使用液相色谱法、捕获离子淌度谱法和飞行时间质谱法进行组蛋白修饰筛选

摘要

基于液相色谱、俘获离子淌度谱和飞行时间质谱 （LC-TIMS-ToF MS/MS） 的分析工作流程，用于基于主要参数（保留时间 [RT]、碰撞截面 [CCS] 和准确的质荷比 [m/z] 比）对组蛋白修饰和鉴定进行高可信度和高度可重复性的“自下而上”分析。

摘要

组蛋白在真核生物中高度丰富且保守，并且由于称为翻译后修饰 （PTM） 的结构，在基因调控中发挥着重要作用。参考外部或遗传因素确定每个 PTM 或 PTM 模式的位置和性质，可以使这些信息与生物反应（如 DNA 转录、复制或修复）进行统计相关。在本工作中，描述了一种用于检测生物样品中组蛋白PTMs的高通量分析方案。使用互补液相色谱法、俘获离子淌度谱法和飞行时间质谱法 （LC-TIMS-ToF MS/MS） 可以在单次分析中分离和分配最具生物学相关性的修饰。所描述的方法利用了相关数据采集 （DDA） 的最新发展，使用迁移阱中的平行积累，然后是顺序碎片化和碰撞诱导的解离。组蛋白 PTM 根据其保留时间、迁移率和碎片模式进行可靠分配。

引言

在真核细胞中，DNA 被包装成染色质，形成称为核小体的功能单元。这些单元由四个核心组蛋白（H2A、H2B、H3 和 H4 各^两个）的八聚体组成1,2,3,4。组蛋白是真核生物中最丰富和高度保守的蛋白质之一，主要负责基因调控⁵.组蛋白翻译后修饰 （PTM） 在染色质动力学的调节和操纵各种生物过程（如 DNA 转录、复制和修复）中起着重要作用⁶。PTM 主要发生在与 DNA ^3,7 接触的组蛋白 N 末端区域的可触及表面上。然而，尾部和核心修饰会影响染色质结构，改变核小体间相互作用并募集特定蛋白 ^3,8。

在基于液相色谱-质谱（LC-MS）的蛋白质组学中，当前的一个挑战是目标分析物的潜在共洗脱。在数据依赖性分析（DDA）的情况下，这意味着在MS/MS采集过程中，几个母离子的潜在损失

研究方案

注：组蛋白样品是使用改编自Bhanu等人（2020）¹²的方法提取的。

1. 样品制备

1. 收获培养细胞
   1. 当细胞汇合度达到 80% 时，使用台盼蓝排除确保它们存活。
      注意：这些实验使用了HeLa S3细胞系，但这种方法可以应用于任何培养的细胞。
   2. 吸出培养基，然后在每个板上涂抹 5 mL 1x 磷酸盐缓冲盐水 （PBS）。
   3. 旋转板以冲洗所有残留介质，然后吸出 PBS 并涂抹 5 mL 1x PBS。
   4. 用一次性细胞升降器刮擦细胞，轻轻地将细胞与平板分离。
   5. 将每个细胞悬液转移到 15 mL 锥形管中。
   6. 通过以800× g 离心5分钟来沉淀细胞。
   7. 从细胞沉淀中吸出PBS。
   8. 继续进行组蛋白提取。
      注意：如果不能立即处理，请在液氮中快速冷冻细胞沉淀。将颗粒储存在-80°C，直到准备继续。
2. 组蛋白提取
   1. 估计每个细胞沉淀的体积，并用永久性标记标记半月板。
   2. 为所有样品准备足够的核分离缓冲液（NIB;15 mM Tris-HCl （pH 7.5）、15 mM NaCl、60 mM KCl、5 mM MgCl₂

讨论

组蛋白是碱性蛋白质，通过以八聚体的形式与 DNA 相互作用来调节染色质结构，八聚体由四个核心组蛋白（H2A、H2B、H3 和 H4 各两个）组成）²⁰。组蛋白含有许多赖氨酸和精氨酸残基，这些残基很容易被修饰，导致广泛的 PTM，通过影响组蛋白功能或与其他细胞蛋白结合来改变染色质化学²¹。PTM 可以通过协同工作来引发生物反应，在几种疾病中已经报道了特定的 PTM.......

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
-80 °C Freezer
1x Phosphate Buffered Saline (PBS), pH 7.4	Thermo Fisher Scientific	10010023	Animal Origin-Free
1 mL Pipette Tips	Thermo Fisher Scientific	94060710	Finntip Flex 1000 μL, nonsterile, nonfiltered, racked tips
1.5 mL Microcentrifuge Tubes	Thermo Fisher Scientific	14-282-300	Use these tubes for the simple and safe processing of sample volumes up to 1.5 mL
10 µL Pipette Tips	Thermo Fisher Scientific	94060100	Finntip Flex, 10 μL, nonsterile, non-filtered, racked
10% NP-40	Thermo Fisher Scientific	28324	NP-40 Surfact-Amps Detergent Solution
10x Dulbecco’s PBS without Ca2+/Mg2+	(Mediatech)	MT21031CM
15 mL Conical Tubes	Corning	352196	Falcon Conical Centrifuge Tubes
200 µL Gel-Loading Pipette Tips	Thermo Fisher Scientific	02-707-138	Fisherbrand Gel-Loading Tips, 1–200 μL
200 µL Pipette Tips	Thermo Fisher Scientific	94060310	Finntip Flex 200μL, nonsterile, nonfiltered, racked tips
2x Laemmli Sample Buffer	Bio-Rad	1610737	Premixed protein sample buffer for SDS-PAGE
50 mL Conical Tubes	Corning	352070	Falcon Conical Centrifuge Tubes
96-well flat bottom plate	Thermo Fisher Scientific	12565501
96-well plate, V-Bottom 600 μL	Axygen	P-DW-500-C-S
Acetone	Sigma Aldrich	179124	ACS reagent, ≥99.5%
Acetonitrile (ACN)	Thermo Fisher Scientific	A998	HPLC, Fisher Chemical
Acetonitrile with 0.1% Formic acid (v/v), LC/MS Grade	Thermo Fisher Scientific	LS120	Optima LC/MS Grade, Thermo Scientific
AEBSF	Thermo Fisher Scientific	328110500	AEBSF hydrochloride, 98%
Ammonium bicarbonate, NH4HCO3	Sigma Aldrich	09830	BioUltra, ≥99.5% (T)
Ammonium hydroxide solution, NH4OH	Sigma Aldrich	AX1303	Meets ACS Specifications, Meets Reagent Specifications for testing USP/NF monographs GR ACS
Argon (Ar)	Airgas	AR HP 300
BEH C18 HPLC column	Waters	186003625	XBridge Peptide BEH C18 Column, 300 Å, 5 µm, 4.6 mm X 250 mm, 1K–15K
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma Aldrich	A7906	Heat shock fraction, pH 7, ≥98%
Calcium chloride, CaCl2	Sigma Aldrich	C4901	Anhydrous, powder, ≥97%
Cell dissociation buffer	Thermo Fisher Scientific	13151014
Ceramic scoring wafer	Restek	20116
Compass DataAnalysis 6.0	Bruker Datonics
Compass HyStar 6.2	Bruker Daltonics
Compass IsotopePattern	Bruker Daltonics
Compass timsControl 4.1	Bruker Daltonics
Coomassie Brilliant Blue R-250	Bio-Rad	1610436
Deep Well, 96-Well Microplate, 2.0 mL	Thermo Fisher Scientific	89237526
Disposable Cell Lifters	Thermo Fisher Scientific	08100240	Fisherbrand Cell Lifters; Disposable lifters quickly remove cell layers
Disposable Pellet Pestles	Thermo Fisher Scientific	12-141-363	Fisherbrand Pellet Pestles; Resuspend protein and DNA pellets or grind soft tissue in microcentrifuge tubes
Dithiothreitol (DTT)	Thermo Fisher Scientific	P2325	1 M
Formic acid (FA)	Sigma Aldrich	695076	ACS reagent, ≥96%
Fused silica capillary 75 μm ID x 363 μm OD	(Molex (Polymicro)	TSP075375
Glacial Acetic Acid	Thermo Fisher Scientific	A38S	Acetic Acid, Glacial (Certified ACS), Fisher Chemical
Glass Pasteur Pipettes	Sigma Aldrich	BR747725-1000EA
High-Performance Liquid Chromatograph	Shimadzu		Shimadzu Prominence 20 HPLC UFLC System
Hydrochloric acid, HCl	Sigma Aldrich	258148	ACS reagent, 37%
Hypercarb 30-40 μm Carbon 150–300 Å	Thermo Fisher Scientific	60106-402
Hypersep cartridge	Thermo Fisher Scientific	60109-404
LC/MS Calibration Standard, for ESI-ToF	Agilent	G1969-85000	TuningMix
Magnesium chloride, MgCl2	Sigma Aldrich	M8266	Anhydrous, ≥98%
Methanol, for HPLC	Thermo Fisher Scientific	A454	Optima for HPLC, Fisher Chemical
Microcentrifuge Tube Adapters	GL Sciences	501021514
Microcystin	Thermo Fisher Scientific	50-200-8727	Enzo Life Sciences Microcystin-LA
MS sample vial, LaPhaPack, Snap, 12 mm x 32 mm	LEAP PAL Parts	LAP.11190933
Nanodrop	Thermo Fisher Scientific	model: ND3300
Nitrogen (N2)	Airgas	NI UHP300
PEAKS Studio X+	Bioinformatic Solutions
pH indicator strips, Instachek	Micro Essential Lab	JR-113	Model: Hydrion
Potassium chloride, KCl	Sigma Aldrich	P3911	ACS reagent, 99.0%–100.5%
Pressure Injection Cell	Next Advance	model: PC77
Propionic Anhydride	Sigma Aldrich	8.00608	For synthesis
Refrigerated Centrifuge (700–18,000 x g)	NuAire, model: Nuwind	NU-C200V
Reprosil-Pur 120 C18-AQ 3 μm, 3 g	ESI Source Solutions	r13.aq.0003
SDS-PAGE Gels	Bio-Rad	4569035	Any kD precast polyacrylamide gel, 8.6 cm × 6.7 cm (W × L), for use with Mini-PROTEAN Electrophoresis Cells
Sodium butyrate	Thermo Fisher Scientific	A11079.06	98+%
Sodium chloride, NaCl	Sigma Aldrich	S9888	ACS reagent, ≥99.0%
SPE disk, C18	VWR	76333-134	Empore SPE disk, C18, CDS Analytical, 90 mm x 0.5 mm, 12 µm
SpeedVac+ vacuum pump and plate rotor	Savant	model: SC210A
Sucrose	Millipore	1.07651	suitable for microbiology
Sulfuric acid, H2SO4	Sigma Aldrich	339741	99.999%
TIMS-ToF Mass Spectrometer	Bruker Daltonics		model Tims tof ms
Trichloroacetic acid solution, TCA	Sigma Aldrich	T0699	6.1 N
Trifluoroacetic acid (TFA)	Sigma Aldrich	302031	Suitable for HPLC, ≥99.0%
Triversa Nanomate	Advion	model: TR263
TrypsinProtease, MS Grade	Thermo Fisher Scientific	90057
Tube rotator	Thermo Fisher Scientific	88881001
Vortex Mixer	Thermo Fisher Scientific	88880017
Water with 0.1% Formic acid (v/v), LC/MS Grade	Thermo Fisher Scientific	LS118	Optima LC/MS Grade, Thermo Scientific