A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

هنا ، نقدم بروتوكولا لقياس المستقلبات بدقة وموثوقية في أنواع الخلايا النادرة. تتيح التحسينات التقنية ، بما في ذلك سائل غمد معدل لفرز الخلايا وتوليد عينات فارغة ذات صلة ، إجراء تقدير كمي شامل للمستقلبات بإدخال 5000 خلية فقط لكل عينة.

Abstract

تعتمد الوظيفة الخلوية بشكل حاسم على التمثيل الغذائي ، ويمكن دراسة وظيفة الشبكات الأيضية الأساسية عن طريق قياس وسيطة الجزيئات الصغيرة. ومع ذلك ، فإن الحصول على قياسات دقيقة وموثوقة لعملية التمثيل الغذائي الخلوي ، لا سيما في أنواع الخلايا النادرة مثل الخلايا الجذعية المكونة للدم ، يتطلب تقليديا تجميع الخلايا من متعددة. يمكن البروتوكول الآن الباحثين من قياس المستقلبات في أنواع الخلايا النادرة باستخدام فأر واحد فقط لكل عينة مع توليد نسخ متماثلة متعددة لأنواع خلايا أكثر وفرة. هذا يقلل من عدد المطلوبة لمشروع معين. يتضمن البروتوكول المقدم هنا العديد من الاختلافات الرئيسية عن بروتوكولات الأيض التقليدية ، مثل استخدام 5 جم / لتر كلوريد الصوديوم كسائل غمد ، والفرز مباشرة في الأسيتونيتريل ، واستخدام القياس الكمي المستهدف مع الاستخدام الصارم للمعايير الداخلية ، مما يسمح بقياسات أكثر دقة وشمولية لعملية التمثيل الغذائي الخلوي. على الرغم من الوقت اللازم لعزل الخلايا المفردة ، وتلطيخ الفلورسنت ، والفرز ، يمكن للبروتوكول الحفاظ على الاختلافات بين أنواع الخلايا والعلاجات الدوائية إلى حد كبير.

Introduction

الأيض هو عملية بيولوجية أساسية تحدث في جميع الخلايا الحية. تتضمن عمليات التمثيل الغذائي شبكة واسعة من التفاعلات الكيميائية الحيوية المنظمة بإحكام والمترابطة ، مما يسمح للخلايا بإنتاج الطاقة وتوليف الجزيئات الحيوية الأساسية1. لفهم وظيفة الشبكات الأيضية ، يقيس الباحثون مستويات الجزيئات الصغيرة الوسيطة داخل الخلايا. تعمل هذه المواد الوسيطة كمؤشرات مهمة للنشاط الأيضي ويمكن أن تكشف عن رؤى مهمة في الوظيفة الخلوية.

قياس الطيف الكتلي (MS) هو الخيار الأكثر شيوعا للكشف المحدد عن المستقلبات في العينات المعقدة 1,2. يتميز الرنين المغناطيسي النووي (NMR) بمزايا في القياس ال....

Protocol

تم إجراء تربية وتربية جميع الفئران المستخدمة في هذا البروتوكول في منشأة حيوانية تقليدية في معهد ماكس بلانك لعلم المناعة وعلم التخلق (MPI-IE) وفقا للوائح السلطات المحلية (Regierungspräsidium Freiburg). تم القتل الرحيم للفئران باستخدام CO2 وخلع عنق الرحم من قبل موظفين مدربين على FELASA B وفقا للإرشادات واللوائح التي وافقت عليها لجنة رعاية التابعة ل MPI-IE والسلطات المحلية. لم يتم إجراء أي تجارب على ، وكانت الفئران بدون أعباء صحية.

ملاحظة: الطرق التحليلية عالية الحساسية مثل طريقة LC-MS المستخدمة في هذا البروتوكول لديها القدرة على اكتشاف حتى الملوثات البسيطة جدا في العينة. لذلك ، من الأهمية بمكان تقليل هذه الملوثات. الإجراء الوحيد ال....

النتائج

يتيح فرز FACS عزل المجموعات السكانية النظيفة من أنواع الخلايا المختلفة من نفس تعليق الخلية (الشكل 2 والشكل 3). تعتمد خصوصية هذه الطريقة على تلطيخ أنواع الخلايا المختلفة بعلامات سطحية محددة (على سبيل المثال ، الخلايا البائية والخلايا التائية من الطحال) أو مجمو?.......

Discussion

أهم الخطوات للتنفيذ الناجح للمستقلبات المستهدفة باستخدام هذا البروتوكول هي 1) استراتيجية تلطيخ وبوابات قوية من شأنها أن تنتج مجموعات خلايا نظيفة 2) معالجة دقيقة لأحجام السائل ، 3) توقيت قابل للتكرار لجميع الخطوات التجريبية ، ولا سيما جميع الخطوات قبل استخراج الأيض. من الناحية المثالية ، يج.......

Disclosures

يعلن أصحاب البلاغ عدم وجود تضارب في المصالح.

Acknowledgements

يود المؤلفون أن يشكروا منشأة التابعة لمعهد ماكس بلانك لعلم المناعة وعلم التخلق على توفير المستخدمة في هذه الدراسة.

....

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
13C yeast extractIsotopic SolutionsISO-1
40 µm cell strainerCorning352340
Acetonitrile, LC-MS gradeVWR83640.32
ACK lysis bufferGibco104921Alternatively: Lonza, Cat# BP10-548E
Adenosine diphosphate (ADP)Sigma AldrichA2754
Adenosine monophosphate (AMP)Sigma AldrichA1752
Adenosine triphosphate (ATP)Sigma AldrichA2383
Ammonium Carbonate, HPLC gradeFisher ScientificA/3686/50
Atlantis Premier BEH Z-HILIC column (100 x 2.1 mm, 1.7 µm)Waters186009982
B220-A647Invitrogen103226
B220-PE/Cy7BioLegend103222RRID:AB_313005
CD11b-PE/Cy7BioLegend101216RRID:AB_312799
CD150-BV605BioLegend115927RRID:AB_11204248
CD3-PEInvitrogen12-0031-83
CD48-BV421BioLegend103428RRID:AB_2650894
CD4-PE/Cy7BioLegend100422RRID:AB_2660860
CD8a-PE/Cy7BioLegend100722RRID:AB_312761
cKit-PEBioLegend105808RRID:AB_313217
Dynabeads Untouched Mouse CD4 Cells Kit Invitrogen11415D
FACSAria IIIBD
Gr1-PE/Cy7BioLegend108416RRID:AB_313381
Heat sealing foilNeolabJul-18
IsoleucineSigma Aldrich58880
JetStream ESI SourceAgilentG1958B
LeucineSigma AldrichL8000
Medronic acidSigma AldrichM9508-1G
Methanol, LC-MS gradeCarl RothHN41.2
NaClFluka31434-1KG
PBSSigma AldrichD8537
Sca1-APC/Cy7BioLegend108126RRID:AB_10645327
TER119-PE/Cy7BioLegend116221RRID:AB_2137789
Triple Quadrupole Mass SpectrometerAgilent6495B
Twin.tec PCR plate 96 well LoBind skirtedEppendorf30129512
UHPLC AutosamplerAgilentG7157B
UHPLC Column ThermostatAgilentG7116B
UHPLC PumpAgilentG7120A
UHPLC Sample ThermostatAgilentG4761A

References

  1. Jang, C., Chen, L., Rabinowitz, J. D. Metabolomics and isotope tracing. Cell. 173 (4), 822-837 (2018).
  2. Lu, W., Su, X., Klein, M. S., Lewis, I. A., Fieh, O., Rabinowitz, J. D. Metabolite measurement: Pitfalls to avoid and practices to follow.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

204

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Research

Education

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved