Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Temsili Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Histon modifikasyonlarının yüksek güvenilirlikli ve yüksek oranda tekrarlanabilir "aşağıdan yukarıya" analizi ve temel parametrelere (alıkonma süresi [RT], çarpışma kesiti [CCS] ve doğru kütle-yük [m/z] oranı) dayalı tanımlama için sıvı kromatografisi, sıkışmış iyon hareketlilik spektrometrisi ve uçuş zamanı kütle spektrometrisine (LC-TIMS-ToF MS/MS) dayalı analitik bir iş akışı.

Özet

Histon proteinleri ökaryotlar arasında oldukça bol miktarda bulunur ve korunur ve posttranslasyonel modifikasyonlar (PTM'ler) olarak bilinen yapıların bir sonucu olarak gen düzenlemesinde büyük rol oynar. Dış veya genetik faktörlere göre her bir PTM'nin veya PTM modelinin konumunu ve doğasını belirlemek, bu bilginin DNA transkripsiyonu, replikasyonu veya onarımı gibi biyolojik tepkilerle istatistiksel olarak ilişkilendirilmesine izin verir. Bu çalışmada, biyolojik örneklerden histon PTM'lerinin tespiti için yüksek verimli bir analitik protokol açıklanmaktadır. Tamamlayıcı sıvı kromatografisi, sıkışmış iyon hareketlilik spektrometrisi ve uçuş zamanı kütle spektrometrisinin (LC-TIMS-ToF MS/MS) kullanımı, biyolojik olarak en ilgili modifikasyonların tek bir analizde ayrılmasını ve PTM atanmasını sağlar. Açıklanan yaklaşım, hareketlilik tuzağında paralel birikim ve ardından sıralı parçalanma ve çarpışma kaynaklı ayrışma kullanarak bağımlı veri toplamadaki (DDA) son gelişmelerden yararlanır. Histon PTM'leri, tutma sürelerine, hareketliliklerine ve parçalanma modellerine göre güvenle atanır.

Giriş

Ökaryotik hücrelerde DNA, kromatin olarak nükleozom adı verilen fonksiyonel birimler halinde paketlenir. Bu birimler dört çekirdek histondan oluşan bir oktamerden oluşur (her biri H2A, H2B, H3 ve H4'ten ikişer)1,2,3,4. Histonlar, gen regülasyonundan büyük ölçüde sorumlu olan ökaryotlarda en bol bulunan ve yüksek oranda korunan proteinler arasındadır5. Histon posttranslasyonel modifikasyonları (PTM'ler), kromatin dinamiğinin düzenlenmesinde büyük rol oynar ve DNA transkripsiyonu, replikasyonu ve onarımı gibi çeşitli bi....

Protokol

NOT: Histon örnekleri, Bhanu ve ark. (2020)12.

1. Numune hazırlama

  1. Kültürlenmiş hücrelerin toplanması
    1. Hücreler %80 birleştiğinde, tripan mavisi dışlamasını kullanarak canlı olduklarından emin olun.
      NOT: Bu deneyler için bir HeLa S3 hücre hattı kullanıldı, ancak bu yöntem herhangi bir kültürlenmiş hücreye uygulanabilir.
    2. Ortamı aspire edin, ardından her plakaya 5 mL 1x fosfat tamponlu salin (PBS) uygulayın.
    3. Tüm kalıntı ortamları durulamak için plakaları döndürün, ardından PBS'yi aspire edin ve 5 mL 1x PBS uygulayın.
    4. Hücreleri tek kullanımlık bir hücr....

Temsili Sonuçlar

Aşağıdan yukarıya bir proteomik iş akışı (Şekil 7) tipik olarak aşağıdakileri içerir: ham bir numuneden hedef protein(ler)in ekstraksiyonu, ardından protein(ler)in konsantrasyonunun ölçülmesi ve ardından genellikle jel elektroforezi veya sıvı kromatografisi ile fraksiyonlama. Fraksiyonlamadan sonra, proteinler bir proteolitik enzim (genellikle tripsin) kullanılarak sindirilir ve son olarak, elde edilen peptitlerin kütle spektrometrik analizi ve yerleşik bir veri taban?.......

Tartışmalar

Histonlar, dört çekirdek histondan (H2A, H2B, H3 ve H4'ün ikişer tane) oluşan oktamerler şeklinde DNA ile etkileşime girerek kromatin yapısını düzenleyen temel proteinlerdir.20. Histonlar, kolayca değiştirilebilen çok sayıda lizin ve arginin kalıntısı içerir, bu da histon fonksiyonunu etkileyerek veya diğer hücresel proteinlere bağlanarak kromatin kimyasını değiştiren kapsamlı PTM'lere yol açar21. PTM'ler, çeşitli hastalıklarda, özellikle de .......

Açıklamalar

Melvin A. Park ve Matthew Willetts, timsTOF cihazının üreticisi olan Bruker Daltonics Inc.'in çalışanlarıdır.

Teşekkürler

Bu materyal, Ulusal Bilim Vakfı tarafından Hibe No kapsamında desteklenen çalışmalara dayanmaktadır. HRD-1547798 ve Hibe No. HRD-2111661. Bu NSF Hibeleri, Bilim ve Teknolojide Araştırma Mükemmeliyet Merkezleri (CREST) Programının bir parçası olarak Florida Uluslararası Üniversitesi'ne verildi. Bu, Florida Uluslararası Üniversitesi'nde Seçkin Bir Program olan Çevre Enstitüsü'nden 1672 numaralı katkıdır. Ulusal Sağlık Enstitüsü tarafından Hibe No. kapsamında ek destek sağlanmıştır. R21AI135469 Francisco Fernandez-Lima ve Grant No. R01HD106051 Benjamin A. Garcia'ya ve Ulusal Bilim Vakfı tarafından Hibe No. CHE-2127882'den Benjamin A. Garcia'ya. Yazarlar, ilk yöntem geliş....

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
-80 °C Freezer
1x Phosphate Buffered Saline (PBS), pH 7.4Thermo Fisher Scientific10010023Animal Origin-Free
1 mL Pipette TipsThermo Fisher Scientific94060710Finntip Flex 1000 μL, nonsterile, nonfiltered, racked tips
1.5 mL Microcentrifuge TubesThermo Fisher Scientific14-282-300Use these tubes for the simple and safe processing of sample volumes up to 1.5 mL
10 µL Pipette TipsThermo Fisher Scientific94060100Finntip Flex, 10 μL, nonsterile, non-filtered, racked
10% NP-40Thermo Fisher Scientific28324NP-40 Surfact-Amps Detergent Solution
10x Dulbecco’s PBS without Ca2+/Mg2+(Mediatech)MT21031CM
15 mL Conical TubesCorning352196Falcon Conical Centrifuge Tubes
200 µL Gel-Loading Pipette TipsThermo Fisher Scientific02-707-138Fisherbrand Gel-Loading Tips, 1–200 μL
200 µL Pipette TipsThermo Fisher Scientific94060310Finntip Flex 200μL, nonsterile, nonfiltered, racked tips
2x Laemmli Sample BufferBio-Rad1610737Premixed protein sample buffer for SDS-PAGE
50 mL Conical TubesCorning352070Falcon Conical Centrifuge Tubes
96-well flat bottom plateThermo Fisher Scientific12565501
96-well plate, V-Bottom 600 μLAxygenP-DW-500-C-S
AcetoneSigma Aldrich179124ACS reagent, ≥99.5%
Acetonitrile (ACN)Thermo Fisher ScientificA998HPLC, Fisher Chemical
Acetonitrile with 0.1% Formic acid (v/v), LC/MS GradeThermo Fisher ScientificLS120Optima LC/MS Grade, Thermo Scientific
AEBSFThermo Fisher Scientific328110500AEBSF hydrochloride, 98%
Ammonium bicarbonate, NH4HCO3Sigma Aldrich09830BioUltra, ≥99.5% (T)
Ammonium hydroxide solution, NH4OHSigma AldrichAX1303Meets ACS Specifications, Meets Reagent Specifications for testing USP/NF monographs GR ACS
Argon (Ar)AirgasAR HP 300
BEH C18 HPLC columnWaters186003625XBridge Peptide BEH C18 Column, 300 Å, 5 µm, 4.6 mm X 250 mm, 1K–15K
Bovine Serum Albumin (BSA)Sigma AldrichA7906Heat shock fraction, pH 7, ≥98%
Calcium chloride, CaCl2Sigma AldrichC4901Anhydrous, powder, ≥97%
Cell dissociation bufferThermo Fisher Scientific13151014
Ceramic scoring waferRestek20116
Compass DataAnalysis 6.0Bruker Datonics
Compass HyStar 6.2Bruker Daltonics
Compass IsotopePatternBruker Daltonics
Compass timsControl 4.1Bruker Daltonics
Coomassie Brilliant Blue R-250Bio-Rad1610436
Deep Well, 96-Well Microplate, 2.0 mLThermo Fisher Scientific89237526
Disposable Cell LiftersThermo Fisher Scientific 08100240Fisherbrand Cell Lifters; Disposable lifters quickly remove cell layers
Disposable Pellet PestlesThermo Fisher Scientific12-141-363Fisherbrand Pellet Pestles; Resuspend protein and DNA pellets or grind soft tissue in microcentrifuge tubes
Dithiothreitol (DTT)Thermo Fisher ScientificP23251 M
Formic acid (FA)Sigma Aldrich695076ACS reagent, ≥96%
Fused silica capillary 75 μm ID x 363 μm OD(Molex (Polymicro)TSP075375
Glacial Acetic AcidThermo Fisher ScientificA38SAcetic Acid, Glacial (Certified ACS), Fisher Chemical
Glass Pasteur PipettesSigma AldrichBR747725-1000EA
High-Performance Liquid Chromatograph ShimadzuShimadzu Prominence 20 HPLC UFLC System
Hydrochloric acid, HClSigma Aldrich258148ACS reagent, 37%
Hypercarb 30-40 μm Carbon 150–300 ÅThermo Fisher Scientific60106-402
Hypersep cartridgeThermo Fisher Scientific60109-404
LC/MS Calibration Standard, for ESI-ToFAgilentG1969-85000TuningMix
Magnesium chloride, MgCl2Sigma AldrichM8266Anhydrous, ≥98%
Methanol, for HPLCThermo Fisher ScientificA454Optima for HPLC, Fisher Chemical  
Microcentrifuge Tube AdaptersGL Sciences501021514
MicrocystinThermo Fisher Scientific50-200-8727Enzo Life Sciences Microcystin-LA
MS sample vial, LaPhaPack, Snap, 12 mm x 32 mmLEAP PAL PartsLAP.11190933
NanodropThermo Fisher Scientificmodel: ND3300
Nitrogen (N2)AirgasNI UHP300
PEAKS Studio X+Bioinformatic Solutions
pH indicator strips, InstachekMicro Essential LabJR-113Model: Hydrion
Potassium chloride, KClSigma AldrichP3911ACS reagent, 99.0%–100.5%
Pressure Injection CellNext Advance model: PC77
Propionic AnhydrideSigma Aldrich8.00608For synthesis
Refrigerated Centrifuge (700–18,000 x g)NuAire, model: NuwindNU-C200V
Reprosil-Pur 120 C18-AQ 3 μm, 3 gESI Source Solutionsr13.aq.0003
SDS-PAGE GelsBio-Rad4569035Any kD precast polyacrylamide gel, 8.6 cm × 6.7 cm (W × L), for use with Mini-PROTEAN Electrophoresis Cells
Sodium butyrateThermo Fisher ScientificA11079.0698+%
Sodium chloride, NaClSigma AldrichS9888ACS reagent, ≥99.0%
SPE disk, C18VWR76333-134Empore SPE disk, C18, CDS Analytical, 90 mm x 0.5 mm, 12 µm
SpeedVac+ vacuum pump and plate rotorSavantmodel: SC210A
SucroseMillipore1.07651suitable for microbiology
Sulfuric acid, H2SO4 Sigma Aldrich33974199.999%
TIMS-ToF Mass SpectrometerBruker Daltonicsmodel Tims tof ms
Trichloroacetic acid solution, TCASigma AldrichT06996.1 N
Trifluoroacetic acid (TFA)Sigma Aldrich302031Suitable for HPLC, ≥99.0%
Triversa NanomateAdvionmodel: TR263
TrypsinProtease, MS GradeThermo Fisher Scientific90057
Tube rotatorThermo Fisher Scientific88881001
Vortex MixerThermo Fisher Scientific88880017
Water with 0.1% Formic acid (v/v), LC/MS GradeThermo Fisher ScientificLS118Optima LC/MS Grade, Thermo Scientific 

Referanslar

  1. Zhao, Z., Shilatifard, A. Epigenetic modifications of histones in cancer. Genome Biology. 20, 245 (2019).
  2. Luger, K., Mader, A. W., Richmond, R. K., Sargen, D. F., Richmond, T. J. Crystal structure of the nucleosome core particle at....

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

KimyaSay 203

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır