Nadir Primer Hücrelerde Hedeflenen Metabolomikler

Özet

Burada, nadir hücre tiplerinde metabolitleri doğru ve güvenilir bir şekilde ölçmek için bir protokol sunuyoruz. Hücre sınıflandırması için modifiye edilmiş bir kılıf sıvısı ve ilgili boş numunelerin oluşturulması da dahil olmak üzere teknik iyileştirmeler, numune başına yalnızca 5000 hücrelik bir girdi ile metabolitlerin kapsamlı bir miktar tayinini sağlar.

Özet

Hücresel fonksiyon kritik olarak metabolizmaya bağlıdır ve altta yatan metabolik ağların fonksiyonu, küçük moleküllü ara ürünler ölçülerek incelenebilir. Bununla birlikte, özellikle hematopoietik kök hücreler gibi nadir hücre tiplerinde hücresel metabolizmanın doğru ve güvenilir ölçümlerinin elde edilmesi, geleneksel olarak birden fazla hayvandan alınan hücrelerin toplanmasını gerektirmiştir. Bir protokol artık araştırmacıların, daha bol hücre tipleri için birden fazla kopya üretirken, örnek başına yalnızca bir fare kullanarak nadir hücre tiplerindeki metabolitleri ölçmelerini sağlıyor. Bu, belirli bir proje için gerekli olan hayvan sayısını azaltır. Burada sunulan protokol, bir kılıf sıvısı olarak 5 g / L NaCl kullanmak, doğrudan asetonitril'e ayırmak ve iç standartların titiz kullanımıyla hedeflenen miktar tayinini kullanmak gibi geleneksel metabolomik protokollere göre birkaç önemli farklılık içerir ve hücresel metabolizmanın daha doğru ve kapsamlı ölçümlerine izin verir. Tek hücrelerin izolasyonu, floresan boyama ve sıralama için gereken süreye rağmen, protokol hücre tipleri ve ilaç tedavileri arasındaki farklılıkları büyük ölçüde koruyabilir.

Giriş

Metabolizma, tüm canlı hücrelerde meydana gelen önemli bir biyolojik süreçtir. Metabolik süreçler, hücrelerin enerji üretmesine ve temel biyomolekülleri sentezlemesine izin veren, sıkı bir şekilde düzenlenmiş ve birbirine bağlı geniş bir biyokimyasal reaksiyon ağını içerir¹. Metabolik ağların işlevini anlamak için araştırmacılar, hücrelerdeki küçük moleküllü ara ürünlerin seviyelerini ölçerler. Bu ara ürünler, metabolik aktivitenin önemli göstergeleri olarak hizmet eder ve hücresel fonksiyona ilişkin kritik bilgileri ortaya çıkarabilir.

Kütle spektrometresi (MS), karmaşık numunelerde metabolitlerin spesifik tespiti i....

Protokol

Bu protokol için kullanılan tüm farelerin üreme ve yetiştiriciliği, yerel makamların (Regierungspräsidium Freiburg) düzenlemelerine göre Max Planck İmmünobiyoloji ve Epigenetik Enstitüsü'ndeki (MPI-IE) geleneksel bir hayvan tesisinde gerçekleştirildi. Fareler, MPI-IE'nin hayvan refahı komitesi ve yerel makamlar tarafından onaylanan yönergeler ve düzenlemeler izlenerek FELASA B eğitimli personel tarafından CO₂ ve servikal çıkık ile ötenazi yapıldı. Hiçbir hayvan deneyi yapılmadı ve farelerin sağlık yükü yoktu.

NOT: Bu protokolde kullanılan LC-MS yöntemi gibi son derece hassas analitik yöntemler, numunedeki çok küçük kontaminasyonl....

Tartışmalar

Bu protokolü kullanarak hedeflenen metabolomiklerin başarılı bir şekilde uygulanması için en kritik adımlar şunlardır: 1) temiz hücre popülasyonları sağlayacak sağlam bir boyama ve geçit stratejisi 2) sıvı hacimlerinin hassas bir şekilde işlenmesi, 3) tüm deneysel adımların tekrarlanabilir zamanlaması, özellikle metabolit ekstraksiyonundan önceki tüm adımlar. İdeal olarak, bir deneye ait tüm numuneler, parti etkilerini en aza indirmek için tek bir partide işlenmeli ve ölçülmelidir

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
13C yeast extract	Isotopic Solutions	ISO-1
40 µm cell strainer	Corning	352340
Acetonitrile, LC-MS grade	VWR	83640.32
ACK lysis buffer	Gibco	104921	Alternatively: Lonza, Cat# BP10-548E
Adenosine diphosphate (ADP)	Sigma Aldrich	A2754
Adenosine monophosphate (AMP)	Sigma Aldrich	A1752
Adenosine triphosphate (ATP)	Sigma Aldrich	A2383
Ammonium Carbonate, HPLC grade	Fisher Scientific	A/3686/50
Atlantis Premier BEH Z-HILIC column (100 x 2.1 mm, 1.7 µm)	Waters	186009982
B220-A647	Invitrogen	103226
B220-PE/Cy7	BioLegend	103222	RRID:AB_313005
CD11b-PE/Cy7	BioLegend	101216	RRID:AB_312799
CD150-BV605	BioLegend	115927	RRID:AB_11204248
CD3-PE	Invitrogen	12-0031-83
CD48-BV421	BioLegend	103428	RRID:AB_2650894
CD4-PE/Cy7	BioLegend	100422	RRID:AB_2660860
CD8a-PE/Cy7	BioLegend	100722	RRID:AB_312761
cKit-PE	BioLegend	105808	RRID:AB_313217
Dynabeads Untouched Mouse CD4 Cells Kit	Invitrogen	11415D
FACSAria III	BD
Gr1-PE/Cy7	BioLegend	108416	RRID:AB_313381
Heat sealing foil	Neolab	Jul-18
Isoleucine	Sigma Aldrich	58880
JetStream ESI Source	Agilent	G1958B
Leucine	Sigma Aldrich	L8000
Medronic acid	Sigma Aldrich	M9508-1G
Methanol, LC-MS grade	Carl Roth	HN41.2
NaCl	Fluka	31434-1KG
PBS	Sigma Aldrich	D8537
Sca1-APC/Cy7	BioLegend	108126	RRID:AB_10645327
TER119-PE/Cy7	BioLegend	116221	RRID:AB_2137789
Triple Quadrupole Mass Spectrometer	Agilent	6495B
Twin.tec PCR plate 96 well LoBind skirted	Eppendorf	30129512
UHPLC Autosampler	Agilent	G7157B
UHPLC Column Thermostat	Agilent	G7116B
UHPLC Pump	Agilent	G7120A
UHPLC Sample Thermostat	Agilent	G4761A