JoVE 비디오를 활용하시려면 도서관을 통한 기관 구독이 필요합니다. 전체 비디오를 보시려면 로그인하거나 무료 트라이얼을 시작하세요.
액체 크로마토그래피, Trapped Ion Mobility Spectrometry 및 Time-Of-Flight Mass Spectrometry를 사용한 Histone Modification Screening
요약
액체 크로마토그래피, 포획 이온 이동도 분광법 및 비행 시간 질량 분석법(LC-TIMS-ToF MS/MS)을 기반으로 하는 분석 워크플로우는 주요 매개변수(머무름 시간[RT], 충돌 단면[CCS] 및 정확한 질량 대 전하[m/z] 비율)를 기반으로 히스톤 변형 및 식별에 대한 높은 신뢰도와 재현성 있는 "상향식" 분석을 제공합니다.
초록
히스톤 단백질은 진핵생물 사이에서 매우 풍부하고 보존되어 있으며 번역 후 변형(PTM)으로 알려진 구조의 결과로 유전자 조절에 큰 역할을 합니다. 외부 또는 유전적 요인과 관련하여 각 PTM의 위치 및 특성 또는 PTM 패턴을 식별하면 이 정보를 DNA 전사, 복제 또는 복구와 같은 생물학적 반응과 통계적으로 연관시킬 수 있습니다. 본 연구에서는 생물학적 샘플에서 히스톤 PTM을 검출하기 위한 고처리량 분석 프로토콜에 대해 설명합니다. 상보적 액체 크로마토그래피, 포획 이온 이동성 분광법 및 ToF(Time-of-Flight) 질량분석법(LC-TIMS-ToF MS/MS)을 사용하면 단일 분석에서 생물학적으로 가장 관련성이 높은 변형을 분리하고 PTM을 할당할 수 있습니다. 설명된 접근 방식은 이동성 트랩에서 병렬 축적을 사용한 후 순차적 단편화 및 충돌 유도 해리를 사용하는 종속 데이터 수집(DDA)의 최근 개발을 활용합니다. Histone PTM은 머무름 시간, 이동성 및 단편화 패턴에 따라 자신 있게 할당됩니다.
서문
진핵 세포에서 DNA는 뉴클레오솜(nucleosome)이라고 하는 기능적 단위로 염색질로 포장됩니다. 이 단위는 4 개의 코어 히스톤 (H2A, H2B, H3 및 H4 각각 2 개) 1,2,3,4의 옥타머로 구성됩니다. 히스톤은 진핵생물에서 가장 풍부하고 고도로 보존된 단백질 중 하나로, 유전자 조절에 크게 관여한다5. 히스톤 번역후 변형(PTM)은 염색질 역학의 조절에 큰 역할을 하며 DNA 전사, 복제 및 복구와 같은 다양한 생물학적 과정을 조작한다6. PTM은 주로 DNA 3,7과 접촉하는 히스톤의 N- 말단 영역의 접근 가능한 표면에서 발생합니다. 그러나 꼬리와 코어 변형은 염색질 구조에 영향을 미쳐 뉴클레오솜 간 상호 작용을 변경하고 특정 단백질을 모집합니다 3,8....
프로토콜
참고: 히스톤 샘플은 Bhanu et al. (2020)12에서 채택된 방법을 사용하여 추출되었습니다.
1. 샘플 준비
- 배양된 세포 채취
- 세포가 80% 합류하면 트리판 블루 배제를 사용하여 세포가 생존 가능한지 확인합니다.
참고: 이 실험에는 HeLa S3 세포주가 사용되었지만, 이 방법은 모든 배양 세포에 적용할 수 있습니다. - 배지를 흡인한 다음 각 플레이트에 5mL의 1x 인산염 완충 식염수(PBS)를 적용합니다.
- 플레이트를 소용돌이쳐 잔류 배지를 모두 헹군 다음 PBS를 흡입하고 5mL의 1x PBS를 적용합니다.
- 일회용 셀 리프터로 세포를 긁어 플레이트에서 세포를 부드럽게 분리합니다.
- 각 세포 현탁액을 15mL 코니컬 튜브에 옮깁니다.
- 800 x g 에서 5분 동안 원심분리하여 세포를 펠렛화합니다.
- 세포 펠릿에서 PBS를 흡입합니다.
- 히스톤 추출을 진행합니다.
알림: 즉시 처리할 수 없는 경우 세포 펠릿을 액체 질소에 급속 동결하십시오. 진행할 준비가 될 때까지 펠릿을 -....
- 세포가 80% 합류하면 트리판 블루 배제를 사용하여 세포가 생존 가능한지 확인합니다.
대표적 결과
상향식 단백질체학 워크플로우(그림 7)에는 일반적으로 미처리 샘플에서 표적 단백질을 추출한 다음 단백질의 농도를 정량화한 다음 일반적으로 겔 전기영동 또는 액체 크로마토그래피를 통한 분획이 포함됩니다. 분획 후, 단백질은 단백질 분해 효소(종종 트립신)를 사용하여 절단되고, 마지막으로 생성된 펩티드의 질량 분석 및 확립된 데이터베이스18을 ?.......
토론
히스톤은 4개의 핵심 히스톤(H2A, H2B, H3 및 H4 각각 2개)으로 구성된 옥타머 형태의 DNA와 상호 작용하여 염색질 구조를 조절하는 염기성 단백질입니다.20. 히스톤에는 수많은 라이신 및 아르기닌 잔기가 포함되어 있으며, 이는 쉽게 변형되어 히스톤 기능에 영향을 미치거나 다른 세포 단백질에 결합하여 염색질 화학을 변화시키는 광범위한 PTM을 유발합니다21. PTM은.......
공개
멜빈 A. 파크(Melvin A. Park)와 매튜 윌렛츠(Matthew Willetts)는 timsTOF 악기 제조업체인 Bruker Daltonics Inc.의 직원입니다.
감사의 말
이 자료는 미국 국립과학재단(National Science Foundation)의 보조금 번호(Grant No.) HRD-1547798 및 보조금 번호 HRD-2111661입니다. 이 NSF 보조금은 CREST(Centers of Research Excellence in Science and Technology) 프로그램의 일환으로 Florida International University에 수여되었습니다. 이것은 Florida International University의 탁월한 프로그램인 Institute of Environment의 기부 번호 1672입니다. 추가 지원은 미국 국립보건원(National Institute of Health)에서 보조금 번호로 제공되었습니다. 프란시스코 페르난데스-리마(Francisco Fernandez-Lima)와 그랜트 번호(Grant No.)R21AI135469 벤자민 A. 가르시아(Benjamin A. Garcia)와 국립과학재단(National Science Foundation)의 그랜트 번호(Grant No.)R01HD106051 CHE-2127882에서 Benjamin A. Garcia에게. 저자는 초기 분석법 개발 과정에서 Mario Gomez Hernandez박사의 초기 지원에 감사를 표하고자 합니다.
....자료
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| -80 °C Freezer | |||
| 1x Phosphate Buffered Saline (PBS), pH 7.4 | Thermo Fisher Scientific | 10010023 | Animal Origin-Free |
| 1 mL Pipette Tips | Thermo Fisher Scientific | 94060710 | Finntip Flex 1000 μL, nonsterile, nonfiltered, racked tips |
| 1.5 mL Microcentrifuge Tubes | Thermo Fisher Scientific | 14-282-300 | Use these tubes for the simple and safe processing of sample volumes up to 1.5 mL |
| 10 µL Pipette Tips | Thermo Fisher Scientific | 94060100 | Finntip Flex, 10 μL, nonsterile, non-filtered, racked |
| 10% NP-40 | Thermo Fisher Scientific | 28324 | NP-40 Surfact-Amps Detergent Solution |
| 10x Dulbecco’s PBS without Ca2+/Mg2+ | (Mediatech) | MT21031CM | |
| 15 mL Conical Tubes | Corning | 352196 | Falcon Conical Centrifuge Tubes |
| 200 µL Gel-Loading Pipette Tips | Thermo Fisher Scientific | 02-707-138 | Fisherbrand Gel-Loading Tips, 1–200 μL |
| 200 µL Pipette Tips | Thermo Fisher Scientific | 94060310 | Finntip Flex 200μL, nonsterile, nonfiltered, racked tips |
| 2x Laemmli Sample Buffer | Bio-Rad | 1610737 | Premixed protein sample buffer for SDS-PAGE |
| 50 mL Conical Tubes | Corning | 352070 | Falcon Conical Centrifuge Tubes |
| 96-well flat bottom plate | Thermo Fisher Scientific | 12565501 | |
| 96-well plate, V-Bottom 600 μL | Axygen | P-DW-500-C-S | |
| Acetone | Sigma Aldrich | 179124 | ACS reagent, ≥99.5% |
| Acetonitrile (ACN) | Thermo Fisher Scientific | A998 | HPLC, Fisher Chemical |
| Acetonitrile with 0.1% Formic acid (v/v), LC/MS Grade | Thermo Fisher Scientific | LS120 | Optima LC/MS Grade, Thermo Scientific |
| AEBSF | Thermo Fisher Scientific | 328110500 | AEBSF hydrochloride, 98% |
| Ammonium bicarbonate, NH4HCO3 | Sigma Aldrich | 09830 | BioUltra, ≥99.5% (T) |
| Ammonium hydroxide solution, NH4OH | Sigma Aldrich | AX1303 | Meets ACS Specifications, Meets Reagent Specifications for testing USP/NF monographs GR ACS |
| Argon (Ar) | Airgas | AR HP 300 | |
| BEH C18 HPLC column | Waters | 186003625 | XBridge Peptide BEH C18 Column, 300 Å, 5 µm, 4.6 mm X 250 mm, 1K–15K |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma Aldrich | A7906 | Heat shock fraction, pH 7, ≥98% |
| Calcium chloride, CaCl2 | Sigma Aldrich | C4901 | Anhydrous, powder, ≥97% |
| Cell dissociation buffer | Thermo Fisher Scientific | 13151014 | |
| Ceramic scoring wafer | Restek | 20116 | |
| Compass DataAnalysis 6.0 | Bruker Datonics | ||
| Compass HyStar 6.2 | Bruker Daltonics | ||
| Compass IsotopePattern | Bruker Daltonics | ||
| Compass timsControl 4.1 | Bruker Daltonics | ||
| Coomassie Brilliant Blue R-250 | Bio-Rad | 1610436 | |
| Deep Well, 96-Well Microplate, 2.0 mL | Thermo Fisher Scientific | 89237526 | |
| Disposable Cell Lifters | Thermo Fisher Scientific | 08100240 | Fisherbrand Cell Lifters; Disposable lifters quickly remove cell layers |
| Disposable Pellet Pestles | Thermo Fisher Scientific | 12-141-363 | Fisherbrand Pellet Pestles; Resuspend protein and DNA pellets or grind soft tissue in microcentrifuge tubes |
| Dithiothreitol (DTT) | Thermo Fisher Scientific | P2325 | 1 M |
| Formic acid (FA) | Sigma Aldrich | 695076 | ACS reagent, ≥96% |
| Fused silica capillary 75 μm ID x 363 μm OD | (Molex (Polymicro) | TSP075375 | |
| Glacial Acetic Acid | Thermo Fisher Scientific | A38S | Acetic Acid, Glacial (Certified ACS), Fisher Chemical |
| Glass Pasteur Pipettes | Sigma Aldrich | BR747725-1000EA | |
| High-Performance Liquid Chromatograph | Shimadzu | Shimadzu Prominence 20 HPLC UFLC System | |
| Hydrochloric acid, HCl | Sigma Aldrich | 258148 | ACS reagent, 37% |
| Hypercarb 30-40 μm Carbon 150–300 Å | Thermo Fisher Scientific | 60106-402 | |
| Hypersep cartridge | Thermo Fisher Scientific | 60109-404 | |
| LC/MS Calibration Standard, for ESI-ToF | Agilent | G1969-85000 | TuningMix |
| Magnesium chloride, MgCl2 | Sigma Aldrich | M8266 | Anhydrous, ≥98% |
| Methanol, for HPLC | Thermo Fisher Scientific | A454 | Optima for HPLC, Fisher Chemical |
| Microcentrifuge Tube Adapters | GL Sciences | 501021514 | |
| Microcystin | Thermo Fisher Scientific | 50-200-8727 | Enzo Life Sciences Microcystin-LA |
| MS sample vial, LaPhaPack, Snap, 12 mm x 32 mm | LEAP PAL Parts | LAP.11190933 | |
| Nanodrop | Thermo Fisher Scientific | model: ND3300 | |
| Nitrogen (N2) | Airgas | NI UHP300 | |
| PEAKS Studio X+ | Bioinformatic Solutions | ||
| pH indicator strips, Instachek | Micro Essential Lab | JR-113 | Model: Hydrion |
| Potassium chloride, KCl | Sigma Aldrich | P3911 | ACS reagent, 99.0%–100.5% |
| Pressure Injection Cell | Next Advance | model: PC77 | |
| Propionic Anhydride | Sigma Aldrich | 8.00608 | For synthesis |
| Refrigerated Centrifuge (700–18,000 x g) | NuAire, model: Nuwind | NU-C200V | |
| Reprosil-Pur 120 C18-AQ 3 μm, 3 g | ESI Source Solutions | r13.aq.0003 | |
| SDS-PAGE Gels | Bio-Rad | 4569035 | Any kD precast polyacrylamide gel, 8.6 cm × 6.7 cm (W × L), for use with Mini-PROTEAN Electrophoresis Cells |
| Sodium butyrate | Thermo Fisher Scientific | A11079.06 | 98+% |
| Sodium chloride, NaCl | Sigma Aldrich | S9888 | ACS reagent, ≥99.0% |
| SPE disk, C18 | VWR | 76333-134 | Empore SPE disk, C18, CDS Analytical, 90 mm x 0.5 mm, 12 µm |
| SpeedVac+ vacuum pump and plate rotor | Savant | model: SC210A | |
| Sucrose | Millipore | 1.07651 | suitable for microbiology |
| Sulfuric acid, H2SO4 | Sigma Aldrich | 339741 | 99.999% |
| TIMS-ToF Mass Spectrometer | Bruker Daltonics | model Tims tof ms | |
| Trichloroacetic acid solution, TCA | Sigma Aldrich | T0699 | 6.1 N |
| Trifluoroacetic acid (TFA) | Sigma Aldrich | 302031 | Suitable for HPLC, ≥99.0% |
| Triversa Nanomate | Advion | model: TR263 | |
| TrypsinProtease, MS Grade | Thermo Fisher Scientific | 90057 | |
| Tube rotator | Thermo Fisher Scientific | 88881001 | |
| Vortex Mixer | Thermo Fisher Scientific | 88880017 | |
| Water with 0.1% Formic acid (v/v), LC/MS Grade | Thermo Fisher Scientific | LS118 | Optima LC/MS Grade, Thermo Scientific |
참고문헌
- Zhao, Z., Shilatifard, A. Epigenetic modifications of histones in cancer. Genome Biology. 20, 245 (2019).
- Luger, K., Mader, A. W., Richmond, R. K., Sargen, D. F., Richmond, T. J. Crystal structure of the nucleosome core particle at....
재인쇄 및 허가
JoVE'article의 텍스트 или 그림을 다시 사용하시려면 허가 살펴보기
허가 살펴보기더 많은 기사 탐색
This article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. 판권 소유