JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Histon modifikasyonlarının yüksek güvenilirlikli ve yüksek oranda tekrarlanabilir "aşağıdan yukarıya" analizi ve temel parametrelere (alıkonma süresi [RT], çarpışma kesiti [CCS] ve doğru kütle-yük [m/z] oranı) dayalı tanımlama için sıvı kromatografisi, sıkışmış iyon hareketlilik spektrometrisi ve uçuş zamanı kütle spektrometrisine (LC-TIMS-ToF MS/MS) dayalı analitik bir iş akışı.

Özet

Histon proteinleri ökaryotlar arasında oldukça bol miktarda bulunur ve korunur ve posttranslasyonel modifikasyonlar (PTM'ler) olarak bilinen yapıların bir sonucu olarak gen düzenlemesinde büyük rol oynar. Dış veya genetik faktörlere göre her bir PTM'nin veya PTM modelinin konumunu ve doğasını belirlemek, bu bilginin DNA transkripsiyonu, replikasyonu veya onarımı gibi biyolojik tepkilerle istatistiksel olarak ilişkilendirilmesine izin verir. Bu çalışmada, biyolojik örneklerden histon PTM'lerinin tespiti için yüksek verimli bir analitik protokol açıklanmaktadır. Tamamlayıcı sıvı kromatografisi, sıkışmış iyon hareketlilik spektrometrisi ve uçuş zamanı kütle spektrometrisinin (LC-TIMS-ToF MS/MS) kullanımı, biyolojik olarak en ilgili modifikasyonların tek bir analizde ayrılmasını ve PTM atanmasını sağlar. Açıklanan yaklaşım, hareketlilik tuzağında paralel birikim ve ardından sıralı parçalanma ve çarpışma kaynaklı ayrışma kullanarak bağımlı veri toplamadaki (DDA) son gelişmelerden yararlanır. Histon PTM'leri, tutma sürelerine, hareketliliklerine ve parçalanma modellerine göre güvenle atanır.

Giriş

Ökaryotik hücrelerde DNA, kromatin olarak nükleozom adı verilen fonksiyonel birimler halinde paketlenir. Bu birimler dört çekirdek histondan oluşan bir oktamerden oluşur (her biri H2A, H2B, H3 ve H4'ten ikişer)1,2,3,4. Histonlar, gen regülasyonundan büyük ölçüde sorumlu olan ökaryotlarda en bol bulunan ve yüksek oranda korunan proteinler arasındadır5. Histon posttranslasyonel modifikasyonları (PTM'ler), kromatin dinamiğinin düzenlenmesinde büyük rol oynar ve DNA transkripsiyonu, replikasyonu ve onarımı gibi çeşitli biyolojik süreçlerin donatılmasında büyük rol oynar6. PTM'ler öncelikle DNA 3,7 ile temas halinde olan histonların N-terminal bölgelerinin erişilebilir yüzeyinde meydana gelir. Bununla birlikte, kuyruk ve çekirdek modifikasyonları kromatin yapısını etkiler, nükleozomlar arası etkileşimleri değiştirir ve spesifik proteinleri işe alır 3,8.

Sıvı kromatografi-kütle spektrometrisi (LC-MS) tabanlı proteomik sırasındaki güncel bir zorluk, ilgilenilen analitlerin potansiyel birlikte elüsyonudur. Veriye bağlı analizler (DDA) söz konusu olduğunda, bu, MS/MS edinme işlemi sırasında birkaç öncü iyonun potansiyel kaybına dönüşür9. Uçuş süresi (ToF) cihazları çok yüksek frekanstaspektrum alır 9,10 (onlarca kHz'e kadar)11; bu, karmaşık bir numune (MS1) içindeki toplam öncü iyonları hızlı bir şekilde tarayabilmelerini sağlar, böylece optimum hassasiyet ve MS/MS dizileme oranları (100 Hz'e kadar)9 vaat eder ve onları biyolojik numune analizi için ideal hale getirir10. Bununla birlikte, bu yüksek tarama hızlarında mevcut olan hassasiyet, MS/MS hızı9 ile sınırlıdır. Bu sınırlamaları azaltmak için ortogonal dört kutuplu uçuş süresi (qToF) kütle spektrometresi ile birlikte tuzağa düşürülmüş iyon hareketlilik spektrometrisinin (TIMS) eklenmesi kullanıldı. TIMS'de, tüm öncü iyonlar art arda biriktirilir ve dört kutuplu9 ile tek öncü kütleleri seçmek yerine, hareketliliklerinin bir fonksiyonu olarak ayrıştırılır. Paralel birikim-seri parçalanma (PASEF), herhangi bir hassasiyet kaybı olmadan saniyede yüzlerce MS/MS olayına izin verir9.

Bu çalışmanın temel amacı, hareketlilik tuzağında paralel birikim ve ardından sıralı parçalanma ve çarpışma kaynaklı ayrışma (CID) kullanarak DDA'nın son gelişmelerini göstermekti. Histon PTM'leri, tutma sürelerine (RT'ler), hareketliliklerine ve parçalanma modellerine göre güvenle atandı.

Protokol

NOT: Histon örnekleri, Bhanu ve ark. (2020)12.

1. Numune hazırlama

  1. Kültürlenmiş hücrelerin toplanması
    1. Hücreler %80 birleştiğinde, tripan mavisi dışlamasını kullanarak canlı olduklarından emin olun.
      NOT: Bu deneyler için bir HeLa S3 hücre hattı kullanıldı, ancak bu yöntem herhangi bir kültürlenmiş hücreye uygulanabilir.
    2. Ortamı aspire edin, ardından her plakaya 5 mL 1x fosfat tamponlu salin (PBS) uygulayın.
    3. Tüm kalıntı ortamları durulamak için plakaları döndürün, ardından PBS'yi aspire edin ve 5 mL 1x PBS uygulayın.
    4. Hücreleri tek kullanımlık bir hücre kaldırıcı ile kazıyarak plakadan nazikçe ayırın.
    5. Her hücre süspansiyonunu 15 mL'lik bir konik tüpe aktarın.
    6. Hücreleri 5 dakika boyunca 800 x g'da santrifüjleyerek pelet haline getirin.
    7. PBS'yi hücre peletinden aspire edin.
    8. Histon ekstraksiyonuna devam edin.
      NOT: Hemen işlenemiyorsa, hücre peletini sıvı nitrojen içinde hızlı dondurun. Peletleri devam etmeye hazır olana kadar -80 °C'de saklayın.
  2. Histon ekstraksiyonu
    1. Her hücre peletinin hacmini tahmin edin ve menisküsü kalıcı bir işaretleyici ile işaretleyin.
    2. Tüm numuneler için yeterli nükleer izolasyon tamponu (NIB; 15 mM Tris-HCl (pH 7.5), 15 mM NaCl, 60 mM KCl, 5 mM MgCl2, 1 mM CaCl2 ve 250 mM sükroz) hazırlayın. Alternatif olarak, zaman içinde çok sayıda numunenin işlenmesi gerekiyorsa, tamponu toplu olarak yapın ve 2-8 °C'de 6 aya kadar saklayın veya yalnızca her ekstraksiyon için gerekli miktarda çözdürerek süresiz olarak -15 °C ila -25 °C'de saklayın ve dondurun.
      NOT: Depolama sırasında arabellek boş kalmalıdır. Tampon herhangi bir zamanda bulanık veya anormal bir görünüm alırsa, atın ve yeni tampon hazırlayın.
    3. Yıkama tamponunun hücre peletlerinin hacminin 50 katını hazırlayın ve aşağıdaki gibi inhibitörler ekleyin (2 numune başına yaklaşık 10 mL yıkama tamponu).
      1. 10 mL yıkama tamponu hazırlamak için 10 mL NIB, 30 μL 200 mM 4- (2-aminoetil) benzensülfonil florür hidroklorür [AEBSF], 10 μL 1 M ditiyotreitol [DTT], 20 μL 5 μM mikrosistin, 20 μL 5 M sodyum bütirat.
    4. Lizis tamponunu hazırlamak için yıkama tamponunun 1/5'ini çıkarın (yıkama tamponundan 1/5 hacim, %0,3 NP-40 veya NP-40 alternatifi).
      NOT: Bazı hücre tipleri için çok aşındırıcı olabileceğinden, NP-40 veya NP-40 alternatifi yerine Triton-X 100 kullanmayın.
    5. Hücre peletini 5 sütun yıkama tamponunda süspanse ederek ve 800 x g'da 4 °C'de 5 dakika santrifüjleyerek iyice yıkayın. Bu adımı iki kez tamamlayın, süpernatanı yıkamalar arasında aspire edin ve atın.
    6. Hücre peletinin hacminin hala kalıcı bir işaretleyici ile işaretlendiğinden emin olun. 10 hacim lizis tamponunda yeniden süspanse edin.
    7. Her bir peleti yeniden süspanse etmek için pipetle iyice karıştırın, ardından buz üzerinde 15 dakika inkübe edin.
    8. 15 dakika sonra, 4 °C'de 5 dakika boyunca 800 x g'de santrifüjleyin.
    9. Süpernatanı aspire edin ve atın.
      NOT: Pelet, orijinal pelet boyutunun ≤ 1/2'sine kadar küçülmelidir (işaret çizgisiyle gösterildiği gibi). Pelet yeterince azalmadıysa, parçalama prosedürünü tekrarlayın ve hücreleri kırmak için bir havaneli kullanarak hafif bir homojenizasyon adımı ekleyin.
    10. Lizis tamamlandıktan sonra, peleti 500 μL yıkama tamponunda yeniden süspanse edin, ardından 4 °C'de 5 dakika boyunca 800 x g'da santrifüjleyin. Süpernatanı aspire edin ve atın, ardından tüm NP-40 izlerini gidermek için yıkama adımını bir kez daha tekrarlayın.
      NOT: Bu noktada pelet, histonlar içeren kromatinden oluşur.
    11. Pelet, 0.4 N H2S04'lük 5 hacimde (orijinal hücre pelet boyutunda) yeniden süspanse edin.
    12. Bir karıştırıcı kullanarak soğuk bir odada veya buzdolabında 2 saat inkübe edin.
    13. 2 saat sonra, numuneyi/numuneleri 3400 x g'da 5 °C'de 4 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı atmayın.
    14. Süpernatanı yeni tüplere aktarın ve% 100 trikloroasetik asidi (TCA) içeriğin hacminin 1 / 3'üne yükseltin (nihai TCA konsantrasyonu yaklaşık% 20 olacaktır).
    15. Tüpü yavaşça ters çevirin ve berrak, renksiz çözeltinin beyaza ve/veya bulanıklaştığını gözlemleyin, bu da protein çökelmesini gösterir.
      NOT: Düşük histon konsantrasyonlarına sahip çözeltiler için, protein çökelmesi hemen fark edilmeyebilir, ancak çökelti, gece boyunca inkübasyondan sonra görünür olmalıdır.
    16. Histon proteinlerini tamamen çökeltmek için gece boyunca (12-18 saat) 4 ° C'de rahatsız edilmeden inkübe edin.
    17. Ertesi gün, 4 °C'de 5 dakika boyunca 3400 x g'da santrifüjleyin.
    18. Pipet ucuyla tüpün kenarlarına dokunmamaya dikkat ederek süpernatanı aspire edin. Bu aşamada, histonlar öncelikle tüp(ler)in kenarlarında bir film olarak biriktirilir.
    19. Bir cam Pasteur pipeti kullanarak her tüpe 500 μL buz gibi soğuk aseton + %0,1 HCl (asit aseton) ekleyin, ardından tüp(ler)i birkaç kez hafifçe ters çevirin. Bunu yaparken numuneleri sırayla (1, 2, 3 vb.) düzenleyin, çünkü herhangi bir hatalı aseton tüpler üzerindeki işaretleri kaldırabilir. 3400 x g'da 4 °C'de 5 dakika santrifüjleyin ve süpernatanı nazikçe boşaltın.
    20. Bu durulama adımını 500 μL buz gibi %100 asetonla ve ayrıca bir cam Pasteur pipetiyle tekrarlayın. 3400 x g'da 4 °C'de 5 dakika santrifüjleyin ve süpernatanı nazikçe boşaltın.
    21. Kalan aseton buharlaşana kadar tüpleri oda sıcaklığında kurumaya bırakın.
    22. Kuruduğunda, her tüpe 100 μL kütle spektrometresi (MS) sınıfı su ekleyin. Tüm histon filmini yeniden süspanse etmek için kabın her tarafını temizlemek için bu damlacığı kullanın. Bunu, damlacığı tüpün yan tarafına pipetleyerek ve yukarı ve aşağı pipetlerken döndürerek veya 100 μL'nin yarısını dağıtarak ve ucu kullanarak her tarafını karıştırarak yapın. Her iki yöntemin bir kombinasyonu en iyi sonucu verir. Histonlar suda kolayca çözünür ve çözelti içinde olacaktır.
    23. Tüm numuneleri yeniden askıya aldıktan sonra, kalan beyaz katı varsa, 5 dakika boyunca oda sıcaklığında bir banyoda sonikat yapın.
    24. 4 °C'de 5 dakika boyunca 800 x g'da santrifüjleyin. Berrak çözeltiyi taze tüplere aktarın. Kalan çözünmeyen peletleri atın.
    25. Ekstraksiyonun temiz olduğunu doğrulamak için azaltma koşulları altında bir SDS-PAGE çalıştırın.
      NOT: Jeller, proteinleri 10-20 kDa aralığında farklılaştırabildiği sürece herhangi bir uygun poliakrilamid konsantrasyonu kullanılarak çalıştırılabilir. Bu protokolde kullanılan jeller için Malzeme Tablosuna bakın.
    26. Toplam protein konsantrasyonunu belirlemek için bir protein konsantrasyonu testi (yani Bradford veya BCA) gerçekleştirin.
  3. Lizin kalıntılarının kimyasal türevlendirilmesi (propiyonilasyon)
    1. 20 μg histonu (protein tahlili ile belirlenir) temiz bir tüpe aktarın. Bu numuneyi bir vakum yoğunlaştırıcı kullanarak <5 μL'ye kadar kurutun, ardından 20 μL 100 mM amonyum bikarbonat (NH4CO3) (~1μg/μL çözelti) kullanarak yeniden süspanse edin. Gerekirse amonyum hidroksit kullanarak pH'ı ~8'e ayarlayın.
      DİKKAT: Yeniden süspanse etmek için amonyum hidroksit (NH4OH) kullanmayın, sadece gerekirse pH'ı ayarlamak için. Aksi takdirde, proteinler denatüre olur ve çökelir.
      NOT: pH'ı minimum numune kaybıyla kontrol etmek için bir pipet ucu kullanarak numuneyi daldırın ve bir pH şeridine sürün. Bu test prosedürü, kalan numune hazırlama adımları boyunca faydalı olacaktır.
    2. Asetonitril'e (ACN) 1:3 (h/v) oranında propiyonik anhidrit ekleyerek propiyonilasyon reaktifini hazırlayın (yani, 40 μL reaktif yapmak için 10 μL propiyonik anhidrit ile 30 μL ACN'yi birleştirin).
      NOT: Geleneksel olarak, bir propiyonilasyon reaktifinin hazırlanmasında metanol veya izopropanol kullanılmıştır. Propiyonilasyon bir amid oluşum reaksiyonu olduğundan, metanol kullanımından kaynaklanan metil propiyonil ester gibi istenmeyen yan ürünleri ve reaksiyonları önlemek için asetonitril gibi protonik olmayan bir çözücü gereklidir. Reaktifin taze kalması için bir seferde sadece 4 numuneye kadar yeterli propiyonilasyon reaktifi hazırlayın. Reaktifi hazırlandıktan sonra 1-2 dakika içinde kullanın. Reaktif oturduğunda, propiyonik anhidrit herhangi bir ortam nemi ile reaksiyona girecek ve asetik asit oluşmaya başlayacak, bu da reaktifin etkinliğini değiştirebilecek ve reaktif eklendikten sonra histon çözeltisinin pH'ını değiştirecektir.
    3. Her numuneye 1:4 (h/v) propiyonilasyon reaktifi ekleyin (yani, 20 μL histon için 5 μL propiyonilasyon reaktifi ekleyin).
    4. Çözeltinin pH'ını ~8'e yeniden ayarlamak için hızlı bir şekilde 1:5 (h/h)NH4OHekleyin (yani, 20 μL histon çözeltisi için 4 μL ekleyin). PH hala çok düşükse, pH 8'e ulaşılana kadar bir seferde 1-2 μLNH4OHekleyin. Tipik olarak, 1:5 (v/v) oranı yeterlidir.
    5. Numuneleri oda sıcaklığında 15 dakika boyunca rahatsız etmeden inkübe edin.
    6. Minimum asit oluşumunu sağlamak için propiyonilasyon reaksiyonunu, propiyonilasyon reaktifi partisi başına en fazla 3-4 numune için tekrarlayın.
    7. Propiyonilasyon prosedürü 1.3.2-1.3.5 adımlarını tekrarlayın. İkinci bir propiyonilasyon turu, mevcut lizinlerin% >95'inin türetilmesini sağlar.
    8. Numuneleri bir vakum yoğunlaştırıcı kullanarak <5 μL'ye kadar kurutun. Bu,NH4OH'densalınan reaksiyona girmemiş propiyonilasyon reaktifini, asit ürünlerini ve amonyak gazını buharlaştıracaktır. Numuneler tamamen kurursa, önemli numune kayıpları meydana gelmediğinden bu sorun olmaz.
      NOT: Şişede kalan ortam nemi ile temas nedeniyle asetik asit oluşumunu önlemek için saklamadan önce propiyonik anhidrit şişesindeki havayı argon gazı ile değiştirin.
  4. Tripsin ile proteolitik sindirim
    1. 20 μL'lik bir hacim elde etmek için histonları100 mM NH4HCO3'te yeniden süspanse edin ve 1 μg/μL'lik optimal bir konsantrasyon elde edin.
      NOT: 1 μg/μL'den düşük konsantrasyonlara sahip numune çözeltileri, Tripsin verimliliğinin düşmesine neden olacaktır.
    2. Histon örneklerine 1:10 oranında (ağırlıkça/ağırlıkça) tripsin ekleyin (yani, 20 μg histona 2 μL 1 μg/μL tripsin çözeltisi ekleyin).
    3. Reaksiyonları 37 °C'de 6-8 saat inkübe edin. Alternatif olarak, gece boyunca (12-18 saat) oda sıcaklığında inkübe edin.
    4. -80 °C'de en az 1 saat dondurarak sindirimi durdurun.
      NOT: Sindirim reaksiyonunu söndürmek için asit kullanmayın, çünkü bu, prosedürün bu noktasında pH'da istenmeyen bir düşüşe neden olur. Numune, ilerlemeye hazır olana kadar -80 °C'de saklanabilir (Ara durma noktası).
  5. Peptit N-terminallerinin kimyasal türevlendirilmesi (propiyonilasyonu)
    1. Numuneleri bir vakum yoğunlaştırıcı kullanarak <5 μL'ye kadar kurutun.
    2. 100 mM NH4HCO3 kullanarak 20 μL'ye (1 μg/μL) kadar numuneleri yeniden süspanse edin.
    3. Propiyonilasyonu daha önce olduğu gibi tekrarlayın (adım 1.3).
      NOT: Daha yüksek sulu: organik faz oranı nedeniyle numunelerin bu adımda kurumasının daha uzun sürmesi normaldir.
  6. Aşama ipuçları ile numune tuzdan arındırma
    1. Numuneleri 50 μL MS sınıfı su +% 0.1 TFA ile yeniden süspanse edin veya seyreltin.
    2. 11-G'lik bir numune çekirdeği kullanarak, katı faz ekstraksiyon diskinden 5 disk C18 malzemesini delin (pipet ucuna aktarmadan önce 5 diski de delin). Disklerin 200 μL'lik bir pipet ucunun altına güvenli ve eşit bir şekilde sıkıştığından emin olun (Şekil 1).
      NOT: 15 μg'dan fazla tuzdan arındırıyorsanız 25 G çekirdek kullanın.amptek bir s'den s.tage uç.
    3. Sahne uçlarını 1.5 mL veya 2 mL mikrosantrifüj tüplerinde yerinde tutmak için bir santrifüj adaptörü kullanın.
      NOT: Aşağıdaki santrifüj adımları için, bir seferde 4-2 dakika boyunca 4 °C'de yavaş (400-500 x g) devir kullanın; çözücüler, C18 malzemesinin uçlara ne kadar sıkı paketlendiğine bağlı olarak normalde reçineden 1 dakikadan daha kısa sürede geçer.
    4. C 18 malzemesini aktive etmek ve potansiyel kirleticileri gidermek için reçineyi 50 μL %100 asetonitril ile santrifüjleyerek durulayın.
      NOT: Jel yüklemeli pipet uçlarını kullanarak çözeltileri sahne uçlarına yüklemek daha kolay olabilir. C18 malzemesi etkinleştirildikten sonra, tuz giderme prosedürü süresince reçinenin kurumasına izin verilmemesi önemlidir.
    5. Disk malzemesini santrifüjleme ile 80 μL MS sınıfı su +% 0.1 TFA ile dengeleyin.
    6. Buzlu asetik asit kullanarak numuneyi pH 4 veya daha düşük bir değere asitleştirin. Örnek kaybını en aza indirmek için pH'ı daha önce olduğu gibi pH şeritleriyle kontrol edin.
    7. Yavaş santrifüjleme ile numunenin tamamını reçine diskine yükleyin.
    8. Numuneyi santrifüjleme ile 80 μL MS sınıfı su +% 0.1 TFA ile yıkayın.
    9. Yavaş santrifüjleme ile 70 μL %75 asetonitril ve %0,5 asetik asit yıkayarak numuneyi 1,5 mL'lik temiz bir tüpe boşaltın. Tam numune hacminin aşama ucundan ayrılmasını sağlamak için ek santrifüj süresi kullanılabilir. Reçinenin ek santrifüj süresi ile kuruması sorun değildir, çünkü numunenin elüsyonundan sonra artık gerekli değildir.
    10. Her numuneyi bir vakum yoğunlaştırıcıda tamamen kurutun.
      NOT: Numune(ler) devam etmeye hazır olana kadar -80 °C'de saklanabilir (Ara durma noktası).
    11. LC-MS/MS analizi için, numuneleri 0,4 μg/μL'lik nihai konsantrasyonu veren sıvı kromatografi (LC) protokolünden bir Çözücü A hacminde (%0,1 formik asit) sulandırın (yani, 20 μG histonu 50 μL Çözücü A'da çözün).

2. TIMS yazılım arayüzü

  1. Cihaz sekmesini seçin ve Çalıştır'a geçin (cihaz adının yeşil renkle vurgulandığını doğrulayın) (Şekil 2).
  2. TIMS parametrelerini doğrulayın (Şekil 2).
  3. MS Ayarlarını doğrulayın (tarama başlangıcı, tarama sonu, iyon polaritesi, tarama modu) (Şekil 2).
  4. TIMS ayarlarını doğrulayın (mod, mobilite başlangıcı, mobilite sonu, ramp süresi, biriktirme süresi, görev döngüsü, rampa hızı, MS hızı, MS ortalaması ve otomatik kalibrasyon) (Şekil 2).
  5. Kaynak sekmesine gidin ve şırınga seçeneğini etkinleştirin (Hamilton 500 μL) yalnızca TuneMix kalibrasyon adımı için (Şekil 3)13.
  6. Kalibrasyon sekmesine gidin, m/z'ye tıklayın, Kalibrasyon Modu'nu seçin ve modu seçin (Genel olarak Gelişmiş Q), yakınlaştırın (+%0.01) STD Dev (0.24) ve Kalibre Et'e tıklayın; %100'lük bir puan elde edildiğinde kabul edin (Şekil 4).
  7. Mobilite sekmesine gidin ve kalibrasyon işlemini tekrarlayın (genellikle Doğrusal Mod), algılama aralığı (+%5), genişlik (0.1 Da), STD Dev (0.1855), ardından kalibre et'e tıklayın; %98,5≥ bir puan aldığınızda kabul edin (Şekil 5).
  8. Yönteme gidin ve kullanılacak yöntemi seçin; bu örnek için Proteomic_/2023-01-19-CF/20230119-Hela Control histone_prep_pasefDIA_1-24_1_451.d/451.m-TimsControl seçilmiştir (Şekil 5).

3. LC-TIMS-PASEF-ToF MS/MS

  1. Tipik nESI çalışma koşullarını kullanın: 4500 V kapiler gerilim, 800 V uç plakası ofseti, 3,0 bar nebulizatör basıncı, 10,0 L/dk kuru gaz, 200 °C kuru ısıtıcı ve 50 μL/dk enjeksiyon debisi.
  2. Tipik MS ayarlarını kullanın: 6 eV çarpışma enerjisi, 1200 Vpp çarpışma RF, 75 μs aktarım süresi, 5 μs ön darbe depolama.
  3. Giriş hunisi P1 ve çıkış hunisi P2 arasındaki basınç farkını kullanarak sürüklenen gaz akışını belirleyin. TIMS hücresinde paralel birikim-seri parçalanma (PASEF) meydana gelir ve tüm öncü iyonları ayrı ayrı değil, aynı anda biriktirir. Öncü iyonlar daha sonra normalde çok daha geniş olan piklere (yaklaşık 50 kat daha kısa) karşı dar iyon piklerinde salınır, bu da hareketlilik14 yoluyla birlikte elüsyonlu peptitleri ayırırken sinyal-gürültü oranını arttırır.
  4. Proteolitik histon peptitlerini analiz etmek için bir LC-TIMS-ToF MS/MS yöntemi geliştirin. C18 (300 Å, 5 μm, 4,6 mm x 250 mm) sütunla donatılmış yüksek performanslı bir sıvı kromatografını (HPLC) tescilli PASEF teknolojisine sahip ticari bir TIMS-TOF MS cihazıyla birleştirin.
    NOT: Bu sütun boyutunun, daha önce yayınlanmış çalışmalara15,16,17 dayalı olarak, peptit karışımları için hem yüksek hem de düşük pH'ta iyi bir ayırma sağladığı belirlenmiştir.
    1. Enjeksiyon hacmini 20 μL (8 μg) numune ve 0,4 mL/dk akış hızına ayarlayın.
    2. %0,1 formik asit (Çözücü A) içeren su ve %0,1 formik asit (Çözücü B) içeren asetonitril kullanarak 60 dakikalık, doğrusal olmayan bir LC gradyanı çalıştırın. Gradyanı ayarlayın: 2,7 dakika boyunca %10 B, ardından 5,3 dakika içinde %20 B, 4 dakika içinde %28 B, 18 dakika içinde %35 B, 13 dakika içinde %40 B ve 2 dakika sonra %100 B. %100 B'yi 5 dakika basılı tuttuktan sonra, konsantrasyonu 5 dakika içinde %10 B'ye düşürün ve son 5 dakika basılı tutun.
  5. Pozitif iyonizasyon modunda nano-elektrosprey iyonizasyon (nESI) yoluyla HPLC'den TIMS-TOF'a numune elüsyonunu doğrulayın.

4. Veri analizi

  1. Peptit dizilerini ve modifikasyon bölgelerini tanımlayın.
    1. MS-digest aracı altında ProteinProspector [https://prospector.ucsf.edu/prospector/cgi-bin/msform.cgi?form=msdigest] kullanarak teorik bir peptit listesi hazırlayın.
      1. Sindirimin koşullarını (kullanılan enzim), aranan PTM türlerini (örneğin, mono-, di- veya trimetilasyon), aranan peptitlerin boyut aralığını, kütle algılama aralığını ve kaçırılan bölünmelerin potansiyel sayısını göz önünde bulundurarak teorik bir özet gerçekleştirin.
  2. Elde edilen verileri teorik peptitlere dayalı olarak manuel olarak analiz edin (Şekil 6)12.
    1. Her teorik peptit için çeşitli şarj durumlarında (+1 ila +4) kütleler aranır.
    2. Her m/z'nin ilk tanımlamasını takiben, tepe noktasını seçin ve PTM'ler de dahil olmak üzere peptit dizisine dayalı teorik bir parçalanma iyonları listesi kullanarak MS/MS'yi onaylayın.
      NOT: Tanımlanan peptidin hareketliliği daha önce biliniyorsa, bu da doğrulanır.
  3. Çeşitli PTM'lerin nispi bolluklarını hesaplayın ve her bir modifikasyonu belirtilen peptit dizisinin bir yüzdesi olarak rapor edin.
    1. Tespit edilen her PTM'nin nispi bolluğu aşağıdaki denklem kullanılarak hesaplanır:
      Bağıl bolluk = Belirli bir peptit için PTM Alanı / Değiştirilmemiş ve PTM'lerin toplam alanı

Sonuçlar

Aşağıdan yukarıya bir proteomik iş akışı (Şekil 7) tipik olarak aşağıdakileri içerir: ham bir numuneden hedef protein(ler)in ekstraksiyonu, ardından protein(ler)in konsantrasyonunun ölçülmesi ve ardından genellikle jel elektroforezi veya sıvı kromatografisi ile fraksiyonlama. Fraksiyonlamadan sonra, proteinler bir proteolitik enzim (genellikle tripsin) kullanılarak sindirilir ve son olarak, elde edilen peptitlerin kütle spektrometrik analizi ve yerleşik bir veri taban?...

Tartışmalar

Histonlar, dört çekirdek histondan (H2A, H2B, H3 ve H4'ün ikişer tane) oluşan oktamerler şeklinde DNA ile etkileşime girerek kromatin yapısını düzenleyen temel proteinlerdir.20. Histonlar, kolayca değiştirilebilen çok sayıda lizin ve arginin kalıntısı içerir, bu da histon fonksiyonunu etkileyerek veya diğer hücresel proteinlere bağlanarak kromatin kimyasını değiştiren kapsamlı PTM'lere yol açar21. PTM'ler, çeşitli hastalıklarda, özellikle de ...

Açıklamalar

Melvin A. Park ve Matthew Willetts, timsTOF cihazının üreticisi olan Bruker Daltonics Inc.'in çalışanlarıdır.

Teşekkürler

Bu materyal, Ulusal Bilim Vakfı tarafından Hibe No kapsamında desteklenen çalışmalara dayanmaktadır. HRD-1547798 ve Hibe No. HRD-2111661. Bu NSF Hibeleri, Bilim ve Teknolojide Araştırma Mükemmeliyet Merkezleri (CREST) Programının bir parçası olarak Florida Uluslararası Üniversitesi'ne verildi. Bu, Florida Uluslararası Üniversitesi'nde Seçkin Bir Program olan Çevre Enstitüsü'nden 1672 numaralı katkıdır. Ulusal Sağlık Enstitüsü tarafından Hibe No. kapsamında ek destek sağlanmıştır. R21AI135469 Francisco Fernandez-Lima ve Grant No. R01HD106051 Benjamin A. Garcia'ya ve Ulusal Bilim Vakfı tarafından Hibe No. CHE-2127882'den Benjamin A. Garcia'ya. Yazarlar, ilk yöntem geliştirmeleri sırasında Dr. Mario Gomez Hernandez'in ilk desteğini kabul etmek isterler.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
-80 °C Freezer
1x Phosphate Buffered Saline (PBS), pH 7.4Thermo Fisher Scientific10010023Animal Origin-Free
1 mL Pipette TipsThermo Fisher Scientific94060710Finntip Flex 1000 μL, nonsterile, nonfiltered, racked tips
1.5 mL Microcentrifuge TubesThermo Fisher Scientific14-282-300Use these tubes for the simple and safe processing of sample volumes up to 1.5 mL
10 µL Pipette TipsThermo Fisher Scientific94060100Finntip Flex, 10 μL, nonsterile, non-filtered, racked
10% NP-40Thermo Fisher Scientific28324NP-40 Surfact-Amps Detergent Solution
10x Dulbecco’s PBS without Ca2+/Mg2+(Mediatech)MT21031CM
15 mL Conical TubesCorning352196Falcon Conical Centrifuge Tubes
200 µL Gel-Loading Pipette TipsThermo Fisher Scientific02-707-138Fisherbrand Gel-Loading Tips, 1–200 μL
200 µL Pipette TipsThermo Fisher Scientific94060310Finntip Flex 200μL, nonsterile, nonfiltered, racked tips
2x Laemmli Sample BufferBio-Rad1610737Premixed protein sample buffer for SDS-PAGE
50 mL Conical TubesCorning352070Falcon Conical Centrifuge Tubes
96-well flat bottom plateThermo Fisher Scientific12565501
96-well plate, V-Bottom 600 μLAxygenP-DW-500-C-S
AcetoneSigma Aldrich179124ACS reagent, ≥99.5%
Acetonitrile (ACN)Thermo Fisher ScientificA998HPLC, Fisher Chemical
Acetonitrile with 0.1% Formic acid (v/v), LC/MS GradeThermo Fisher ScientificLS120Optima LC/MS Grade, Thermo Scientific
AEBSFThermo Fisher Scientific328110500AEBSF hydrochloride, 98%
Ammonium bicarbonate, NH4HCO3Sigma Aldrich09830BioUltra, ≥99.5% (T)
Ammonium hydroxide solution, NH4OHSigma AldrichAX1303Meets ACS Specifications, Meets Reagent Specifications for testing USP/NF monographs GR ACS
Argon (Ar)AirgasAR HP 300
BEH C18 HPLC columnWaters186003625XBridge Peptide BEH C18 Column, 300 Å, 5 µm, 4.6 mm X 250 mm, 1K–15K
Bovine Serum Albumin (BSA)Sigma AldrichA7906Heat shock fraction, pH 7, ≥98%
Calcium chloride, CaCl2Sigma AldrichC4901Anhydrous, powder, ≥97%
Cell dissociation bufferThermo Fisher Scientific13151014
Ceramic scoring waferRestek20116
Compass DataAnalysis 6.0Bruker Datonics
Compass HyStar 6.2Bruker Daltonics
Compass IsotopePatternBruker Daltonics
Compass timsControl 4.1Bruker Daltonics
Coomassie Brilliant Blue R-250Bio-Rad1610436
Deep Well, 96-Well Microplate, 2.0 mLThermo Fisher Scientific89237526
Disposable Cell LiftersThermo Fisher Scientific 08100240Fisherbrand Cell Lifters; Disposable lifters quickly remove cell layers
Disposable Pellet PestlesThermo Fisher Scientific12-141-363Fisherbrand Pellet Pestles; Resuspend protein and DNA pellets or grind soft tissue in microcentrifuge tubes
Dithiothreitol (DTT)Thermo Fisher ScientificP23251 M
Formic acid (FA)Sigma Aldrich695076ACS reagent, ≥96%
Fused silica capillary 75 μm ID x 363 μm OD(Molex (Polymicro)TSP075375
Glacial Acetic AcidThermo Fisher ScientificA38SAcetic Acid, Glacial (Certified ACS), Fisher Chemical
Glass Pasteur PipettesSigma AldrichBR747725-1000EA
High-Performance Liquid Chromatograph ShimadzuShimadzu Prominence 20 HPLC UFLC System
Hydrochloric acid, HClSigma Aldrich258148ACS reagent, 37%
Hypercarb 30-40 μm Carbon 150–300 ÅThermo Fisher Scientific60106-402
Hypersep cartridgeThermo Fisher Scientific60109-404
LC/MS Calibration Standard, for ESI-ToFAgilentG1969-85000TuningMix
Magnesium chloride, MgCl2Sigma AldrichM8266Anhydrous, ≥98%
Methanol, for HPLCThermo Fisher ScientificA454Optima for HPLC, Fisher Chemical  
Microcentrifuge Tube AdaptersGL Sciences501021514
MicrocystinThermo Fisher Scientific50-200-8727Enzo Life Sciences Microcystin-LA
MS sample vial, LaPhaPack, Snap, 12 mm x 32 mmLEAP PAL PartsLAP.11190933
NanodropThermo Fisher Scientificmodel: ND3300
Nitrogen (N2)AirgasNI UHP300
PEAKS Studio X+Bioinformatic Solutions
pH indicator strips, InstachekMicro Essential LabJR-113Model: Hydrion
Potassium chloride, KClSigma AldrichP3911ACS reagent, 99.0%–100.5%
Pressure Injection CellNext Advance model: PC77
Propionic AnhydrideSigma Aldrich8.00608For synthesis
Refrigerated Centrifuge (700–18,000 x g)NuAire, model: NuwindNU-C200V
Reprosil-Pur 120 C18-AQ 3 μm, 3 gESI Source Solutionsr13.aq.0003
SDS-PAGE GelsBio-Rad4569035Any kD precast polyacrylamide gel, 8.6 cm × 6.7 cm (W × L), for use with Mini-PROTEAN Electrophoresis Cells
Sodium butyrateThermo Fisher ScientificA11079.0698+%
Sodium chloride, NaClSigma AldrichS9888ACS reagent, ≥99.0%
SPE disk, C18VWR76333-134Empore SPE disk, C18, CDS Analytical, 90 mm x 0.5 mm, 12 µm
SpeedVac+ vacuum pump and plate rotorSavantmodel: SC210A
SucroseMillipore1.07651suitable for microbiology
Sulfuric acid, H2SO4 Sigma Aldrich33974199.999%
TIMS-ToF Mass SpectrometerBruker Daltonicsmodel Tims tof ms
Trichloroacetic acid solution, TCASigma AldrichT06996.1 N
Trifluoroacetic acid (TFA)Sigma Aldrich302031Suitable for HPLC, ≥99.0%
Triversa NanomateAdvionmodel: TR263
TrypsinProtease, MS GradeThermo Fisher Scientific90057
Tube rotatorThermo Fisher Scientific88881001
Vortex MixerThermo Fisher Scientific88880017
Water with 0.1% Formic acid (v/v), LC/MS GradeThermo Fisher ScientificLS118Optima LC/MS Grade, Thermo Scientific 

Referanslar

  1. Zhao, Z., Shilatifard, A. Epigenetic modifications of histones in cancer. Genome Biology. 20, 245 (2019).
  2. Luger, K., Mader, A. W., Richmond, R. K., Sargen, D. F., Richmond, T. J. Crystal structure of the nucleosome core particle at 2.8 Å resolution. Nature. 389 (6648), 251-260 (1997).
  3. Bentley, G. A., Lewit-Bentley, A., Finch, J. T., Podjarny, A. D., Roth, M. Crystal structure of the nucleosome core particle at 16 Å resolution. Journal of Molecular Biology. 176 (1), 55-75 (1984).
  4. Kornberg, R. D., Thomas, J. O. Chromatin structure: Oligomers of the histones: The histones comprise an (F2A1)2(F3)2 tetramer, a different oligomer of F2A2 and F2B, and monomer of F1. Science. 184 (4139), 865-868 (1974).
  5. Borghini, A., Cervelli, T., Galli, A., Andreassi, M. G. DNA modifications in atherosclerosis: From the past to the future. Atherosclerosis. 230 (2), 202-209 (2013).
  6. Jeanne Dit Fouque, K., et al. 34;Double-Down" mass spectrometry of histone H4 proteoforms: Tandem ultraviolet-photon and mobility/mass-selected electron capture dissociations. Analytical Chemistry. 94 (44), 15377-15385 (2022).
  7. Lawrence, M., Daujat, S., Schneider, R. Lateral thinking: How histone modifications regulate gene expression. Trends in Genetics. 32 (1), 42-56 (2016).
  8. Bannister, A. J., Kouzarides, T. Regulation of chromatin by histone modifications. Cell Research. 21 (3), 381-395 (2011).
  9. Meier, F., et al. Parallel accumulation-serial fragmentation (PASEF): Multiplying sequencing speed and sensitivity by synchronized scans in a trapped ion mobility device. Journal of Proteome Research. 14 (12), 5378-5387 (2015).
  10. Chernushevich, I. V., Loboda, A. V., Thomson, B. A. An introduction to quadrupole-time-of-flight mass spectrometry. Journal of Mass Spectrometry. 36 (8), 849-865 (2001).
  11. Andrews, G. L., Simons, B. L., Young, J. B., Hawridge, A. M., Muddiman, D. C. Performance characteristics of a new hybrid quadrupole time-of-flight tandem mass spectrometer (TripleTOF 5600). Analytical Chemistry. 83 (13), 5442-5446 (2011).
  12. Bhanu, N. V., Sidoli, S., Garcia, B. A Workflow for ultra-rapid analysis of histone posttranslational modifications with direct-injection mass spectrometry. Bio-Protocol. 10 (18), e3756 (2020).
  13. Xue, A., et al. Discovery of serum biomarkers for pancreatic adenocarcinoma using proteomic analysis. British Journal of Cancer. 103 (3), 391-400 (2010).
  14. Wang, Y., et al. Reversed-phase chromatography with multiple fraction concatenation strategy for proteome profiling of human MCF10S cells. Proteomics. 11 (10), 2019-2026 (2011).
  15. Mertins, P., et al. Integrated proteomic analysis of posttranslational modifications by serial enrichment. Nature Methods. 10 (7), 634-637 (2012).
  16. Meier, F., Park, M. A., Mann, M. Trapped ion mobility spectrometry and parallel accumulation-serial fragmentation in proteomics. Molecular & Cellular Proteomics. 20, 100138 (2021).
  17. Romson, J., Emmer, A. Mass calibration options for accurate electrospray ionization mass spectrometry. International Journal of Mass Spectrometry. 467, 11619 (2021).
  18. Dupree, E. J., Jayathirtha, M., Yorkie, H., Mihasan, M., Petre, B. A., Darie, C. C. A critical review of bottom-up proteomics: The good, the bad, and the future of this field. Proteomes. 8 (3), 14 (2020).
  19. Ho, C. M., et al. Bottom-up structural proteomics: cryoEM of protein complexes enriched from the cellular milieu. Nature Methods. 17 (1), 79-85 (2020).
  20. Eickbush, T., Moudrianakis, E. The histone core complex: an octamer assembled by two sets of protein-protein interactions. Biochemistry. 17 (23), 4955-4964 (1978).
  21. Sadakierska-Chudy, A., Filip, M. A Comprehensive view of the epigenetic landscape. Part II: Histone posttranslational modification, nucleosome level, and chromatin regulation by ncRNAs. Neurotoxicity Research. 27 (2), 172-197 (2015).
  22. Tan, H. T., Low, J., Lim, S. G., Chung, M. C. M. Serum autoantibodies as biomarkers for early cancer detection. The FEBS Journal. 276 (23), 6880-6904 (2009).
  23. Huang, R. X., Zhou, P. K. DNA damage response pathways and targets for radiotherapy sensitization in cancer. Signal Transduction and Targeted Therapy. 5 (1), 60 (2020).
  24. Dantuma, N. P., van Attikum, H. Spatiotemporal regulation of posttranslational modifications in the DNA damage response. The EMBO Journal. 35 (1), 6-23 (2016).
  25. Tanner, S., Pevzner, P. A., Bafna, V. Unrestrictive identification of posttranslational modifications through peptide mass spectrometry. Nature Protocols. 1 (1), 67-72 (2006).
  26. Dolan, J. LC column problems everywhere 1. LCGC North America. 28 (9), 500-504 (2015).
  27. Brusniak, M. K., et al. An assessment of current bioinformatic solutions for analyzing LC-MS data acquired by selected reaction monitoring technology. Proteomics. 12 (8), 1176-1184 (2012).
  28. Cham, J. A., Bianco, L., Bessant, C. Free computational resources for designing selected reaction monitoring transitions. Proteomics. 10 (6), 1106-1126 (2010).
  29. Colangelo, C. M., Chung, L., Bruce, C., Cheung, K. Review of software tools for design and analysis of large scale MRM proteomic datasets. Methods. 61, 287-298 (2013).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

KimyaSay 203

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır