JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Аналитический рабочий процесс, основанный на жидкостной хроматографии, спектрометрии подвижности захваченных ионов и времяпролетной масс-спектрометрии (LC-TIMS-ToF MS/MS) для высокодостоверного и высоковоспроизводимого анализа модификаций гистонов «снизу вверх» и идентификации на основе основных параметров (время удержания [RT], поперечное сечение столкновения [CCS] и точное отношение массы к заряду [m/z]).

Аннотация

Белки гистонов очень распространены и консервативны среди эукариот и играют большую роль в регуляции генов в результате структур, известных как посттрансляционные модификации (PTM). Идентификация положения и природы каждого ПТМ или паттерна ПТМ в связи с внешними или генетическими факторами позволяет статистически коррелировать эту информацию с биологическими реакциями, такими как транскрипция, репликация или репарация ДНК. В настоящей работе описан высокопроизводительный аналитический протокол детектирования гистоновых ПТМ из биологических образцов. Использование комплементарной жидкостной хроматографии, спектрометрии подвижности захваченных ионов и времяпролетной масс-спектрометрии (ЖХ-ТИМС-TOF МС/МС) позволяет разделять и присваивать ПТМ наиболее биологически значимые модификации в одном анализе. Описанный подход использует преимущества последних разработок в области зависимого сбора данных (DDA) с использованием параллельного накопления в ловушке подвижности с последующей последовательной фрагментацией и диссоциацией, вызванной столкновением. ПТМ гистонов надежно назначаются в зависимости от времени их удержания, подвижности и характера фрагментации.

Введение

В эукариотических клетках ДНК упакована в виде хроматина в функциональные единицы, называемые нуклеосомами. Эти единицы состоят из октамера из четырех основных гистонов (по два H2A, H2B, H3 и H4)1,2,3,4. Гистоны являются одними из самых распространенных и высококонсервативных белков у эукариот, которые в значительной степени ответственныза регуляцию генов. Посттрансляционные модификации гистонов (ПТМ) играют большую роль в регуляции динамики хроматина и управляют различными биологическими процессами, такими как транскрипция, репликацияи репарация ДНК. ПТМ встречаются в основном на доступной поверхности N-концевых участков гистонов, контактирующих с ДНК 3,7. Однако модификации хвоста и ядра влияют на структуру хроматина, изменяя межнуклеосомные взаимодействия и рекрутируя специфические белки 3,8.

Актуальной проблемой при протеомике на основе жидкостной хромато-масс-спектрометрии (ЖХ-МС) является потенциальное совместное элюирование интересующих аналитов. В случае анализа, зависящего от данных (DDA), это приводит к потенциальной потере нескольких ионов-предшественников в процессе регистрации MS/MS9. Времяпролетные приборы (ToF) регистрируют спектры на очень высокой частоте 9,10 (до десятков кГц)11; Это делает их способными быстро сканировать общее количество ионов-предшественников в комплексном образце (MS1), что обеспечивает оптимальную чувствительность и скорость секвенирования MS/MS (до 100 Гц)9 и делает их идеальными для анализа биологическихобразцов10. Тем не менее, чувствительность, доступная при таких высоких скоростях сканирования, ограничена скоростью MS/MS9. Для смягчения этих ограничений было использовано добавление спектрометрии подвижности захваченных ионов (TIMS) в сочетании с ортогональным квадрупольным времяпролетным масс-спектрометром (qToF). В TIMS все ионы-предшественники накапливаются в тандеме и элюируются в зависимости от их подвижности, а не выбирают одиночные массы прекурсоров с помощью квадруполя9. Параллельная последовательная фрагментация накопления (PASEF) позволяет обрабатывать сотни событий MS/MS в секунду без потери чувствительности9.

Основная цель данной работы состояла в том, чтобы показать последние разработки ДДА с использованием параллельного накопления в ловушке подвижности с последующей последовательной фрагментацией и диссоциацией, индуцированной столкновением (CID). ПТМ гистонов были уверенно распределены на основе их времени удержания (RT), подвижности и характера фрагментации.

протокол

ПРИМЕЧАНИЕ: Образцы гистонов были извлечены с использованием метода, адаптированного из Bhanu et al. (2020)12.

1. Пробоподготовка

  1. Сбор культивируемых клеток
    1. Когда клетки сливаются на 80%, убедитесь, что они жизнеспособны, используя исключение трипанового синего.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для этих экспериментов использовалась клеточная линия HeLa S3, но этот метод может быть применен к любым культивируемым клеткам.
    2. Аспирируйте среду, затем нанесите 5 мл 1x фосфатно-солевого буфера (PBS) на каждую пластину.
    3. Вкрутите пластину (пластины), чтобы промыть все остатки среды, затем аспирируйте PBS и нанесите 5 мл 1x PBS.
    4. Аккуратно отделите клетки от пластины, соскоблив их одноразовым подъемником клеток.
    5. Переложите каждую клеточную суспензию в коническую пробирку объемом 15 мл.
    6. Гранулируйте клетки центрифугированием при 800 x g в течение 5 мин.
    7. Аспирируйте PBS из клеточной гранулы.
    8. Приступают к экстракции гистонов.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Мгновенная заморозка гранул ячейки в жидком азоте, если она не может быть обработана немедленно. Храните гранулы при температуре -80 °C до тех пор, пока они не будут готовы к работе.
  2. Экстракция гистонов
    1. Оцените объем каждой гранулы клетки и отметьте мениск перманентным маркером.
    2. Для всех образцов подготовьте достаточное количество ядерного изоляционного буфера (NIB; 15 мМ Tris-HCl (pH 7,5), 15 мМ NaCl, 60 мМ KCl, 5 мМ MgCl2, 1 мМCaCl2 и 250 мМ сахарозы). В качестве альтернативы, если необходимо обработать много образцов в течение длительного времени, сделайте буфер навалом и храните при температуре 2-8 °C до 6 месяцев или аликвотируйте и замораживайте при температуре от -15 °C до -25 °C неограниченное время, размораживая только количество, необходимое для каждой экстракции.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Буфер должен оставаться чистым во время хранения. Если буфер приобретет мутный или другой ненормальный вид в любое время, выбросьте и приготовьте новый буфер.
    3. Приготовьте гранулы, в 50 раз превышающие объем клеточных гранул промывочного буфера, и добавьте ингибиторы следующим образом (примерно 10 мл промывочного буфера на 2 образца).
      1. Для приготовления 10 мл промывочного буфера смешают 10 мл NIB, 30 мкл 200 мМ 4-(2-аминоэтил)бензолсульфонилфторида гидрохлорида [AEBSF], 10 мкл 1 М дитиотрейтола [DTT], 20 мкл 5 мкМ микроцистина, 20 мкл 5 М бутирата натрия.
    4. Удалите 1/5 промывочного буфера для приготовления буфера лизиса (1/5 объема из промывочного буфера, 0,3% альтернатива NP-40 или NP-40).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Не используйте Triton-X 100 вместо альтернативы NP-40 или NP-40, так как он может быть слишком абразивным для некоторых типов клеток.
    5. Тщательно промойте гранулы клеток, суспендировав их в 5 колонках промывочного буфера и центрифугируя при 800 x g в течение 5 минут при 4 °C. Выполните этот шаг дважды, отсасывая и выбрасывая надосадочную жидкость между стирками.
    6. Убедитесь, что объем гранулы ячейки по-прежнему отмечен перманентным маркером. Ресуспендировать в 10 объемах лизисного буфера.
    7. Пипетки тщательно перемешайте каждую гранулу, чтобы повторно взвесить, затем инкубируйте в течение 15 минут на льду.
    8. Через 15 мин центрифугу при 800 x g в течение 5 мин при 4 °C.
    9. Аспирируйте и выбросьте надосадочную жидкость.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Гранула должна уменьшиться до ≤ 1/2 от первоначального размера гранулы (как указано маркерной линией). Если гранулы не уменьшились в достаточной степени, повторите процедуру лизиса и включите осторожный этап гомогенизации с использованием пестика, чтобы разбить клетки.
    10. После завершения лизиса повторно суспендируйте гранулу в 500 мкл промывочного буфера, затем центрифугируйте при 800 x g в течение 5 мин при 4 °C. Аспирируйте и выбросьте надосадочную жидкость, затем повторите этап промывки еще раз, чтобы удалить все следы NP-40.
      ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе гранула состоит из хроматина, который содержит гистоны.
    11. Ресуспендируйте гранулу в 5 объемах (исходного размера гранулы) по 0,4 Н НН 2СО4.
    12. Выдерживают в течение 2 ч в холодном помещении или холодильнике с помощью мешалки.
    13. Через 2 ч центрифугируют образец(ы) при 3400 x g в течение 5 мин при 4 °C. Не выбрасывайте надосадочную жидкость.
    14. Перелейте надосадочную жидкость в новые пробирки и добавьте 100% трихлоруксусную кислоту (ТСА) до 1/3 объема содержимого (конечная концентрация ТСА составит примерно 20%).
    15. Осторожно переверните пробирку и посмотрите, что прозрачный бесцветный раствор становится белым и/или мутным, что указывает на выпадение белка в осадок.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для растворов с низкой концентрацией гистонов осаждение белка может быть не сразу заметно, но осадок должен быть виден после ночной инкубации.
    16. Инкубировать без помех в течение ночи (12-18 ч) при 4 °C до полного осаждения белков-гистонов.
    17. На следующий день центрифугу при 3400 x g в течение 5 мин при 4 °C.
    18. Отсасывайте надосадочную жидкость, стараясь не касаться наконечником пипетки стенок пробирки. На этом этапе гистоны осаждаются в основном в виде пленки по бокам трубки (трубок).
    19. Добавьте 500 мкл ледяного ацетона + 0,1% HCl (кислотный ацетон) в каждую пробирку с помощью стеклянной пипетки Пастера, затем осторожно переверните пробирку (пробирки) несколько раз. При этом расположите образцы по порядку (1, 2, 3 и т. д.), так как любой случайный ацетон может удалить маркировку на пробирках. Центрифугу при 3400 x g в течение 5 мин при 4 °C и осторожно сцеживайте надосадочную жидкость.
    20. Повторите этот этап полоскания с 500 мкл ледяного 100% ацетона, а также стеклянной пипеткой Пастера. Центрифугу при 3400 x g в течение 5 мин при 4 °C и осторожно сцеживайте надосадочную жидкость.
    21. Оставьте пробирки открытыми для просушки при комнатной температуре, пока не испарится оставшийся ацетон.
    22. После высыхания добавьте в каждую пробирку 100 мкл воды масс-спектрометрического качества (MS). Используйте эту каплю для взятия мазка со всех сторон контейнера, чтобы повторно суспендировать всю гистоновую пленку. Для этого каплю можно выложить на боковую сторону пробирки и вращать ее, пипетируя вверх и вниз или дозируя половину из 100 мкл и перемешивая ее с помощью наконечника. Лучше всего работает комбинация обоих методов. Гистоны легко растворяются в воде и будут находиться в растворе.
    23. После ресуспендирования всех образцов, если осталось белое твердое вещество, проведите ультразвуковую обработку в ванне при комнатной температуре в течение 5 минут.
    24. Центрифуга при 800 x g в течение 5 мин при 4 °C. Перелейте прозрачный раствор в свежие тюбики. Выбросьте оставшиеся нерастворимые гранулы.
    25. Запустите SDS-PAGE в восстановительных условиях, чтобы убедиться в чистоте экстракции.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Гели можно использовать с использованием любой подходящей концентрации полиакриламида при условии, что он может дифференцировать белки в диапазоне 10-20 кДа. Гели, используемые в этом протоколе, см. в Таблице материалов.
    26. Проведите анализ концентрации белка (например, по Брэдфорду или BCA), чтобы определить общую концентрацию белка.
  3. Химическая дериватизация (пропионилирование) остатков лизина
    1. Перенесите 20 мкг гистонов (определяемых с помощью анализа белка) в чистую пробирку. Высушите этот образец до <5 мкл с помощью вакуумного концентратора, затем ресуспендируйте с помощью 20 мкл бикарбоната аммония 100 мМ (NH4CO3) (~1 мкг/мкл раствора). При необходимости отрегулируйте pH до ~8, используя гидроксид аммония.
      ВНИМАНИЕ: Не используйте гидроксид аммония (NH4OH) для ресуспендирования, только для регулировки pH, если это необходимо. В противном случае белки будут денатурировать и выпадать в осадок.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы проверить рН с минимальной потерей образца, используйте наконечник пипетки, чтобы окунуть образец и нанести на pH-полоску. Эта процедура испытаний будет полезна на всех остальных этапах пробоподготовки.
    2. Приготовьте реагент для пропионилирования, добавив пропионовый ангидрид к ацетонитрилу (ACN) в соотношении 1:3 (v/v) (т.е. для получения 40 мкл реагента соедините 10 мкл пропионового ангидрида с 30 мкл ACN).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Традиционно метанол или изопропанол использовались для приготовления реагента для пропионилирования. Поскольку пропионилирование представляет собой реакцию образования амидов, для предотвращения нежелательных побочных продуктов и реакций, таких как метилпропиониловый эфир, который образуется в результате использования метанола, требуется непротонный растворитель, такой как ацетонитрил. Готовьте достаточное количество реагента для пропионилирования только для 4 образцов одновременно, чтобы реагент оставался свежим. Используйте реагент в течение 1-2 минут после приготовления. По мере того, как реагент находится, пропионовый ангидрид вступит в реакцию с любой окружающей влагой, и начнет образовываться уксусная кислота, которая может изменить эффективность реагента и изменит рН раствора гистонов после добавления реагента.
    3. Добавьте реагент пропионилирования к каждому образцу в соотношении 1:4 (v/v) (т.е. для 20 мкл гистонов добавьте 5 мкл реагента пропионилирования).
    4. Быстро добавьте 1:5 (v/v) NH4OH (т. е. добавьте 4 мкл на 20 мкл раствора гистонов), чтобы восстановить pH раствора до ~8. Если рН все еще слишком низкий, добавляйте 1-2 мкл NH4OH за раз, пока не будет достигнут рН 8. Как правило, соотношение 1:5 (v/v) является достаточным.
    5. Инкубируют образцы при комнатной температуре в течение 15 мин без помех.
    6. Реакцию пропионилирования повторяют не более чем для 3-4 образцов на партию реагента пропионилирования, чтобы обеспечить минимальное кислотообразование.
    7. Повторите процедуру пропионилирования шаги 1.3.2-1.3.5. Второй раунд пропионилирования гарантирует, что >95% доступных лизинов дериватизируются.
    8. Высушите образцы до <5 мкл с помощью вакуумного концентратора. Это позволит испарить любой непрореагировавший реагент пропионилирования, кислотные продукты и газообразный аммиак, выделяемый из NH4OH. Если образцы полностью высохнут, это нормально, так как существенных потерь проб не происходит.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Перед хранением вытесните воздух в баллоне с пропионовым ангидридом газообразным аргоном, чтобы предотвратить образование уксусной кислоты из-за контакта с окружающей влагой, оставшейся в бутылке.
  4. Протеолитическое расщепление с трипсином
    1. Ресуспендируйте гистоны в 100 мМ NH4HCO3 для достижения объема 20 мкл, достигая оптимальной концентрации 1 мкг/мкл.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Растворы образцов с концентрацией ниже 1 мкг/мкл приведут к снижению эффективности трипсина.
    2. Добавляют трипсин к образцам гистонов в соотношении 1:10 (масса/масса) (т.е. добавляют 2 мкл 1 мкг/мкл раствора трипсина к 20 мкг гистонов).
    3. Инкубируют реакции при 37 °С в течение 6-8 ч. В качестве альтернативы инкубируйте в течение ночи (12-18 ч) при комнатной температуре.
    4. Остановите пищеварение, заморозив при -80 °C не менее чем на 1 час.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Не используйте кислоту для подавления реакции пищеварения, так как это вызовет нежелательное снижение pH на этом этапе процедуры. Образец можно хранить при температуре -80 °C до тех пор, пока он не будет готов к работе (промежуточная точка остановки).
  5. Химическая дериватизация (пропионилирование) пептидных N-концев
    1. Высушите образцы до <5 мкл с помощью вакуумного концентратора.
    2. Ресуспендируйте образцы до 20 мкл (1 мкг/мкл) с использованием 100 мМ NH4HCO3.
    3. Повторите пропионилирование, как и раньше (шаг 1.3).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Это нормально, что образцам требуется больше времени для высыхания на этом этапе из-за более высокого соотношения водной и органической фаз.
  6. Обессоливание проб с помощью ступенчатых наконечников
    1. Ресуспендировать или разбавить образцы 50 мкл воды MS-класса + 0,1% TFA.
    2. С помощью отборщика проб 11-G пробейте 5 дисков материала C18 из твердофазного экстракционного диска (пробивите все 5 дисков перед переносом на наконечник пипетки). Вставьте и убедитесь, что диски надежно и равномерно заклинены в нижней части наконечника дозатора объемом 200 мкл (рис. 1).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте керн 15 г при обессоливании более 25 мкг образца через одноступенчатый наконечник.
    3. Используйте адаптер для центрифуги, чтобы удерживать наконечники столиков на месте в пробирках для микроцентрифуг объемом 1,5 мл или 2 мл.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для следующих этапов центрифугирования используйте медленный (400-500 x g) оборот при 4 °C в течение 1-2 минут за раз; растворители обычно проходят через смолу менее чем за 1 минуту, в зависимости от того, насколько плотно материал C18 упакован в наконечники.
    4. Промойте смолу центрифугированием с 50 мкл 100% ацетонитрила, чтобы активировать материал C18 и удалить потенциальные загрязнения.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Возможно, будет проще загружать растворы на наконечники для дозаторов с гелевой загрузкой. После активации материала C18 важно не допустить высыхания смолы в течение всей процедуры обессоливания.
    5. Центрифугированием уравновешивают материал диска 80 мкл воды MS-класса + 0,1% TFA.
    6. Подкислите образец до рН 4 или ниже с помощью ледяной уксусной кислоты. Проверяйте pH с помощью pH-полосок, как и раньше, чтобы свести к минимуму потери пробы.
    7. Загрузите весь образец на диск из смолы путем медленного центрифугирования.
    8. Промыть образец 80 мкл воды MS-класса + 0,1% TFA путем центрифугирования.
    9. Элюируют образец в чистую пробирку объемом 1,5 мл, промывая 70 мкл 75% ацетонитрила и 0,5% уксусной кислоты медленным центрифугированием. Дополнительное время центрифугирования может быть использовано для обеспечения элюирования полного объема образца с наконечника предметного столика. Ничего страшного, если смола высохнет с дополнительным временем центрифугирования, так как она больше не нужна после элюирования образца.
    10. Полностью высушите каждый образец в вакуумном концентраторе.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Образцы(ы) можно хранить при температуре -80 °C до тех пор, пока они не будут готовы к работе (промежуточная точка остановки).
    11. Для анализа ЖХ-МС/МС восстановите образцы в объеме растворителя А (0,1% муравьиной кислоты) из протокола жидкостной хроматографии (ЖХ), который дает окончательную концентрацию 0,4 мкг/мкл (т. е. растворите 20 мкг гистонов в 50 мкл растворителя А).

2. Программный интерфейс TIMS

  1. Выберите вкладку «Прибор » и переключитесь в режим «Управление » (убедитесь, что название прибора выделено зеленым цветом) (рисунок 2).
  2. Проверьте параметры TIMS (рисунок 2).
  3. Проверьте настройки MS (начало сканирования, окончание сканирования, полярность ионов, режим сканирования) (рис. 2).
  4. Проверьте настройки TIMS (режим, начало подвижности, конец подвижности, время линейного изменения, время накопления, рабочий цикл, скорость линейного изменения, скорость MS, усреднение MS и автокалибровка) (рис. 2).
  5. Перейдите на вкладку «Источник » и активируйте опцию шприца (Hamilton 500 мкл) только для шага калибровки TuneMix (Рисунок 3)13.
  6. Перейдите на вкладку Calibration (Калибровка ), нажмите m/z, выберите Calibration Mode (Режим калибровки) и выберите режим (Enhanced Q, как правило), масштаб (+0.01%) STD Dev (0.24) и нажмите Calibrate (Калибровка); при достижении 100% баллов принять (рисунок 4).
  7. Перейдите на вкладку «Мобильность» и повторите процесс калибровки (как правило, линейный режим), диапазона обнаружения (+5%), ширины (0,1 Да), STD Dev (0,1855), затем нажмите «Калибровать»; когда вы получите оценку ≥ 98,5%, примите (рисунок 5).
  8. Перейдите к методу и выберите метод, который будет использоваться; Для этого примера был выбран Proteomic_/2023-01-19-CF/20230119-Hela Control histone_prep_pasefDIA_1-24_1_451.d/451.m-TimsControl (рис. 5).

3. ЖХ-ТИМС-ПАСЕФ-ToF МС/МС

  1. Используйте типичные условия эксплуатации nESI: капиллярное напряжение 4500 В, смещение торцевой пластины 800 В, давление небулайзера 3,0 бар, сухой газ 10,0 л/мин, сухой нагреватель 200 °C и расход впрыска 50 мкл/мин.
  2. Используйте типичные настройки MS: энергия столкновения 6 эВ, РЧ-частота столкновения 1200 В между пиками, время передачи 75 мкс, хранение предимпульса 5 мкс.
  3. Определите дрейфовый расход газа, используя разность давлений на входной воронке Р1 и выходной воронке Р2. Параллельная аккумуляционно-последовательная фрагментация (PASEF) происходит в клетке TIMS, накапливая все ионы-предшественники одновременно, а не по отдельности. Затем ионы-предшественники высвобождаются в узких ионных пиках по сравнению с обычно гораздо более широкими пиками (примерно в 50 раз короче), увеличивая отношение сигнал/шум, в то же время разделяя пептиды с соэюцией через подвижность14.
  4. Разработать метод LC-TIMS-ToF MS/MS для анализа пептидов протеолитических гистонов. Соедините высокопроизводительный жидкостный хроматограф (ВЭЖХ) со колонкой C18 (300 Å, 5 мкм, 4,6 мм x 250 мм) с коммерческим прибором TIMS-TOF MS с запатентованной технологией PASEF.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот размер колонки был определен таким образом, чтобы обеспечить хорошее разделение пептидных смесей как при высоком, так и при низком pH, основываясь на ранее опубликованных работах 15,16,17.
    1. Установите объем впрыска 20 мкл (8 мкг) образца и расход 0,4 мл/мин.
    2. Запустите 60-минутный нелинейный градиент LC, используя воду с 0,1% муравьиной кислотой (растворитель A) и ацетонитрил с 0,1% муравьиной кислотой (растворитель B). Установите градиент: 10% B в течение 2,7 мин, затем до 20% B через 5,3 мин, 28% B через 4 мин, 35% B еще через 18 мин, до 40% B через 13 мин и 100% B еще через 2 мин. После выдержки 100% B в течение 5 мин снизьте концентрацию до 10% B через 5 мин и удерживайте в течение последних 5 мин.
  5. Проверка элюирования образца из ВЭЖХ в TIMS-TOF с помощью ионизации наноэлектрораспылением (nESI) в режиме положительной ионизации.

4. Анализ данных

  1. Идентификация пептидных последовательностей и сайтов модификации.
    1. Подготовьте теоретический список пептидов с помощью программы ProteinProspector [https://prospector.ucsf.edu/prospector/cgi-bin/msform.cgi?form=msdigest] под инструментом MS-digest.
      1. Выполняйте теоретическое дигессия, принимая во внимание условия пищеварения (используемый фермент), типы искомых ПТМ (например, моно-, ди- или триметилирование), диапазон размеров искомых пептидов, а также диапазон обнаружения массы и потенциальное количество пропущенных расщеплений.
  2. Вручную проанализируйте полученные данные на основе теоретических пептидов (рис. 6)12.
    1. Поиск масс в нескольких состояниях заряда (от +1 до +4) для каждого теоретического пептида.
    2. После первоначальной идентификации каждого m/z выберите пик и подтвердите MS/MS, используя теоретический список ионов фрагментации, основанный на пептидной последовательности, включая PTM.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если подвижность идентифицированного пептида была известна ранее, это также подтверждается.
  3. Рассчитайте относительную распространенность различных ПТМ и опишите каждую модификацию в процентах от указанной пептидной последовательности.
    1. Относительная распространенность каждого обнаруженного ПТМ вычисляется по следующему уравнению:
      Относительная распространенность = Площадь ПТМ / Общая площадь немодифицированных и ПТМ для данного пептида

Результаты

Восходящий протеомный рабочий процесс (рис. 7) обычно включает в себя следующее: экстракцию целевого белка (белков) из сырого образца с последующим количественным определением концентрации белка (белков) и последующим фракционированием, обычно с помощью гель-электрофор...

Обсуждение

Гистоны — это основные белки, которые регулируют структуру хроматина, взаимодействуя с ДНК в виде октамеров, состоящих из четырех основных гистонов (по два из H2A, H2B, H3 и H4)20. Гистоны содержат многочисленные остатки лизина и аргинина, которые легко модифицируются, что приводи...

Раскрытие информации

Мелвин А. Парк (Melvin A. Park) и Мэтью Уиллетс (Matthew Willetts) являются сотрудниками компании Bruker Daltonics Inc., производителя инструмента timsTOF.

Благодарности

Этот материал основан на работе, поддержанной Национальным научным фондом в рамках гранта No. HRD-1547798 и Grant No. HRD-2111661. Эти гранты NSF были присуждены Международному университету Флориды в рамках программы Центров передового опыта исследований в области науки и технологий (CREST). Это вклад под номером 1672 от Института окружающей среды, выдающейся программы при Международном университете Флориды. Дополнительная поддержка была оказана Национальным институтом здравоохранения в рамках гранта No. R21AI135469 Франсиско Фернандес-Лима и Грант No. R01HD106051 Бенджамину А. Гарсиа, а также Национальным научным фондом в рамках гранта No. CHE-2127882 Бенджамину А. Гарсиа. Авторы выражают признательность доктору Марио Гомесу Эрнандесу за первоначальную поддержку во время разработки метода.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
-80 °C Freezer
1x Phosphate Buffered Saline (PBS), pH 7.4Thermo Fisher Scientific10010023Animal Origin-Free
1 mL Pipette TipsThermo Fisher Scientific94060710Finntip Flex 1000 μL, nonsterile, nonfiltered, racked tips
1.5 mL Microcentrifuge TubesThermo Fisher Scientific14-282-300Use these tubes for the simple and safe processing of sample volumes up to 1.5 mL
10 µL Pipette TipsThermo Fisher Scientific94060100Finntip Flex, 10 μL, nonsterile, non-filtered, racked
10% NP-40Thermo Fisher Scientific28324NP-40 Surfact-Amps Detergent Solution
10x Dulbecco’s PBS without Ca2+/Mg2+(Mediatech)MT21031CM
15 mL Conical TubesCorning352196Falcon Conical Centrifuge Tubes
200 µL Gel-Loading Pipette TipsThermo Fisher Scientific02-707-138Fisherbrand Gel-Loading Tips, 1–200 μL
200 µL Pipette TipsThermo Fisher Scientific94060310Finntip Flex 200μL, nonsterile, nonfiltered, racked tips
2x Laemmli Sample BufferBio-Rad1610737Premixed protein sample buffer for SDS-PAGE
50 mL Conical TubesCorning352070Falcon Conical Centrifuge Tubes
96-well flat bottom plateThermo Fisher Scientific12565501
96-well plate, V-Bottom 600 μLAxygenP-DW-500-C-S
AcetoneSigma Aldrich179124ACS reagent, ≥99.5%
Acetonitrile (ACN)Thermo Fisher ScientificA998HPLC, Fisher Chemical
Acetonitrile with 0.1% Formic acid (v/v), LC/MS GradeThermo Fisher ScientificLS120Optima LC/MS Grade, Thermo Scientific
AEBSFThermo Fisher Scientific328110500AEBSF hydrochloride, 98%
Ammonium bicarbonate, NH4HCO3Sigma Aldrich09830BioUltra, ≥99.5% (T)
Ammonium hydroxide solution, NH4OHSigma AldrichAX1303Meets ACS Specifications, Meets Reagent Specifications for testing USP/NF monographs GR ACS
Argon (Ar)AirgasAR HP 300
BEH C18 HPLC columnWaters186003625XBridge Peptide BEH C18 Column, 300 Å, 5 µm, 4.6 mm X 250 mm, 1K–15K
Bovine Serum Albumin (BSA)Sigma AldrichA7906Heat shock fraction, pH 7, ≥98%
Calcium chloride, CaCl2Sigma AldrichC4901Anhydrous, powder, ≥97%
Cell dissociation bufferThermo Fisher Scientific13151014
Ceramic scoring waferRestek20116
Compass DataAnalysis 6.0Bruker Datonics
Compass HyStar 6.2Bruker Daltonics
Compass IsotopePatternBruker Daltonics
Compass timsControl 4.1Bruker Daltonics
Coomassie Brilliant Blue R-250Bio-Rad1610436
Deep Well, 96-Well Microplate, 2.0 mLThermo Fisher Scientific89237526
Disposable Cell LiftersThermo Fisher Scientific 08100240Fisherbrand Cell Lifters; Disposable lifters quickly remove cell layers
Disposable Pellet PestlesThermo Fisher Scientific12-141-363Fisherbrand Pellet Pestles; Resuspend protein and DNA pellets or grind soft tissue in microcentrifuge tubes
Dithiothreitol (DTT)Thermo Fisher ScientificP23251 M
Formic acid (FA)Sigma Aldrich695076ACS reagent, ≥96%
Fused silica capillary 75 μm ID x 363 μm OD(Molex (Polymicro)TSP075375
Glacial Acetic AcidThermo Fisher ScientificA38SAcetic Acid, Glacial (Certified ACS), Fisher Chemical
Glass Pasteur PipettesSigma AldrichBR747725-1000EA
High-Performance Liquid Chromatograph ShimadzuShimadzu Prominence 20 HPLC UFLC System
Hydrochloric acid, HClSigma Aldrich258148ACS reagent, 37%
Hypercarb 30-40 μm Carbon 150–300 ÅThermo Fisher Scientific60106-402
Hypersep cartridgeThermo Fisher Scientific60109-404
LC/MS Calibration Standard, for ESI-ToFAgilentG1969-85000TuningMix
Magnesium chloride, MgCl2Sigma AldrichM8266Anhydrous, ≥98%
Methanol, for HPLCThermo Fisher ScientificA454Optima for HPLC, Fisher Chemical  
Microcentrifuge Tube AdaptersGL Sciences501021514
MicrocystinThermo Fisher Scientific50-200-8727Enzo Life Sciences Microcystin-LA
MS sample vial, LaPhaPack, Snap, 12 mm x 32 mmLEAP PAL PartsLAP.11190933
NanodropThermo Fisher Scientificmodel: ND3300
Nitrogen (N2)AirgasNI UHP300
PEAKS Studio X+Bioinformatic Solutions
pH indicator strips, InstachekMicro Essential LabJR-113Model: Hydrion
Potassium chloride, KClSigma AldrichP3911ACS reagent, 99.0%–100.5%
Pressure Injection CellNext Advance model: PC77
Propionic AnhydrideSigma Aldrich8.00608For synthesis
Refrigerated Centrifuge (700–18,000 x g)NuAire, model: NuwindNU-C200V
Reprosil-Pur 120 C18-AQ 3 μm, 3 gESI Source Solutionsr13.aq.0003
SDS-PAGE GelsBio-Rad4569035Any kD precast polyacrylamide gel, 8.6 cm × 6.7 cm (W × L), for use with Mini-PROTEAN Electrophoresis Cells
Sodium butyrateThermo Fisher ScientificA11079.0698+%
Sodium chloride, NaClSigma AldrichS9888ACS reagent, ≥99.0%
SPE disk, C18VWR76333-134Empore SPE disk, C18, CDS Analytical, 90 mm x 0.5 mm, 12 µm
SpeedVac+ vacuum pump and plate rotorSavantmodel: SC210A
SucroseMillipore1.07651suitable for microbiology
Sulfuric acid, H2SO4 Sigma Aldrich33974199.999%
TIMS-ToF Mass SpectrometerBruker Daltonicsmodel Tims tof ms
Trichloroacetic acid solution, TCASigma AldrichT06996.1 N
Trifluoroacetic acid (TFA)Sigma Aldrich302031Suitable for HPLC, ≥99.0%
Triversa NanomateAdvionmodel: TR263
TrypsinProtease, MS GradeThermo Fisher Scientific90057
Tube rotatorThermo Fisher Scientific88881001
Vortex MixerThermo Fisher Scientific88880017
Water with 0.1% Formic acid (v/v), LC/MS GradeThermo Fisher ScientificLS118Optima LC/MS Grade, Thermo Scientific 

Ссылки

  1. Zhao, Z., Shilatifard, A. Epigenetic modifications of histones in cancer. Genome Biology. 20, 245 (2019).
  2. Luger, K., Mader, A. W., Richmond, R. K., Sargen, D. F., Richmond, T. J. Crystal structure of the nucleosome core particle at 2.8 Å resolution. Nature. 389 (6648), 251-260 (1997).
  3. Bentley, G. A., Lewit-Bentley, A., Finch, J. T., Podjarny, A. D., Roth, M. Crystal structure of the nucleosome core particle at 16 Å resolution. Journal of Molecular Biology. 176 (1), 55-75 (1984).
  4. Kornberg, R. D., Thomas, J. O. Chromatin structure: Oligomers of the histones: The histones comprise an (F2A1)2(F3)2 tetramer, a different oligomer of F2A2 and F2B, and monomer of F1. Science. 184 (4139), 865-868 (1974).
  5. Borghini, A., Cervelli, T., Galli, A., Andreassi, M. G. DNA modifications in atherosclerosis: From the past to the future. Atherosclerosis. 230 (2), 202-209 (2013).
  6. Jeanne Dit Fouque, K., et al. 34;Double-Down" mass spectrometry of histone H4 proteoforms: Tandem ultraviolet-photon and mobility/mass-selected electron capture dissociations. Analytical Chemistry. 94 (44), 15377-15385 (2022).
  7. Lawrence, M., Daujat, S., Schneider, R. Lateral thinking: How histone modifications regulate gene expression. Trends in Genetics. 32 (1), 42-56 (2016).
  8. Bannister, A. J., Kouzarides, T. Regulation of chromatin by histone modifications. Cell Research. 21 (3), 381-395 (2011).
  9. Meier, F., et al. Parallel accumulation-serial fragmentation (PASEF): Multiplying sequencing speed and sensitivity by synchronized scans in a trapped ion mobility device. Journal of Proteome Research. 14 (12), 5378-5387 (2015).
  10. Chernushevich, I. V., Loboda, A. V., Thomson, B. A. An introduction to quadrupole-time-of-flight mass spectrometry. Journal of Mass Spectrometry. 36 (8), 849-865 (2001).
  11. Andrews, G. L., Simons, B. L., Young, J. B., Hawridge, A. M., Muddiman, D. C. Performance characteristics of a new hybrid quadrupole time-of-flight tandem mass spectrometer (TripleTOF 5600). Analytical Chemistry. 83 (13), 5442-5446 (2011).
  12. Bhanu, N. V., Sidoli, S., Garcia, B. A Workflow for ultra-rapid analysis of histone posttranslational modifications with direct-injection mass spectrometry. Bio-Protocol. 10 (18), e3756 (2020).
  13. Xue, A., et al. Discovery of serum biomarkers for pancreatic adenocarcinoma using proteomic analysis. British Journal of Cancer. 103 (3), 391-400 (2010).
  14. Wang, Y., et al. Reversed-phase chromatography with multiple fraction concatenation strategy for proteome profiling of human MCF10S cells. Proteomics. 11 (10), 2019-2026 (2011).
  15. Mertins, P., et al. Integrated proteomic analysis of posttranslational modifications by serial enrichment. Nature Methods. 10 (7), 634-637 (2012).
  16. Meier, F., Park, M. A., Mann, M. Trapped ion mobility spectrometry and parallel accumulation-serial fragmentation in proteomics. Molecular & Cellular Proteomics. 20, 100138 (2021).
  17. Romson, J., Emmer, A. Mass calibration options for accurate electrospray ionization mass spectrometry. International Journal of Mass Spectrometry. 467, 11619 (2021).
  18. Dupree, E. J., Jayathirtha, M., Yorkie, H., Mihasan, M., Petre, B. A., Darie, C. C. A critical review of bottom-up proteomics: The good, the bad, and the future of this field. Proteomes. 8 (3), 14 (2020).
  19. Ho, C. M., et al. Bottom-up structural proteomics: cryoEM of protein complexes enriched from the cellular milieu. Nature Methods. 17 (1), 79-85 (2020).
  20. Eickbush, T., Moudrianakis, E. The histone core complex: an octamer assembled by two sets of protein-protein interactions. Biochemistry. 17 (23), 4955-4964 (1978).
  21. Sadakierska-Chudy, A., Filip, M. A Comprehensive view of the epigenetic landscape. Part II: Histone posttranslational modification, nucleosome level, and chromatin regulation by ncRNAs. Neurotoxicity Research. 27 (2), 172-197 (2015).
  22. Tan, H. T., Low, J., Lim, S. G., Chung, M. C. M. Serum autoantibodies as biomarkers for early cancer detection. The FEBS Journal. 276 (23), 6880-6904 (2009).
  23. Huang, R. X., Zhou, P. K. DNA damage response pathways and targets for radiotherapy sensitization in cancer. Signal Transduction and Targeted Therapy. 5 (1), 60 (2020).
  24. Dantuma, N. P., van Attikum, H. Spatiotemporal regulation of posttranslational modifications in the DNA damage response. The EMBO Journal. 35 (1), 6-23 (2016).
  25. Tanner, S., Pevzner, P. A., Bafna, V. Unrestrictive identification of posttranslational modifications through peptide mass spectrometry. Nature Protocols. 1 (1), 67-72 (2006).
  26. Dolan, J. LC column problems everywhere 1. LCGC North America. 28 (9), 500-504 (2015).
  27. Brusniak, M. K., et al. An assessment of current bioinformatic solutions for analyzing LC-MS data acquired by selected reaction monitoring technology. Proteomics. 12 (8), 1176-1184 (2012).
  28. Cham, J. A., Bianco, L., Bessant, C. Free computational resources for designing selected reaction monitoring transitions. Proteomics. 10 (6), 1106-1126 (2010).
  29. Colangelo, C. M., Chung, L., Bruce, C., Cheung, K. Review of software tools for design and analysis of large scale MRM proteomic datasets. Methods. 61, 287-298 (2013).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

203

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены