Cribado de modificación de histonas mediante cromatografía líquida, espectrometría de movilidad de iones atrapados y espectrometría de masas de tiempo de vuelo

Resumen

Un flujo de trabajo analítico basado en cromatografía líquida, espectrometría de movilidad de iones atrapados y espectrometría de masas de tiempo de vuelo (LC-TIMS-ToF MS/MS) para un análisis "ascendente" de alta confianza y altamente reproducible de las modificaciones e identificación de histonas en función de los parámetros principales (tiempo de retención [RT], sección transversal de colisión [CCS] y relación masa-carga [m/z] precisa).

Resumen

Las proteínas histonas son muy abundantes y se conservan entre los eucariotas y desempeñan un papel importante en la regulación génica como resultado de estructuras conocidas como modificaciones postraduccionales (PTM). La identificación de la posición y la naturaleza de cada PTM o patrón de PTM en referencia a factores externos o genéticos permite correlacionar estadísticamente esta información con respuestas biológicas como la transcripción, replicación o reparación del ADN. En el presente trabajo se describe un protocolo analítico de alto rendimiento para la detección de histonas PTM a partir de muestras biológicas. El uso de cromatografía líquida complementaria, espectrometría de movilidad de iones atrapados y espectrometría de masas de tiempo de vuelo (LC-TIMS-ToF MS/MS) permite la separación y la asignación de PTM de las modificaciones biológicamente más relevantes en un solo análisis. El enfoque descrito aprovecha los desarrollos recientes en la adquisición de datos dependientes (DDA) utilizando la acumulación paralela en la trampa de movilidad, seguida de la fragmentación secuencial y la disociación inducida por colisiones. Los PTM de Histone se asignan con confianza en función de su tiempo de retención, movilidad y patrón de fragmentación.

Introducción

En las células eucariotas, el ADN se empaqueta como cromatina en unidades funcionales llamadas nucleosomas. Estas unidades están compuestas por un octámero de cuatro histonas centrales (dos de H2A, H2B, H3 y H4)1,2,3,4. Las histonas se encuentran entre las proteínas más abundantes y mejor conservadas en los eucariotas, que son en gran parte responsables de la regulación génica⁵. Las modificaciones postraduccionales de histonas (PTM) desempeñan un papel importante en la regulación de la dinámica de la cromatina y en la....

Protocolo

NOTA: Las muestras de histonas se extrajeron utilizando un método adaptado de Bhanu et al. (2020)¹².

1. Preparación de la muestra

1. Recolección de células cultivadas
   1. Cuando las células sean confluentes en un 80%, asegúrese de que sean viables utilizando la exclusión del azul de tripano.
      NOTA: Para estos experimentos se utilizó una línea celular HeLa S3, pero este método se puede aplicar a cualquier célula cultivada.
   2. Aspire el medio, luego aplique 5 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS) 1x a cada placa.
   3. Agite la(s) placa(s) para enjuagar todos los me....

Discusión

Las histonas son proteínas básicas que regulan la estructura de la cromatina interactuando con el ADN en forma de octámeros formados por las cuatro histonas centrales (dos de H2A, H2B, H3 y H4)²⁰. Las histonas contienen numerosos residuos de lisina y arginina, que se modifican fácilmente, lo que da lugar a extensos PTM que alteran la química de la cromatina al influir en la función de las histonas o al unirse a otras proteínas celulares²¹. Los PTM pueden provocar res.......

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
-80 °C Freezer
1x Phosphate Buffered Saline (PBS), pH 7.4	Thermo Fisher Scientific	10010023	Animal Origin-Free
1 mL Pipette Tips	Thermo Fisher Scientific	94060710	Finntip Flex 1000 μL, nonsterile, nonfiltered, racked tips
1.5 mL Microcentrifuge Tubes	Thermo Fisher Scientific	14-282-300	Use these tubes for the simple and safe processing of sample volumes up to 1.5 mL
10 µL Pipette Tips	Thermo Fisher Scientific	94060100	Finntip Flex, 10 μL, nonsterile, non-filtered, racked
10% NP-40	Thermo Fisher Scientific	28324	NP-40 Surfact-Amps Detergent Solution
10x Dulbecco’s PBS without Ca2+/Mg2+	(Mediatech)	MT21031CM
15 mL Conical Tubes	Corning	352196	Falcon Conical Centrifuge Tubes
200 µL Gel-Loading Pipette Tips	Thermo Fisher Scientific	02-707-138	Fisherbrand Gel-Loading Tips, 1–200 μL
200 µL Pipette Tips	Thermo Fisher Scientific	94060310	Finntip Flex 200μL, nonsterile, nonfiltered, racked tips
2x Laemmli Sample Buffer	Bio-Rad	1610737	Premixed protein sample buffer for SDS-PAGE
50 mL Conical Tubes	Corning	352070	Falcon Conical Centrifuge Tubes
96-well flat bottom plate	Thermo Fisher Scientific	12565501
96-well plate, V-Bottom 600 μL	Axygen	P-DW-500-C-S
Acetone	Sigma Aldrich	179124	ACS reagent, ≥99.5%
Acetonitrile (ACN)	Thermo Fisher Scientific	A998	HPLC, Fisher Chemical
Acetonitrile with 0.1% Formic acid (v/v), LC/MS Grade	Thermo Fisher Scientific	LS120	Optima LC/MS Grade, Thermo Scientific
AEBSF	Thermo Fisher Scientific	328110500	AEBSF hydrochloride, 98%
Ammonium bicarbonate, NH4HCO3	Sigma Aldrich	09830	BioUltra, ≥99.5% (T)
Ammonium hydroxide solution, NH4OH	Sigma Aldrich	AX1303	Meets ACS Specifications, Meets Reagent Specifications for testing USP/NF monographs GR ACS
Argon (Ar)	Airgas	AR HP 300
BEH C18 HPLC column	Waters	186003625	XBridge Peptide BEH C18 Column, 300 Å, 5 µm, 4.6 mm X 250 mm, 1K–15K
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma Aldrich	A7906	Heat shock fraction, pH 7, ≥98%
Calcium chloride, CaCl2	Sigma Aldrich	C4901	Anhydrous, powder, ≥97%
Cell dissociation buffer	Thermo Fisher Scientific	13151014
Ceramic scoring wafer	Restek	20116
Compass DataAnalysis 6.0	Bruker Datonics
Compass HyStar 6.2	Bruker Daltonics
Compass IsotopePattern	Bruker Daltonics
Compass timsControl 4.1	Bruker Daltonics
Coomassie Brilliant Blue R-250	Bio-Rad	1610436
Deep Well, 96-Well Microplate, 2.0 mL	Thermo Fisher Scientific	89237526
Disposable Cell Lifters	Thermo Fisher Scientific	08100240	Fisherbrand Cell Lifters; Disposable lifters quickly remove cell layers
Disposable Pellet Pestles	Thermo Fisher Scientific	12-141-363	Fisherbrand Pellet Pestles; Resuspend protein and DNA pellets or grind soft tissue in microcentrifuge tubes
Dithiothreitol (DTT)	Thermo Fisher Scientific	P2325	1 M
Formic acid (FA)	Sigma Aldrich	695076	ACS reagent, ≥96%
Fused silica capillary 75 μm ID x 363 μm OD	(Molex (Polymicro)	TSP075375
Glacial Acetic Acid	Thermo Fisher Scientific	A38S	Acetic Acid, Glacial (Certified ACS), Fisher Chemical
Glass Pasteur Pipettes	Sigma Aldrich	BR747725-1000EA
High-Performance Liquid Chromatograph	Shimadzu		Shimadzu Prominence 20 HPLC UFLC System
Hydrochloric acid, HCl	Sigma Aldrich	258148	ACS reagent, 37%
Hypercarb 30-40 μm Carbon 150–300 Å	Thermo Fisher Scientific	60106-402
Hypersep cartridge	Thermo Fisher Scientific	60109-404
LC/MS Calibration Standard, for ESI-ToF	Agilent	G1969-85000	TuningMix
Magnesium chloride, MgCl2	Sigma Aldrich	M8266	Anhydrous, ≥98%
Methanol, for HPLC	Thermo Fisher Scientific	A454	Optima for HPLC, Fisher Chemical
Microcentrifuge Tube Adapters	GL Sciences	501021514
Microcystin	Thermo Fisher Scientific	50-200-8727	Enzo Life Sciences Microcystin-LA
MS sample vial, LaPhaPack, Snap, 12 mm x 32 mm	LEAP PAL Parts	LAP.11190933
Nanodrop	Thermo Fisher Scientific	model: ND3300
Nitrogen (N2)	Airgas	NI UHP300
PEAKS Studio X+	Bioinformatic Solutions
pH indicator strips, Instachek	Micro Essential Lab	JR-113	Model: Hydrion
Potassium chloride, KCl	Sigma Aldrich	P3911	ACS reagent, 99.0%–100.5%
Pressure Injection Cell	Next Advance	model: PC77
Propionic Anhydride	Sigma Aldrich	8.00608	For synthesis
Refrigerated Centrifuge (700–18,000 x g)	NuAire, model: Nuwind	NU-C200V
Reprosil-Pur 120 C18-AQ 3 μm, 3 g	ESI Source Solutions	r13.aq.0003
SDS-PAGE Gels	Bio-Rad	4569035	Any kD precast polyacrylamide gel, 8.6 cm × 6.7 cm (W × L), for use with Mini-PROTEAN Electrophoresis Cells
Sodium butyrate	Thermo Fisher Scientific	A11079.06	98+%
Sodium chloride, NaCl	Sigma Aldrich	S9888	ACS reagent, ≥99.0%
SPE disk, C18	VWR	76333-134	Empore SPE disk, C18, CDS Analytical, 90 mm x 0.5 mm, 12 µm
SpeedVac+ vacuum pump and plate rotor	Savant	model: SC210A
Sucrose	Millipore	1.07651	suitable for microbiology
Sulfuric acid, H2SO4	Sigma Aldrich	339741	99.999%
TIMS-ToF Mass Spectrometer	Bruker Daltonics		model Tims tof ms
Trichloroacetic acid solution, TCA	Sigma Aldrich	T0699	6.1 N
Trifluoroacetic acid (TFA)	Sigma Aldrich	302031	Suitable for HPLC, ≥99.0%
Triversa Nanomate	Advion	model: TR263
TrypsinProtease, MS Grade	Thermo Fisher Scientific	90057
Tube rotator	Thermo Fisher Scientific	88881001
Vortex Mixer	Thermo Fisher Scientific	88880017
Water with 0.1% Formic acid (v/v), LC/MS Grade	Thermo Fisher Scientific	LS118	Optima LC/MS Grade, Thermo Scientific