيدريد البروبيونيك إلى الأسيتونيتريل (ACN) بنسبة 1: 3 (v / v) (أي لصنع 40 ميكرولتر من الكاشف ، اجمع 10 ميكرولتر من أنهيدريد البروبيونيك مع 30 ميكرولتر من ACN).
      ملاحظة: تقليديا ، تم استخدام الميثانول أو الأيزوبروبانول في تحضير كاشف البروبيونيل. وبما أن البروبيونيلات تفاعل لتكوين أميد، يلزم وجود مذيب غير بروتوني، مثل الأسيتونيتريل، لمنع المنتجات الجانبية والتفاعلات غير المرغوب فيها، مثل إستر ميثيل بروبيونيل، الذي ينتج عن استخدام الميثانول. قم فقط بإعداد ما يكفي من كاشف البروبيونيلات لما يصل إلى 4 عينات في المرة الواحدة حتى يظل الكاشف طازجا. استخدم الكاشف في غضون 1-2 دقيقة من التحضير. أثناء وضع الكاشف ، سيتفاعل أنهيدريد البروبيونيك مع أي رطوبة محيطة ، وسيبدأ حمض الأسيتيك في التكون ، مما قد يغير فعالية الكاشف وسيغير الرقم الهيدروجيني لمحلول الهستون بمجرد إضافة الكاشف.
    3. أضف كاشف البروبيونيلات إلى كل عينة في 1: 4 (v / v) (أي ، ل 20 ميكرولتر من الهستونات ، أضف 5 ميكرولتر من كاشف البروبيونيل).
    4. أضف بسرعة 1: 5 (v / v) NH4OH (أي أضف 4 ميكرولتر مقابل 20 ميكرولتر من محلول هيستون) لإعادة إنشاء الرقم الهيدروجيني للمحلول إلى ~ 8. إذا كان الرقم الهيدروجيني لا يزال منخفضا جدا ، أضف 1-2 ميكرولتر من NH4OH في المرة الواحدة حتى يتم تحقيق درجة الحموضة 8. عادة ما تكون نسبة 1: 5 (v / v) كافية.
    5. احتضان العينات في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة دون إزعاج.
    6. كرر تفاعل البروبيونيلات لما لا يزيد عن 3-4 عينات لكل دفعة من كاشف البروبيونيلات لضمان الحد الأدنى من تكوين الحمض.
    7. كرر خطوات إجراء البروبيونيلات 1.3.2-1.3.5. تضمن الجولة الثانية من البروبيونيلات اشتقاق >95٪ من اللايسينات المتاحة.
    8. جفف العينات حتى <5 ميكرولتر باستخدام مكثف فراغ. سيؤدي ذلك إلى تبخر أي كاشف بروبيونيل غير متفاعل ، ومنتجات حمضية ، وغاز الأمونيا المنطلق من NH4OH. إذا جفت العينات تماما ، فلا بأس بذلك ، حيث لا تحدث خسائر كبيرة في العينة.
      ملاحظة: قم بإزاحة الهواء في زجاجة أنهيدريد البروبيونيك بغاز الأرجون قبل التخزين لمنع تكوين حمض الأسيتيك بسبب ملامسته للرطوبة المحيطة المتبقية في الزجاجة.
  4. الهضم المحلل للبروتين مع التربسين
    1. أعد تعليق الهستونات في 100 mM NH4HCO3 لتحقيق حجم 20 ميكرولتر ، وتحقيق تركيز مثالي يبلغ 1 ميكروغرام / ميكرولتر.
      ملاحظة: ستؤدي محاليل العينات ذات التركيزات الأقل من 1 ميكروغرام / ميكرولتر إلى انخفاض كفاءة التربسين.
    2. أضف التربسين إلى عينات الهستون بنسبة 1:10 (بالوزن / الوزن) (أي أضف 2 ميكرولتر من محلول 1 ميكروغرام / ميكرولتر من التربسين إلى 20 ميكروغرام من الهستونات).
    3. احتضان ردود الفعل عند 37 درجة مئوية لمدة 6-8 ساعات. بدلا من ذلك ، احتضان بين عشية وضحاها (12-18 ساعة) في درجة حرارة الغرفة.
    4. أوقف عملية الهضم عن طريق التجميد عند -80 درجة مئوية لمدة 1 ساعة على الأقل.
      ملاحظة: لا تستخدم الحمض لإخماد تفاعل الهضم ، لأن هذا سيؤدي إلى انخفاض غير مرغوب فيه في درجة الحموضة في هذه المرحلة من الإجراء. يمكن تخزين العينة عند -80 درجة مئوية حتى تصبح جاهزة للمتابعة (نقطة التوقف المؤقتة).
  5. الاشتقاق الكيميائي (البروبيونيل) لأطراف الببتيد N
    1. جفف العينات إلى <5 ميكرولتر باستخدام مكثف فراغ.
    2. أعد تعليق العينات حتى 20 ميكرولتر (1 ميكروغرام / ميكرولتر) باستخدام 100 mM NH4HCO3.
    3. كرر البروبيونيلات كما كان من قبل (الخطوة 1.3).
      ملاحظة: من الطبيعي أن تستغرق العينات وقتا أطول لتجف في هذه الخطوة بسبب ارتفاع نسبة الطور العضوي: المائي.
  6. عينة تحلية مع نصائح المرحلة
    1. أعد تعليق أو تخفيف العينات باستخدام 50 ميكرولتر من الماء بدرجة MS + 0.1٪ TFA.
    2. باستخدام آلة حفر العينات 11-G ، قم بثقب 5 أقراص من مادة C18 من قرص استخراج الطور الصلب (قم بثقب جميع الأقراص الخمسة قبل نقلها إلى طرف الماصة). أدخل الأقراص وتأكد من تثبيتها بشكل آمن ومتساو في الجزء السفلي من طرف ماصة سعة 200 ميكرولتر (الشكل 1).
      ملاحظة: استخدم 15-G corer في حالة تحلية أكثر من 25 ميكروغرام من العينة من خلال طرف مرحلة واحد.
    3. استخدم محول طرد مركزي لتثبيت أطراف المسرح في مكانها في أنابيب الطرد المركزي الدقيقة 1.5 مل أو 2 مل.
      ملاحظة: بالنسبة لخطوات الطرد المركزي التالية ، استخدم ثورة بطيئة (400-500 × جم) عند 4 درجات مئوية ، لمدة 1-2 دقيقة في المرة الواحدة ؛ تمر المذيبات عادة عبر الراتنج في أقل من 1 دقيقة ، اعتمادا على مدى إحكام تعبئة مادة C18 في الأطراف.
    4. شطف الراتنج عن طريق الطرد المركزي مع 50 ميكرولتر من 100٪ أسيتونيتريل لتنشيط مادة C18 وإزالة الملوثات المحتملة.
      ملاحظة: قد يكون من الأسهل تحميل المحاليل على أطراف المرحلة باستخدام أطراف ماصة تحميل الهلام. بمجرد تنشيط مادة C18 ، من المهم عدم السماح للراتنج بالجفاف طوال مدة إجراء التحلية.
    5. موازنة مادة القرص مع 80 ميكرولتر من الماء بدرجة MS + 0.1٪ TFA عن طريق الطرد المركزي.
    6. تحمض العينة إلى درجة الحموضة 4 أو أقل باستخدام حمض الخليك الجليدي. تحقق من درجة الحموضة باستخدام شرائط الأس الهيدروجيني كما كان من قبل لتقليل فقد العينة.
    7. قم بتحميل العينة بأكملها على قرص الراتنج عن طريق الطرد المركزي البطيء.
    8. اغسل العينة ب 80 ميكرولتر من الماء بدرجة MS + 0.1٪ TFA عن طريق الطرد المركزي.
    9. قم بسحب العينة في أنبوب نظيف سعة 1.5 مل عن طريق شطف 70 ميكرولتر من 75٪ أسيتونيتريل و 0.5٪ حمض الخليك عن طريق الطرد المركزي البطيء. يمكن استخدام وقت إضافي للطرد المركزي لضمان استخلاص حجم العينة الكامل من طرف المرحلة. لا بأس إذا جف الراتنج مع وقت الطرد المركزي الإضافي ، حيث لم تعد هناك حاجة إليه بعد شطف العينة.
    10. جفف كل عينة تماما في مكثف فراغ.
      ملاحظة: يمكن تخزين العينة (العينات) عند -80 درجة مئوية حتى تصبح جاهزة للمتابعة (نقطة التوقف المؤقتة).
    11. لتحليل LC-MS / MS ، أعد تكوين العينات في حجم المذيب A (0.1٪ حمض الفورميك) من بروتوكول الكروماتوغرافيا السائلة (LC) الذي يعطي التركيز النهائي البالغ 0.4 ميكروغرام / ميكرولتر (أي إذابة 20 ميكروغرام من الهستونات في 50 ميكرولتر من المذيب أ).

2. واجهة برنامج TIMS

  1. حدد علامة التبويب الأداة وانتقل إلى تشغيل (تحقق من تمييز اسم الأداة باللون الأخضر) (الشكل 2).
  2. تحقق من معلمات TIMS (الشكل 2).
  3. تحقق من إعدادات MS (بدء المسح ، نهاية المسح ، قطبية الأيونات ، وضع المسح) (الشكل 2).
  4. تحقق من إعدادات TIMS (الوضع ، بدء التنقل ، نهاية التنقل ، وقت المنحدر ، وقت التراكم ، دورة العمل ، معدل المنحدر ، معدل MS ، متوسط MS ، والمعايرة التلقائية) (الشكل 2).
  5. انتقل إلى علامة التبويب المصدر وقم بتنشيط خيار الحقنة (Hamilton 500 μL) فقط لخطوة معايرة TuneMix (الشكل 3)13.
  6. انتقل إلى علامة التبويب المعايرة ، وانقر فوق m / z ، وحدد وضع المعايرة ، واختر الوضع (Q المحسن ، بشكل عام) ، والتكبير (+ 0.01٪) STD Dev (0.24) ، وانقر فوق معايرة ؛ عند تحقيق درجة 100٪ ، اقبل (الشكل 4).
  7. انتقل إلى علامة تبويب التنقل وكرر عملية المعايرة (الوضع الخطي ، بشكل عام) ، نطاق الكشف (+5٪) ، العرض (0.1 Da) ، STD Dev (0.1855) ، ثم انقر فوق معايرة ؛ عندما تحصل على درجة ≥ 98.5٪ ، تقبل (الشكل 5).
  8. انتقل إلى الطريقة وحدد الطريقة المراد استخدامها ؛ على سبيل المثال ، تم اختيار Proteomic_ / 2023-01-19-CF / 20230119-Hela Control histone_prep_pasefDIA_1-24_1_451.d / 451.m-TimsControl (الشكل 5).

3. LC-TIMS-PASEF-TOF MS / MS

  1. استخدم ظروف تشغيل nESI النموذجية: جهد شعري 4500 فولت ، إزاحة لوحة طرفية 800 فولت ، ضغط رذاذات 3.0 بار ، غاز جاف 10.0 لتر / دقيقة ، سخان جاف 200 درجة مئوية ، ومعدل تدفق حقن 50 ميكرولتر / دقيقة.
  2. استخدم إعدادات MS النموذجية: طاقة تصادم 6 فولت ، 1200 فولت RF تصادم ، وقت نقل 75 ميكرو ثانية ، تخزين نبضي 5 ميكرو ثانية.
  3. حدد تدفق غاز الانجراف باستخدام فرق الضغط من قمع المدخل P1 وقمع الخروج P2. يحدث التراكم المتوازي - التجزئة التسلسلية (PASEF) في خلية TIMS ، حيث تتراكم جميع أيونات السلائف في وقت واحد وليس بشكل فردي. ثم يتم إطلاق أيونات السلائف في قمم أيونية ضيقة مقابل قمم أيون أوسع عادة (حوالي 50 مرة أقصر) ، مما يزيد من نسبة الإشارة إلى الضوضاء مع الاستمرار في فصل الببتيدات المحملة عبر التنقل14.
  4. تطوير طريقة LC-TIMS-ToF MS / MS لتحليل ببتيدات الهستون المحللة للبروتين. قم بإقران كروماتوجراف سائل عالي الأداء (HPLC) مزود بعمود C18 (300 Å ، 5 μm ، 4.6 مم × 250 مم) مع أداة TIMS-TOF MS التجارية مع تقنية PASEF الخاصة.
    ملاحظة: تم تحديد حجم العمود هذا لتوفير فصل جيد عند كل من الأس الهيدروجيني العالي والمنخفض لمخاليط الببتيد ، بناء على الأعمال المنشورة سابقا15،16،17.
    1. اضبط حجم الحقن على 20 ميكرولتر (8 ميكروغرام) من العينة ومعدل تدفق 0.4 مل / دقيقة.
    2. قم بتشغيل تدرج LC غير خطي لمدة 60 دقيقة باستخدام الماء مع 0.1٪ حمض الفورميك (المذيب أ) والأسيتونيتريل مع 0.1٪ حمض الفورميك (المذيب ب). اضبط التدرج: 10٪ B لمدة 2.7 دقيقة ، ثم إلى 20٪ B في 5.3 دقيقة ، و 28٪ B في 4 دقائق ، و 35٪ B في 18 دقيقة أخرى ، و 40٪ B في 13 دقيقة ، و 100٪ B في دقيقتين أخريين. بعد الضغط على 100٪ B لمدة 5 دقائق ، اخفض التركيز إلى 10٪ B في 5 دقائق واستمر لمدة 5 دقائق الأخيرة.
  5. تحقق من شطف العينة من HPLC إلى TIMS-TOF عبر تأين النانو الكهربائي (nESI) في وضع التأين الموجب.

4. تحليل البيانات

  1. تحديد تسلسلات الببتيد ومواقع التعديل.
    1. قم بإعداد قائمة نظرية بالببتيدات باستخدام ProteinProspector [https://prospector.ucsf.edu/prospector/cgi-bin/msform.cgi?form=msdigest] تحت أداة MS-digest.
      1. قم بإجراء ملخص نظري مع مراعاة ظروف الهضم (الإنزيم المستخدم) ، وأنواع PTMs التي يتم البحث عنها (على سبيل المثال ، أحادي أو ثنائي أو ثلاثي ميثيل) ، ونطاق حجم الببتيدات التي يتم البحث عنها ، بالإضافة إلى نطاق الكشف الشامل والعدد المحتمل للانقسامات المفقودة.
  2. تحليل البيانات المكتسبة يدويا بناء على الببتيدات النظرية (الشكل 6)12.
    1. يتم البحث عن الكتل في عدة حالات شحن (+1 إلى +4) لكل ببتيد نظري.
    2. بعد التحديد الأولي لكل m / z ، حدد القمة وقم بتأكيد MS / MS باستخدام قائمة نظرية لأيونات التجزئة بناء على تسلسل الببتيد ، بما في ذلك PTMs.
      ملاحظة: إذا كانت حركة الببتيد المحدد معروفة سابقا ، فهذا مؤكد أيضا.
  3. احسب الوفرة النسبية لمختلف PTMs وأبلغ عن كل تعديل كنسبة مئوية من تسلسل الببتيد المحدد.
    1. يتم حساب الوفرة النسبية لكل PTM المكتشف باستخدام المعادلة التالية:
      الوفرة النسبية = مساحة PTM / المساحة الإجمالية للببتيد غير المعدل و PTMs لببتيد معين

النتائج

عادة ما يتضمن سير العمل البروتيني من أسفل إلى أعلى (الشكل 7) ما يلي: استخراج البروتين (البروتينات) المستهدف من عينة خام ، متبوعا بتحديد تركيز البروتين (البروتينات) ، ثم التجزئة ، عادة عن طريق الرحلان الكهربائي الهلامي أو اللوني السائل. بعد التجزئة ، يتم هضم البروتينات باستخد?...

Discussion

الهستونات هي بروتينات أساسية تنظم بنية الكروماتين من خلال التفاعل مع الحمض النووي في شكل أوكتامرات تتكون من أربعة هيستون أساسية (اثنان من كل من H2A و H2B و H3 و H4)20. تحتوي الهستونات على العديد من بقايا اللايسين والأرجينين ، والتي يتم تعديلها بسهولة ، مما يؤدي إلى PTMs واسعة النطاق ال?...

Disclosures

ملفين أ. بارك وماثيو ويليتس موظفان في شركة Bruker Daltonics Inc. ، الشركة المصنعة لأداة timsTOF.

Acknowledgements

تستند هذه المواد إلى العمل الذي تدعمه المؤسسة الوطنية للعلوم بموجب المنحة رقم. HRD-1547798 والمنحة رقم. HRD-2111661. تم منح منح NSF هذه إلى جامعة فلوريدا الدولية كجزء من برنامج مراكز التميز البحثي في العلوم والتكنولوجيا (CREST). هذه هي المساهمة رقم 1672 من معهد البيئة ، وهو برنامج بارز في جامعة فلوريدا الدولية. وقدم المعهد الوطني للصحة دعما إضافيا في إطار المنحة رقم. R21AI135469 إلى فرانسيسكو فرنانديز ليما وغرانت لا. R01HD106051 إلى بنيامين أ. غارسيا ، وكذلك من قبل المؤسسة الوطنية للعلوم بموجب المنحة رقم. CHE-2127882 إلى بنيامين أ. جارسيا. يود المؤلفون أن يشكروا الدعم الأولي للدكتور ماريو غوميز هيرنانديز خلال تطورات الطريقة الأولية.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
-80 °C Freezer
1x Phosphate Buffered Saline (PBS), pH 7.4Thermo Fisher Scientific10010023Animal Origin-Free
1 mL Pipette TipsThermo Fisher Scientific94060710Finntip Flex 1000 μL, nonsterile, nonfiltered, racked tips
1.5 mL Microcentrifuge TubesThermo Fisher Scientific14-282-300Use these tubes for the simple and safe processing of sample volumes up to 1.5 mL
10 µL Pipette TipsThermo Fisher Scientific94060100Finntip Flex, 10 μL, nonsterile, non-filtered, racked
10% NP-40Thermo Fisher Scientific28324NP-40 Surfact-Amps Detergent Solution
10x Dulbecco’s PBS without Ca2+/Mg2+(Mediatech)MT21031CM
15 mL Conical TubesCorning352196Falcon Conical Centrifuge Tubes
200 µL Gel-Loading Pipette TipsThermo Fisher Scientific02-707-138Fisherbrand Gel-Loading Tips, 1–200 μL
200 µL Pipette TipsThermo Fisher Scientific94060310Finntip Flex 200μL, nonsterile, nonfiltered, racked tips
2x Laemmli Sample BufferBio-Rad1610737Premixed protein sample buffer for SDS-PAGE
50 mL Conical TubesCorning352070Falcon Conical Centrifuge Tubes
96-well flat bottom plateThermo Fisher Scientific12565501
96-well plate, V-Bottom 600 μLAxygenP-DW-500-C-S
AcetoneSigma Aldrich179124ACS reagent, ≥99.5%
Acetonitrile (ACN)Thermo Fisher ScientificA998HPLC, Fisher Chemical
Acetonitrile with 0.1% Formic acid (v/v), LC/MS GradeThermo Fisher ScientificLS120Optima LC/MS Grade, Thermo Scientific
AEBSFThermo Fisher Scientific328110500AEBSF hydrochloride, 98%
Ammonium bicarbonate, NH4HCO3Sigma Aldrich09830BioUltra, ≥99.5% (T)
Ammonium hydroxide solution, NH4OHSigma AldrichAX1303Meets ACS Specifications, Meets Reagent Specifications for testing USP/NF monographs GR ACS
Argon (Ar)AirgasAR HP 300
BEH C18 HPLC columnWaters186003625XBridge Peptide BEH C18 Column, 300 Å, 5 µm, 4.6 mm X 250 mm, 1K–15K
Bovine Serum Albumin (BSA)Sigma AldrichA7906Heat shock fraction, pH 7, ≥98%
Calcium chloride, CaCl2Sigma AldrichC4901Anhydrous, powder, ≥97%
Cell dissociation bufferThermo Fisher Scientific13151014
Ceramic scoring waferRestek20116
Compass DataAnalysis 6.0Bruker Datonics
Compass HyStar 6.2Bruker Daltonics
Compass IsotopePatternBruker Daltonics
Compass timsControl 4.1Bruker Daltonics
Coomassie Brilliant Blue R-250Bio-Rad1610436
Deep Well, 96-Well Microplate, 2.0 mLThermo Fisher Scientific89237526
Disposable Cell LiftersThermo Fisher Scientific 08100240Fisherbrand Cell Lifters; Disposable lifters quickly remove cell layers
Disposable Pellet PestlesThermo Fisher Scientific12-141-363Fisherbrand Pellet Pestles; Resuspend protein and DNA pellets or grind soft tissue in microcentrifuge tubes
Dithiothreitol (DTT)Thermo Fisher ScientificP23251 M
Formic acid (FA)Sigma Aldrich695076ACS reagent, ≥96%
Fused silica capillary 75 μm ID x 363 μm OD(Molex (Polymicro)TSP075375
Glacial Acetic AcidThermo Fisher ScientificA38SAcetic Acid, Glacial (Certified ACS), Fisher Chemical
Glass Pasteur PipettesSigma AldrichBR747725-1000EA
High-Performance Liquid Chromatograph ShimadzuShimadzu Prominence 20 HPLC UFLC System
Hydrochloric acid, HClSigma Aldrich258148ACS reagent, 37%
Hypercarb 30-40 μm Carbon 150–300 ÅThermo Fisher Scientific60106-402
Hypersep cartridgeThermo Fisher Scientific60109-404
LC/MS Calibration Standard, for ESI-ToFAgilentG1969-85000TuningMix
Magnesium chloride, MgCl2Sigma AldrichM8266Anhydrous, ≥98%
Methanol, for HPLCThermo Fisher ScientificA454Optima for HPLC, Fisher Chemical  
Microcentrifuge Tube AdaptersGL Sciences501021514
MicrocystinThermo Fisher Scientific50-200-8727Enzo Life Sciences Microcystin-LA
MS sample vial, LaPhaPack, Snap, 12 mm x 32 mmLEAP PAL PartsLAP.11190933
NanodropThermo Fisher Scientificmodel: ND3300
Nitrogen (N2)AirgasNI UHP300
PEAKS Studio X+Bioinformatic Solutions
pH indicator strips, InstachekMicro Essential LabJR-113Model: Hydrion
Potassium chloride, KClSigma AldrichP3911ACS reagent, 99.0%–100.5%
Pressure Injection CellNext Advance model: PC77
Propionic AnhydrideSigma Aldrich8.00608For synthesis
Refrigerated Centrifuge (700–18,000 x g)NuAire, model: NuwindNU-C200V
Reprosil-Pur 120 C18-AQ 3 μm, 3 gESI Source Solutionsr13.aq.0003
SDS-PAGE GelsBio-Rad4569035Any kD precast polyacrylamide gel, 8.6 cm × 6.7 cm (W × L), for use with Mini-PROTEAN Electrophoresis Cells
Sodium butyrateThermo Fisher ScientificA11079.0698+%
Sodium chloride, NaClSigma AldrichS9888ACS reagent, ≥99.0%
SPE disk, C18VWR76333-134Empore SPE disk, C18, CDS Analytical, 90 mm x 0.5 mm, 12 µm
SpeedVac+ vacuum pump and plate rotorSavantmodel: SC210A
SucroseMillipore1.07651suitable for microbiology
Sulfuric acid, H2SO4 Sigma Aldrich33974199.999%
TIMS-ToF Mass SpectrometerBruker Daltonicsmodel Tims tof ms
Trichloroacetic acid solution, TCASigma AldrichT06996.1 N
Trifluoroacetic acid (TFA)Sigma Aldrich302031Suitable for HPLC, ≥99.0%
Triversa NanomateAdvionmodel: TR263
TrypsinProtease, MS GradeThermo Fisher Scientific90057
Tube rotatorThermo Fisher Scientific88881001
Vortex MixerThermo Fisher Scientific88880017
Water with 0.1% Formic acid (v/v), LC/MS GradeThermo Fisher ScientificLS118Optima LC/MS Grade, Thermo Scientific 

References

  1. Zhao, Z., Shilatifard, A. Epigenetic modifications of histones in cancer. Genome Biology. 20, 245 (2019).
  2. Luger, K., Mader, A. W., Richmond, R. K., Sargen, D. F., Richmond, T. J. Crystal structure of the nucleosome core particle at 2.8 Å resolution. Nature. 389 (6648), 251-260 (1997).
  3. Bentley, G. A., Lewit-Bentley, A., Finch, J. T., Podjarny, A. D., Roth, M. Crystal structure of the nucleosome core particle at 16 Å resolution. Journal of Molecular Biology. 176 (1), 55-75 (1984).
  4. Kornberg, R. D., Thomas, J. O. Chromatin structure: Oligomers of the histones: The histones comprise an (F2A1)2(F3)2 tetramer, a different oligomer of F2A2 and F2B, and monomer of F1. Science. 184 (4139), 865-868 (1974).
  5. Borghini, A., Cervelli, T., Galli, A., Andreassi, M. G. DNA modifications in atherosclerosis: From the past to the future. Atherosclerosis. 230 (2), 202-209 (2013).
  6. Jeanne Dit Fouque, K., et al. 34;Double-Down" mass spectrometry of histone H4 proteoforms: Tandem ultraviolet-photon and mobility/mass-selected electron capture dissociations. Analytical Chemistry. 94 (44), 15377-15385 (2022).
  7. Lawrence, M., Daujat, S., Schneider, R. Lateral thinking: How histone modifications regulate gene expression. Trends in Genetics. 32 (1), 42-56 (2016).
  8. Bannister, A. J., Kouzarides, T. Regulation of chromatin by histone modifications. Cell Research. 21 (3), 381-395 (2011).
  9. Meier, F., et al. Parallel accumulation-serial fragmentation (PASEF): Multiplying sequencing speed and sensitivity by synchronized scans in a trapped ion mobility device. Journal of Proteome Research. 14 (12), 5378-5387 (2015).
  10. Chernushevich, I. V., Loboda, A. V., Thomson, B. A. An introduction to quadrupole-time-of-flight mass spectrometry. Journal of Mass Spectrometry. 36 (8), 849-865 (2001).
  11. Andrews, G. L., Simons, B. L., Young, J. B., Hawridge, A. M., Muddiman, D. C. Performance characteristics of a new hybrid quadrupole time-of-flight tandem mass spectrometer (TripleTOF 5600). Analytical Chemistry. 83 (13), 5442-5446 (2011).
  12. Bhanu, N. V., Sidoli, S., Garcia, B. A Workflow for ultra-rapid analysis of histone posttranslational modifications with direct-injection mass spectrometry. Bio-Protocol. 10 (18), e3756 (2020).
  13. Xue, A., et al. Discovery of serum biomarkers for pancreatic adenocarcinoma using proteomic analysis. British Journal of Cancer. 103 (3), 391-400 (2010).
  14. Wang, Y., et al. Reversed-phase chromatography with multiple fraction concatenation strategy for proteome profiling of human MCF10S cells. Proteomics. 11 (10), 2019-2026 (2011).
  15. Mertins, P., et al. Integrated proteomic analysis of posttranslational modifications by serial enrichment. Nature Methods. 10 (7), 634-637 (2012).
  16. Meier, F., Park, M. A., Mann, M. Trapped ion mobility spectrometry and parallel accumulation-serial fragmentation in proteomics. Molecular & Cellular Proteomics. 20, 100138 (2021).
  17. Romson, J., Emmer, A. Mass calibration options for accurate electrospray ionization mass spectrometry. International Journal of Mass Spectrometry. 467, 11619 (2021).
  18. Dupree, E. J., Jayathirtha, M., Yorkie, H., Mihasan, M., Petre, B. A., Darie, C. C. A critical review of bottom-up proteomics: The good, the bad, and the future of this field. Proteomes. 8 (3), 14 (2020).
  19. Ho, C. M., et al. Bottom-up structural proteomics: cryoEM of protein complexes enriched from the cellular milieu. Nature Methods. 17 (1), 79-85 (2020).
  20. Eickbush, T., Moudrianakis, E. The histone core complex: an octamer assembled by two sets of protein-protein interactions. Biochemistry. 17 (23), 4955-4964 (1978).
  21. Sadakierska-Chudy, A., Filip, M. A Comprehensive view of the epigenetic landscape. Part II: Histone posttranslational modification, nucleosome level, and chromatin regulation by ncRNAs. Neurotoxicity Research. 27 (2), 172-197 (2015).
  22. Tan, H. T., Low, J., Lim, S. G., Chung, M. C. M. Serum autoantibodies as biomarkers for early cancer detection. The FEBS Journal. 276 (23), 6880-6904 (2009).
  23. Huang, R. X., Zhou, P. K. DNA damage response pathways and targets for radiotherapy sensitization in cancer. Signal Transduction and Targeted Therapy. 5 (1), 60 (2020).
  24. Dantuma, N. P., van Attikum, H. Spatiotemporal regulation of posttranslational modifications in the DNA damage response. The EMBO Journal. 35 (1), 6-23 (2016).
  25. Tanner, S., Pevzner, P. A., Bafna, V. Unrestrictive identification of posttranslational modifications through peptide mass spectrometry. Nature Protocols. 1 (1), 67-72 (2006).
  26. Dolan, J. LC column problems everywhere 1. LCGC North America. 28 (9), 500-504 (2015).
  27. Brusniak, M. K., et al. An assessment of current bioinformatic solutions for analyzing LC-MS data acquired by selected reaction monitoring technology. Proteomics. 12 (8), 1176-1184 (2012).
  28. Cham, J. A., Bianco, L., Bessant, C. Free computational resources for designing selected reaction monitoring transitions. Proteomics. 10 (6), 1106-1126 (2010).
  29. Colangelo, C. M., Chung, L., Bruce, C., Cheung, K. Review of software tools for design and analysis of large scale MRM proteomic datasets. Methods. 61, 287-298 (2013).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

203

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved