A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
هنا ، نقدم بروتوكولا لقياس المستقلبات بدقة وموثوقية في أنواع الخلايا النادرة. تتيح التحسينات التقنية ، بما في ذلك سائل غمد معدل لفرز الخلايا وتوليد عينات فارغة ذات صلة ، إجراء تقدير كمي شامل للمستقلبات بإدخال 5000 خلية فقط لكل عينة.
تعتمد الوظيفة الخلوية بشكل حاسم على التمثيل الغذائي ، ويمكن دراسة وظيفة الشبكات الأيضية الأساسية عن طريق قياس وسيطة الجزيئات الصغيرة. ومع ذلك ، فإن الحصول على قياسات دقيقة وموثوقة لعملية التمثيل الغذائي الخلوي ، لا سيما في أنواع الخلايا النادرة مثل الخلايا الجذعية المكونة للدم ، يتطلب تقليديا تجميع الخلايا من متعددة. يمكن البروتوكول الآن الباحثين من قياس المستقلبات في أنواع الخلايا النادرة باستخدام فأر واحد فقط لكل عينة مع توليد نسخ متماثلة متعددة لأنواع خلايا أكثر وفرة. هذا يقلل من عدد المطلوبة لمشروع معين. يتضمن البروتوكول المقدم هنا العديد من الاختلافات الرئيسية عن بروتوكولات الأيض التقليدية ، مثل استخدام 5 جم / لتر كلوريد الصوديوم كسائل غمد ، والفرز مباشرة في الأسيتونيتريل ، واستخدام القياس الكمي المستهدف مع الاستخدام الصارم للمعايير الداخلية ، مما يسمح بقياسات أكثر دقة وشمولية لعملية التمثيل الغذائي الخلوي. على الرغم من الوقت اللازم لعزل الخلايا المفردة ، وتلطيخ الفلورسنت ، والفرز ، يمكن للبروتوكول الحفاظ على الاختلافات بين أنواع الخلايا والعلاجات الدوائية إلى حد كبير.
الأيض هو عملية بيولوجية أساسية تحدث في جميع الخلايا الحية. تتضمن عمليات التمثيل الغذائي شبكة واسعة من التفاعلات الكيميائية الحيوية المنظمة بإحكام والمترابطة ، مما يسمح للخلايا بإنتاج الطاقة وتوليف الجزيئات الحيوية الأساسية1. لفهم وظيفة الشبكات الأيضية ، يقيس الباحثون مستويات الجزيئات الصغيرة الوسيطة داخل الخلايا. تعمل هذه المواد الوسيطة كمؤشرات مهمة للنشاط الأيضي ويمكن أن تكشف عن رؤى مهمة في الوظيفة الخلوية.
قياس الطيف الكتلي (MS) هو الخيار الأكثر شيوعا للكشف المحدد عن المستقلبات في العينات المعقدة 1,2. يتميز الرنين المغناطيسي النووي (NMR) بمزايا في القياس ال....
تم إجراء تربية وتربية جميع الفئران المستخدمة في هذا البروتوكول في منشأة حيوانية تقليدية في معهد ماكس بلانك لعلم المناعة وعلم التخلق (MPI-IE) وفقا للوائح السلطات المحلية (Regierungspräsidium Freiburg). تم القتل الرحيم للفئران باستخدام CO2 وخلع عنق الرحم من قبل موظفين مدربين على FELASA B وفقا للإرشادات واللوائح التي وافقت عليها لجنة رعاية التابعة ل MPI-IE والسلطات المحلية. لم يتم إجراء أي تجارب على ، وكانت الفئران بدون أعباء صحية.
ملاحظة: الطرق التحليلية عالية الحساسية مثل طريقة LC-MS المستخدمة في هذا البروتوكول لديها القدرة على اكتشاف حتى الملوثات البسيطة جدا في العينة. لذلك ، من الأهمية بمكان تقليل هذه الملوثات. الإجراء الوحيد ال....
يتيح فرز FACS عزل المجموعات السكانية النظيفة من أنواع الخلايا المختلفة من نفس تعليق الخلية (الشكل 2 والشكل 3). تعتمد خصوصية هذه الطريقة على تلطيخ أنواع الخلايا المختلفة بعلامات سطحية محددة (على سبيل المثال ، الخلايا البائية والخلايا التائية من الطحال) أو مجمو?.......
أهم الخطوات للتنفيذ الناجح للمستقلبات المستهدفة باستخدام هذا البروتوكول هي 1) استراتيجية تلطيخ وبوابات قوية من شأنها أن تنتج مجموعات خلايا نظيفة 2) معالجة دقيقة لأحجام السائل ، 3) توقيت قابل للتكرار لجميع الخطوات التجريبية ، ولا سيما جميع الخطوات قبل استخراج الأيض. من الناحية المثالية ، يج.......
يعلن أصحاب البلاغ عدم وجود تضارب في المصالح.
يود المؤلفون أن يشكروا منشأة التابعة لمعهد ماكس بلانك لعلم المناعة وعلم التخلق على توفير المستخدمة في هذه الدراسة.
....Name | Company | Catalog Number | Comments |
13C yeast extract | Isotopic Solutions | ISO-1 | |
40 µm cell strainer | Corning | 352340 | |
Acetonitrile, LC-MS grade | VWR | 83640.32 | |
ACK lysis buffer | Gibco | 104921 | Alternatively: Lonza, Cat# BP10-548E |
Adenosine diphosphate (ADP) | Sigma Aldrich | A2754 | |
Adenosine monophosphate (AMP) | Sigma Aldrich | A1752 | |
Adenosine triphosphate (ATP) | Sigma Aldrich | A2383 | |
Ammonium Carbonate, HPLC grade | Fisher Scientific | A/3686/50 | |
Atlantis Premier BEH Z-HILIC column (100 x 2.1 mm, 1.7 µm) | Waters | 186009982 | |
B220-A647 | Invitrogen | 103226 | |
B220-PE/Cy7 | BioLegend | 103222 | RRID:AB_313005 |
CD11b-PE/Cy7 | BioLegend | 101216 | RRID:AB_312799 |
CD150-BV605 | BioLegend | 115927 | RRID:AB_11204248 |
CD3-PE | Invitrogen | 12-0031-83 | |
CD48-BV421 | BioLegend | 103428 | RRID:AB_2650894 |
CD4-PE/Cy7 | BioLegend | 100422 | RRID:AB_2660860 |
CD8a-PE/Cy7 | BioLegend | 100722 | RRID:AB_312761 |
cKit-PE | BioLegend | 105808 | RRID:AB_313217 |
Dynabeads Untouched Mouse CD4 Cells Kit | Invitrogen | 11415D | |
FACSAria III | BD | ||
Gr1-PE/Cy7 | BioLegend | 108416 | RRID:AB_313381 |
Heat sealing foil | Neolab | Jul-18 | |
Isoleucine | Sigma Aldrich | 58880 | |
JetStream ESI Source | Agilent | G1958B | |
Leucine | Sigma Aldrich | L8000 | |
Medronic acid | Sigma Aldrich | M9508-1G | |
Methanol, LC-MS grade | Carl Roth | HN41.2 | |
NaCl | Fluka | 31434-1KG | |
PBS | Sigma Aldrich | D8537 | |
Sca1-APC/Cy7 | BioLegend | 108126 | RRID:AB_10645327 |
TER119-PE/Cy7 | BioLegend | 116221 | RRID:AB_2137789 |
Triple Quadrupole Mass Spectrometer | Agilent | 6495B | |
Twin.tec PCR plate 96 well LoBind skirted | Eppendorf | 30129512 | |
UHPLC Autosampler | Agilent | G7157B | |
UHPLC Column Thermostat | Agilent | G7116B | |
UHPLC Pump | Agilent | G7120A | |
UHPLC Sample Thermostat | Agilent | G4761A |
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionExplore More Articles
This article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved