Triagem de modificação de histona usando cromatografia líquida, espectrometria de mobilidade iônica aprisionada e espectrometria de massa por tempo de voo

Resumo

Um fluxo de trabalho analítico baseado em cromatografia líquida, espectrometria de mobilidade iônica aprisionada e espectrometria de massa por tempo de voo (LC-TIMS-ToF MS/MS) para alta confiança e análise "bottom-up" altamente reprodutível de modificações e identificação de histonas com base em parâmetros principais (tempo de retenção [TR], seção transversal de colisão [CCS] e relação massa-carga [m/z] precisa).

Resumo

As proteínas histonas são altamente abundantes e conservadas entre os eucariotos e desempenham um grande papel na regulação gênica como resultado de estruturas conhecidas como modificações pós-traducionais (MPTs). Identificar a posição e a natureza de cada PTM ou padrão de PTMs em referência a fatores externos ou genéticos permite que essa informação seja estatisticamente correlacionada com respostas biológicas, como transcrição, replicação ou reparo de DNA. No presente trabalho, um protocolo analítico de alto rendimento para a detecção de PTMs de histonas a partir de amostras biológicas é descrito. O uso de cromatografia líquida complementar, espectrometria de mobilidade iônica aprisionada e espectrometria de massas por tempo de voo (LC-TIMS-ToF MS/MS) permite a separação e atribuição de PTM das modificações biologicamente mais relevantes em uma única análise. A abordagem descrita aproveita os recentes desenvolvimentos na aquisição de dados dependentes (DDA) usando acumulação paralela na armadilha de mobilidade, seguida por fragmentação sequencial e dissociação induzida por colisão. Os PTMs Histone são atribuídos com confiança com base em seu tempo de retenção, mobilidade e padrão de fragmentação.

Introdução

Em células eucarióticas, o DNA é empacotado como cromatina em unidades funcionais chamadas nucleossomos. Essas unidades são compostas por um octâmero de quatro histonas de núcleo (duas de H2A, H2B, H3 e H4)1,2,3,4. As histonas estão entre as proteínas mais abundantes e altamente conservadas em eucariotos, as quais são as grandes responsáveis pela regulação gênica⁵. As modificações pós-traducionais de histona (MPTs) desempenham um grande papel na regulação da dinâmica da cromatina e rigger vários processos biológicos, como transcrição, replicação e reparo do DNA⁶. As MPT ocorrem principalmente na superfície acessível das regiões N-terminais das histonas que estão em contato com o DNA ^3,7. Entretanto, modificações na cauda e no núcleo influenciam a estrutura da cromatina, alterando as interações internucleossomas e recrutando proteínas específicas ^3,8.

Um desafio atual durante a proteômica baseada em cromatografia líquida-espectrometria de massas (LC-MS) é a potencial co-eluição de analitos de interesse. No caso das análises dependentes de dados (DDA), isso se traduz na perda potencial de vários íons precursores durante o processo de aquisição de MS/MS⁹. Os instrumentos Time-of-flight (ToF) adquirem espectros em frequência muito alta ^9,10 (até dezenas de kHz)¹¹; isso os torna capazes de escanear rapidamente os íons precursores totais dentro de uma amostra complexa (MS1), prometendo sensibilidade ótima e taxas de sequenciamento MS/MS (até 100 Hz)⁹ e tornando-os ideais para análise de amostras biológicas¹⁰. No entanto, a sensibilidade disponível nessas altas taxas de exame é limitada pela taxa MS/MS⁹. A adição de espectrometria de mobilidade iônica aprisionada (TIMS) em combinação com um espectrômetro de massa ortogonal quadrupolo time-of-flight (qToF) foi usada para mitigar essas limitações. No TIMS, todos os íons precursores são acumulados em tandem e eluídos em função de sua mobilidade, em vez de selecionar massas precursoras únicas com um quadrupolo⁹. A acumulação paralela-fragmentação seriada (PASEF) permite centenas de eventos MS/MS por segundo sem qualquer perda de sensibilidade⁹.

O objetivo principal deste trabalho foi mostrar os desenvolvimentos recentes da DDA usando acumulação paralela na armadilha de mobilidade, seguida de fragmentação sequencial e dissociação induzida por colisão (DDIC). Os PTMs Histone foram atribuídos com confiança com base em seus tempos de retenção (RTs), mobilidades e padrões de fragmentação.

Protocolo

NOTA: As amostras de histona foram extraídas usando um método adaptado de Bhanu et al (2020)¹².

1. Preparação da amostra

1. Colheita de células cultivadas
   1. Quando as células são 80% confluentes, certifique-se de que são viáveis usando a exclusão de azul de tripano.
      NOTA: Uma linhagem celular HeLa S3 foi usada para esses experimentos, mas este método pode ser aplicado a qualquer célula cultivada.
   2. Aspirar o meio e, em seguida, aplicar 5 mL de solução salina tamponada com fosfato (PBS) 1x em cada placa.
   3. Agite a(s) placa(s) para enxaguar todos os meios residuais, aspirar PBS e aplicar 5 mL de 1x PBS.
   4. Separe suavemente as células da placa raspando-as com um elevador de células descartável.
   5. Transfira cada suspensão celular para um tubo cônico de 15 mL.
   6. Granular as células centrifugando a 800 x g por 5 min.
   7. Aspirar o PBS da pastilha celular.
   8. Prossiga para a extração de histonas.
      NOTA: Congele rapidamente o pellet da pilha em azoto líquido se não puder ser processado imediatamente. Conservar os pellets a -80 °C até que esteja pronto para prosseguir.
2. Extração de histona
   1. Estimar o volume de cada pastilha celular e marcar o menisco com um marcador permanente.
   2. Preparar tampão de isolamento nuclear suficiente (NIB; 15 mM Tris-HCl (pH 7,5), 15 mM NaCl, 60 mM KCl, 5 mM MgCl₂, 1 mM CaCl₂ e 250 mM sacarose) para todas as amostras. Alternativamente, se muitas amostras precisarem ser processadas ao longo do tempo, faça o tampão a granel e armazene a 2-8 °C por até 6 meses, ou alíquota e congele a -15 °C a -25 °C indefinidamente, descongelando apenas a quantidade necessária para cada extração.
      Observação : o buffer deve permanecer limpo durante o armazenamento. Se o buffer assumir uma aparência turva ou anormal a qualquer momento, descarte e prepare um novo buffer.
   3. Preparar 50 vezes o volume das células pellets de tampão de lavagem e adicionar inibidores da seguinte forma (aproximadamente 10 mL de tampão de lavagem por 2 amostras).
      1. Para preparar 10 mL de tampão de lavagem, misturar 10 mL de NIB, 30 μL de cloridrato de fluoreto de 4-(2-aminoetil)benzenosulfonilo 200 mM [AEBSF], 10 μL de ditiotreitol 1 M [TDT], 20 μL de microcistina 5 μM, 20 μL de butirato de sódio 5 M.
   4. Remover 1/5 do tampão de lavagem para preparar o tampão de lise (1/5 volume do tampão de lavagem, alternativa NP-40 ou NP-40 a 0,3%).
      NOTA: Não use Triton-X 100 em vez de NP-40 ou NP-40 alternativa, pois pode ser muito abrasivo para certos tipos de células.
   5. Lave bem o pellet de células suspendendo-o em 5 colunas de tampão de lavagem e centrifugando a 800 x g durante 5 min a 4 °C. Conclua esta etapa duas vezes, aspirando e descartando o sobrenadante entre as lavagens.
   6. Certifique-se de que o volume do pellet da célula ainda esteja marcado com um marcador permanente. Ressuspender em 10 volumes de tampão de lise.
   7. Pipeta-misture bem cada pellet para ressuspender e, em seguida, incubar por 15 min no gelo.
   8. Após 15 min, centrifugar a 800 x g durante 5 min a 4 °C.
   9. Aspirar e descartar o sobrenadante.
      NOTA: O pellet deve reduzir para ≤ ¹/₂ o tamanho original do pellet (conforme indicado pela linha do marcador). Se o pellet não tiver reduzido o suficiente, repita o procedimento de lise e inclua uma etapa de homogeneização suave usando um pilão para abrir as células.
   10. Quando a lise estiver completa, ressuspenda o pellet em 500 μL de tampão de lavagem e, em seguida, centrifugue a 800 x g por 5 min a 4 °C. Aspirar e descartar o sobrenadante, em seguida, repita a etapa de lavagem mais uma vez para remover todos os vestígios de NP-40.
       NOTA: Neste ponto, o pellet consiste em cromatina, que contém histonas.
   11. Ressuspender o pellet em 5 volumes (do tamanho original do pellet celular) de 0,4 N H₂SO₄.
   12. Incubar por 2 h em uma câmara fria ou geladeira usando um agitador.
   13. Após 2 h, centrifugar a(s) amostra(s) a 3400 x g durante 5 min a 4 °C. Não descarte o sobrenadante.
   14. Transfira o sobrenadante para novos tubos e aumente o ácido tricloroacético (TCA) a 100% do volume do conteúdo (a concentração final de TCA será de aproximadamente 20%).
   15. Inverta suavemente o tubo e observe que a solução límpida e incolor fica branca e/ou turva, indicando precipitação de proteína.
       NOTA: Para soluções com baixas concentrações de histonas, a precipitação de proteínas pode não ser imediatamente perceptível, mas o precipitado deve ser visível após a incubação noturna.
   16. Incubar sem perturbação durante a noite (12-18 h) a 4 °C para precipitar completamente as proteínas de histonas.
   17. No dia seguinte, centrifugar a 3400 x g por 5 min a 4 °C.
   18. Aspirar o sobrenadante, tomando cuidado para não tocar as laterais do tubo com a ponta da pipeta. Nesta fase, as histonas são depositadas principalmente como um filme ao redor das laterais do(s) tubo(s).
   19. Adicionar 500 μL de acetona gelada + 0,1% HCl (acetona ácida) a cada tubo, utilizando uma pipeta de vidro Pasteur, e inverter suavemente o(s) tubo(s) várias vezes. Arrume as amostras em ordem (1, 2, 3, etc.) ao fazer isso, pois qualquer acetona errante pode remover as marcas nos tubos. Centrifugar a 3400 x g durante 5 min a 4 °C e decantar suavemente o sobrenadante.
   20. Repita esta etapa de enxágue com 500 μL de acetona 100% gelada, também com uma pipeta de vidro Pasteur. Centrifugar a 3400 x g durante 5 min a 4 °C e decantar suavemente o sobrenadante.
   21. Deixe os tubos abertos para secar à temperatura ambiente até que a acetona restante tenha evaporado.
   22. Quando estiver seco, adicionar 100 μL de água de grau de espectrometria de massa (MS) a cada tubo. Use esta gota para esfregar todos os lados do recipiente para ressuspender todo o filme de histona. Faça isso pipetando a gota na lateral do tubo e girando-a enquanto pipeta para cima e para baixo ou dispensando metade dos 100 μL e usando a ponta para mexer tudo ao redor. Uma combinação de ambos os métodos funciona melhor. As histonas são facilmente solúveis em água e estarão na solução.
   23. Depois de ressuspender todas as amostras, se houver algum sólido branco remanescente, sonicar em um banho à temperatura ambiente por 5 min.
   24. Centrifugar a 800 x g durante 5 min a 4 °C. Transfira a solução límpida para tubos frescos. Descarte qualquer pellet insolúvel restante.
   25. Execute um SDS-PAGE em condições de redução para verificar se a extração está limpa.
       NOTA: Os géis podem ser executados usando qualquer concentração apropriada de poliacrilamida, desde que possa diferenciar proteínas na faixa de 10-20 kDa. Consulte a Tabela de Materiais para os géis utilizados neste protocolo.
   26. Realizar um ensaio de concentração de proteína (ou seja, Bradford ou BCA) para determinar a concentração total de proteína.
3. Derivatização química (propionilação) dos resíduos de lisina
   1. Transferir 20 μg de histonas (determinadas pelo ensaio de proteínas) para um tubo limpo. Secar esta amostra até <5 μL usando um concentrador a vácuo e, em seguida, ressuspender usando 20 μL de bicarbonato de amônio 100 mM (NH₄CO₃) (~1 μg/μL solução). Ajuste o pH para ~8 usando hidróxido de amônio, se necessário.
      CUIDADO: Não use hidróxido de amônio (NH₄OH) para ressuspender, apenas para ajustar o pH se necessário. Caso contrário, as proteínas irão desnaturar e precipitar.
      NOTA: Para verificar o pH com perda mínima de amostra, use uma ponta de pipeta para mergulhar na amostra e passar em uma tira de pH. Este procedimento de ensaio será útil ao longo das restantes etapas de preparação da amostra.
   2. Preparar o reagente de propionilação adicionando anidrido propiónico à acetonitrila (ACN) numa proporção de 1:3 (v/v) (ou seja, para fazer 40 μL de reagente, combinar 10 μL de anidrido propiónico com 30 μL de ACN).
      NOTA: Tradicionalmente, metanol ou isopropanol têm sido usados na preparação de um reagente de propionilação. Como a propionilação é uma reação de formação de amida, um solvente não protônico, como a acetonitrila, é necessário para evitar produtos colaterais e reações indesejadas, como o éster metilpropionílico, que resulta do uso de metanol. Prepare apenas um reagente de propionilação suficiente para até 4 amostras de cada vez para que o reagente permaneça fresco. Use o reagente dentro de 1-2 min de preparação. À medida que o reagente se assenta, o anidrido propiônico reagirá com qualquer umidade ambiente, e o ácido acético começará a se formar, o que pode alterar a eficácia do reagente e alterar o pH da solução de histona uma vez que o reagente é adicionado.
   3. Adicionar o reagente de propionilação a cada amostra em um reagente de propionilação 1:4 (v/v) (ou seja, para 20 μL de histonas, adicionar 5 μL de reagente de propionilação).
   4. Adicione rapidamente NH₄OH 1:5 (v/v) (ou seja, adicione 4 μL para 20 μL da solução de histona) para restabelecer o pH da solução para ~8. Se o pH ainda estiver muito baixo, adicione 1-2 μL de NH₄OH de cada vez até atingir um pH de 8. Normalmente, uma proporção de 1:5 (v/v) é adequada.
   5. Incubar as amostras à temperatura ambiente durante 15 minutos sem perturbação.
   6. Repetir a reação de propionilação para não mais do que 3-4 amostras por lote de reagente de propionilação para garantir uma formação mínima de ácido.
   7. Repetir as etapas do procedimento de propionilação 1.3.2-1.3.5. Uma segunda rodada de propionilação garante que >95% das lisinas disponíveis sejam derivatizadas.
   8. Secar as amostras até <5 μL utilizando um concentrador a vácuo. Isso evaporará qualquer reagente de propionilação não reagido, produtos ácidos e gás amônia liberados do NH₄OH. Se as amostras secarem completamente, isso é bom, pois não ocorrem perdas significativas de amostras.
      NOTA: Deslocar o ar no frasco de anidrido propiônico com gás argônio antes do armazenamento para evitar a formação de ácido acético devido ao contato com a umidade ambiente remanescente no frasco.
4. Digestão proteolítica com tripsina
   1. Ressuspender histonas em 100 mM NH₄HCO₃ para atingir um volume de 20 μL, atingindo uma concentração ótima de 1 μg/μL.
      NOTA: Soluções de amostra com concentrações inferiores a 1 μg/μL resultarão na diminuição da eficiência da tripsina.
   2. Adicionar tripsina às amostras de histonas na proporção de 1:10 (m/m) (ou seja, adicionar 2 μL de solução de 1 μg/μL de tripsina a 20 μg de histonas).
   3. Incubar as reações a 37 °C durante 6-8 h. Alternativamente, incubar durante a noite (12-18 h) à temperatura ambiente.
   4. Interromper a digestão congelando a -80 °C durante, pelo menos, 1 h.
      NOTA: Não use ácido para apagar a reação de digestão, pois isso causará uma queda indesejada no pH neste ponto do procedimento. A amostra pode ser armazenada a -80 °C até estar pronta para prosseguir (ponto de paragem intercalar).
5. Derivatização química (propionilação) do peptídeo N-terminais
   1. Secar as amostras até <5 μL utilizando um concentrador a vácuo.
   2. Ressuspender as amostras até 20 μL (1 μg/μL) usando 100 mM NH₄HCO₃.
   3. Repetir a propionilação como antes (passo 1.3).
      OBS: É normal que as amostras demorem mais para secar nesta etapa devido a uma maior relação de fase aquosa:orgânica.
6. Dessalinização de amostras com pontas de estágio
   1. Ressuspender ou diluir as amostras com 50 μL de água grau MS + 0,1% TFA.
   2. Usando um coletor de amostras de 11 G, perfure 5 discos de material C₁₈ de um disco de extração em fase sólida (perfure todos os 5 discos antes de transferir para a ponta da pipeta). Insira e certifique-se de que os discos estejam encravados de forma segura e uniforme na parte inferior de uma ponta de pipeta de 200 μL (Figura 1).
      NOTA: Use o corer de 15 G se dessalgar mais de 25 μg de amostra através de uma única ponta de estágio.
   3. Use um adaptador de centrífuga para manter as pontas do estágio no lugar em tubos de microcentrífuga de 1,5 mL ou 2 mL.
      NOTA: Para as seguintes etapas de centrifugação, use rotação lenta (400-500 x g) a 4 °C, por 1-2 min de cada vez; os solventes normalmente passam através da resina em menos de 1 min, dependendo de quão firmemente o material C₁₈ é embalado nas pontas.
   4. Enxaguar a resina centrifugando com 50 μL de acetonitrila a 100% para ativar o material C₁₈ e remover potenciais contaminantes.
      NOTA: Pode ser mais fácil carregar soluções nas pontas do palco usando pontas de pipeta de carregamento de gel. Uma vez que o material C₁₈ tenha sido ativado, é importante não permitir que a resina seque durante o procedimento de dessalinização.
   5. Equilibrar o material do disco com 80 μL de água grau MS + 0,1% TFA por centrifugação.
   6. Acidificar a amostra a pH 4 ou inferior utilizando ácido acético glacial. Verifique o pH com tiras de pH como antes para minimizar a perda de amostra.
   7. Carregue a totalidade da amostra no disco de resina por centrifugação lenta.
   8. Lavar a amostra com 80 μL de água grau MS + TFA 0,1% por centrifugação.
   9. Eluir a amostra em um tubo limpo de 1,5 mL lavando 70 μL de acetonitrila a 75% e ácido acético a 0,5% por centrifugação lenta. Tempo de centrifugação adicional pode ser usado para garantir que o volume total da amostra seja eluído da ponta do estágio. Tudo bem se a resina secar com o tempo adicional de centrifugação, pois ela não é mais necessária após a eluição da amostra.
   10. Secar completamente cada amostra em um concentrador a vácuo.
       NOTA: A(s) amostra(s) pode(m) ser armazenada(s) a -80 °C até que estejam prontas para prosseguir (ponto de paragem provisório).
   11. Para a análise de LC-MS/MS, reconstituir as amostras em um volume de Solvente A (0,1% de ácido fórmico) a partir do protocolo de cromatografia líquida (LC) que fornece a concentração final de 0,4 μg/μL (ou seja, dissolver 20 μg de histonas em 50 μL de Solvente A).

2. Interface do software TIMS

1. Selecione a guia Instrumento e alterne para Operar (verifique se o nome do instrumento fica realçado em verde) (Figura 2).
2. Verifique os parâmetros do TIMS (Figura 2).
3. Verifique as configurações do MS (início da varredura, fim da varredura, polaridade do íon, modo de varredura) (Figura 2).
4. Verifique as configurações do TIMS (modo, início da mobilidade, fim da mobilidade, tempo de rampa, tempo de acumulação, ciclo de trabalho, taxa de rampa, taxa de EM, média de EM e calibração automática) (Figura 2).
5. Vá para a guia Source e ative a opção de seringa (Hamilton 500 μL) somente para a etapa de calibração do TuneMix (Figura 3)¹³.
6. Vá para a guia Calibração , clique em m/z, selecione Modo de calibração e escolha o modo (Q avançado, geralmente), zoom (+0,01%) STD Dev (0,24) e clique em Calibrar; quando atingir 100% de pontuação, aceitar (Figura 4).
7. Vá para a aba mobilidade e repita o processo de calibração (Modo Linear, geralmente), faixa de detecção (+5%), largura (0,1 Da), STD Dev (0,1855), depois clique em calibrar; quando obtiver uma pontuação ≥ 98,5%, aceite (Figura 5).
8. Vá até o método e selecione o método a ser utilizado; para este exemplo, Proteomic_/2023-01-19-CF/20230119-Hela Control histone_prep_pasefDIA_1-24_1_451.d/451.m-TimsControl foi selecionado (Figura 5).

3. LC-TIMS-PASEF-ToF MS/MS

1. Use as condições de operação nESI típicas: tensão capilar de 4500 V, deslocamento da placa terminal de 800 V, pressão do nebulizador de 3,0 bar, gás seco de 10,0 L/min, aquecedor seco de 200 °C e vazão de injeção de 50 μL/min.
2. Use as configurações típicas de MS: energia de colisão de 6 eV, RF de colisão de 1200 Vpp, tempo de transferência de 75 μs, armazenamento de pré-pulso de 5 μs.
3. Determinar o fluxo de gás de deriva usando a diferença de pressão do funil de entrada P1 e do funil de saída P2. A acumulação paralela-fragmentação seriada (PASEF) ocorre na célula TIMS, acumulando todos os íons precursores simultaneamente em vez de individualmente. Os íons precursores são então liberados em picos de íons estreitos versus os picos normalmente muito mais largos (cerca de 50 vezes mais curtos), aumentando a relação sinal-ruído enquanto ainda separam peptídeos coeluídos via mobilidade¹⁴.
4. Desenvolver um método LC-TIMS-ToF MS/MS para análise de peptídeos de histonas proteolíticas. Junte um cromatógrafo líquido de alta eficiência (HPLC) equipado com uma coluna C₁₈ (300 Å, 5 μm, 4,6 mm x 250 mm) com um instrumento comercial TIMS-TOF MS com tecnologia PASEF proprietária.
   NOTA: O tamanho desta coluna foi determinado para proporcionar uma boa separação em pH alto e baixo para misturas peptídicas, com base em trabalhos publicados anteriormente 15,16,17.
   1. Ajustar o volume de injeção para 20 μL (8 μg) de amostra e um fluxo de 0,4 mL/min.
   2. Executar um gradiente de LC não linear de 60 minutos usando água com 0,1% de ácido fórmico (Solvente A) e acetonitrila com 0,1% de ácido fórmico (Solvente B). Ajuste o gradiente: 10% B por 2,7 min, depois para 20% B em 5,3 min, 28% B em 4 min, 35% B em mais 18 min, 40% B em 13 min e 100% B em mais 2 min. Após segurar 100% B por 5 min, diminuir a concentração para 10% B em 5 min e segurar pelos 5 min finais.
5. Verificar a eluição da amostra da HPLC para o TIMS-TOF via ionização por nano-electrospray (nESI) no modo de ionização positiva.

4. Análise dos dados

1. Identificar as sequências peptídicas e os locais de modificação.
   1. Prepare uma lista teórica de peptídeos usando ProteinProspector [https://prospector.ucsf.edu/prospector/cgi-bin/msform.cgi?form=msdigest] sob a ferramenta MS-digest.
      1. Realizar um digesto teórico levando em consideração as condições do digesto (enzima usada), os tipos de PTMs que estão sendo pesquisados (por exemplo, mono-, di-, ou trimetilação), a faixa de tamanho de peptídeos que estão sendo procurados, bem como a faixa de detecção de massa e o número potencial de clivagens perdidas.
2. Analise manualmente os dados adquiridos com base em peptídeos teóricos (Figura 6)¹².
   1. Procuram-se as massas em vários estados de carga (+1 a +4) para cada peptídeo teórico.
   2. Após a identificação inicial de cada m/z, selecione o pico e confirme o MS/MS usando uma lista teórica de íons de fragmentação baseada na sequência peptídica, incluindo PTMs.
      NOTA: Se a mobilidade do peptídeo identificado era conhecida anteriormente, isso também é confirmado.
3. Calcule as abundâncias relativas de vários PTMs e relate cada modificação como uma porcentagem da sequência peptídica especificada.
   1. A abundância relativa de cada PTM detectado é calculada usando a seguinte equação:
      Abundância relativa = Área de PTM/Área total de PTMs e não modificadas para um dado peptídeo

Resultados

Um fluxo de trabalho proteômico ascendente (Figura 7) tipicamente envolve o seguinte: extração da(s) proteína(s) alvo(s) de uma amostra bruta, seguida da quantificação da concentração da(s) proteína(s) e, em seguida, fracionamento, geralmente por eletroforese em gel ou cromatografia líquida. Após o fracionamento, as proteínas são digeridas usando uma enzima proteolítica (muitas vezes tripsina) e, finalmente, análise espectrométrica de massa dos peptídeos resultantes e identi...

Discussão

As histonas são proteínas básicas que regulam a estrutura da cromatina interagindo com o DNA na forma de octâmeros constituídos pelas quatro histonas centrais (duas de H2A, H2B, H3 e H4)²⁰. As histonas contêm numerosos resíduos de lisina e arginina, que são prontamente modificados, levando a extensas MPTs que alteram a química da cromatina influenciando a função das histonas ou ligando-se a outras proteínas celulares²¹. As MPT podem provocar respostas biológica...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
-80 °C Freezer
1x Phosphate Buffered Saline (PBS), pH 7.4	Thermo Fisher Scientific	10010023	Animal Origin-Free
1 mL Pipette Tips	Thermo Fisher Scientific	94060710	Finntip Flex 1000 μL, nonsterile, nonfiltered, racked tips
1.5 mL Microcentrifuge Tubes	Thermo Fisher Scientific	14-282-300	Use these tubes for the simple and safe processing of sample volumes up to 1.5 mL
10 µL Pipette Tips	Thermo Fisher Scientific	94060100	Finntip Flex, 10 μL, nonsterile, non-filtered, racked
10% NP-40	Thermo Fisher Scientific	28324	NP-40 Surfact-Amps Detergent Solution
10x Dulbecco’s PBS without Ca2+/Mg2+	(Mediatech)	MT21031CM
15 mL Conical Tubes	Corning	352196	Falcon Conical Centrifuge Tubes
200 µL Gel-Loading Pipette Tips	Thermo Fisher Scientific	02-707-138	Fisherbrand Gel-Loading Tips, 1–200 μL
200 µL Pipette Tips	Thermo Fisher Scientific	94060310	Finntip Flex 200μL, nonsterile, nonfiltered, racked tips
2x Laemmli Sample Buffer	Bio-Rad	1610737	Premixed protein sample buffer for SDS-PAGE
50 mL Conical Tubes	Corning	352070	Falcon Conical Centrifuge Tubes
96-well flat bottom plate	Thermo Fisher Scientific	12565501
96-well plate, V-Bottom 600 μL	Axygen	P-DW-500-C-S
Acetone	Sigma Aldrich	179124	ACS reagent, ≥99.5%
Acetonitrile (ACN)	Thermo Fisher Scientific	A998	HPLC, Fisher Chemical
Acetonitrile with 0.1% Formic acid (v/v), LC/MS Grade	Thermo Fisher Scientific	LS120	Optima LC/MS Grade, Thermo Scientific
AEBSF	Thermo Fisher Scientific	328110500	AEBSF hydrochloride, 98%
Ammonium bicarbonate, NH4HCO3	Sigma Aldrich	09830	BioUltra, ≥99.5% (T)
Ammonium hydroxide solution, NH4OH	Sigma Aldrich	AX1303	Meets ACS Specifications, Meets Reagent Specifications for testing USP/NF monographs GR ACS
Argon (Ar)	Airgas	AR HP 300
BEH C18 HPLC column	Waters	186003625	XBridge Peptide BEH C18 Column, 300 Å, 5 µm, 4.6 mm X 250 mm, 1K–15K
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma Aldrich	A7906	Heat shock fraction, pH 7, ≥98%
Calcium chloride, CaCl2	Sigma Aldrich	C4901	Anhydrous, powder, ≥97%
Cell dissociation buffer	Thermo Fisher Scientific	13151014
Ceramic scoring wafer	Restek	20116
Compass DataAnalysis 6.0	Bruker Datonics
Compass HyStar 6.2	Bruker Daltonics
Compass IsotopePattern	Bruker Daltonics
Compass timsControl 4.1	Bruker Daltonics
Coomassie Brilliant Blue R-250	Bio-Rad	1610436
Deep Well, 96-Well Microplate, 2.0 mL	Thermo Fisher Scientific	89237526
Disposable Cell Lifters	Thermo Fisher Scientific	08100240	Fisherbrand Cell Lifters; Disposable lifters quickly remove cell layers
Disposable Pellet Pestles	Thermo Fisher Scientific	12-141-363	Fisherbrand Pellet Pestles; Resuspend protein and DNA pellets or grind soft tissue in microcentrifuge tubes
Dithiothreitol (DTT)	Thermo Fisher Scientific	P2325	1 M
Formic acid (FA)	Sigma Aldrich	695076	ACS reagent, ≥96%
Fused silica capillary 75 μm ID x 363 μm OD	(Molex (Polymicro)	TSP075375
Glacial Acetic Acid	Thermo Fisher Scientific	A38S	Acetic Acid, Glacial (Certified ACS), Fisher Chemical
Glass Pasteur Pipettes	Sigma Aldrich	BR747725-1000EA
High-Performance Liquid Chromatograph	Shimadzu		Shimadzu Prominence 20 HPLC UFLC System
Hydrochloric acid, HCl	Sigma Aldrich	258148	ACS reagent, 37%
Hypercarb 30-40 μm Carbon 150–300 Å	Thermo Fisher Scientific	60106-402
Hypersep cartridge	Thermo Fisher Scientific	60109-404
LC/MS Calibration Standard, for ESI-ToF	Agilent	G1969-85000	TuningMix
Magnesium chloride, MgCl2	Sigma Aldrich	M8266	Anhydrous, ≥98%
Methanol, for HPLC	Thermo Fisher Scientific	A454	Optima for HPLC, Fisher Chemical
Microcentrifuge Tube Adapters	GL Sciences	501021514
Microcystin	Thermo Fisher Scientific	50-200-8727	Enzo Life Sciences Microcystin-LA
MS sample vial, LaPhaPack, Snap, 12 mm x 32 mm	LEAP PAL Parts	LAP.11190933
Nanodrop	Thermo Fisher Scientific	model: ND3300
Nitrogen (N2)	Airgas	NI UHP300
PEAKS Studio X+	Bioinformatic Solutions
pH indicator strips, Instachek	Micro Essential Lab	JR-113	Model: Hydrion
Potassium chloride, KCl	Sigma Aldrich	P3911	ACS reagent, 99.0%–100.5%
Pressure Injection Cell	Next Advance	model: PC77
Propionic Anhydride	Sigma Aldrich	8.00608	For synthesis
Refrigerated Centrifuge (700–18,000 x g)	NuAire, model: Nuwind	NU-C200V
Reprosil-Pur 120 C18-AQ 3 μm, 3 g	ESI Source Solutions	r13.aq.0003
SDS-PAGE Gels	Bio-Rad	4569035	Any kD precast polyacrylamide gel, 8.6 cm × 6.7 cm (W × L), for use with Mini-PROTEAN Electrophoresis Cells
Sodium butyrate	Thermo Fisher Scientific	A11079.06	98+%
Sodium chloride, NaCl	Sigma Aldrich	S9888	ACS reagent, ≥99.0%
SPE disk, C18	VWR	76333-134	Empore SPE disk, C18, CDS Analytical, 90 mm x 0.5 mm, 12 µm
SpeedVac+ vacuum pump and plate rotor	Savant	model: SC210A
Sucrose	Millipore	1.07651	suitable for microbiology
Sulfuric acid, H2SO4	Sigma Aldrich	339741	99.999%
TIMS-ToF Mass Spectrometer	Bruker Daltonics		model Tims tof ms
Trichloroacetic acid solution, TCA	Sigma Aldrich	T0699	6.1 N
Trifluoroacetic acid (TFA)	Sigma Aldrich	302031	Suitable for HPLC, ≥99.0%
Triversa Nanomate	Advion	model: TR263
TrypsinProtease, MS Grade	Thermo Fisher Scientific	90057
Tube rotator	Thermo Fisher Scientific	88881001
Vortex Mixer	Thermo Fisher Scientific	88880017
Water with 0.1% Formic acid (v/v), LC/MS Grade	Thermo Fisher Scientific	LS118	Optima LC/MS Grade, Thermo Scientific