Gezielte Metabolomik an seltenen Primärzellen

Zusammenfassung

Hier stellen wir ein Protokoll vor, um Metaboliten in seltenen Zelltypen genau und zuverlässig zu messen. Technische Verbesserungen, darunter eine modifizierte Mantelflüssigkeit zur Zellsortierung und die Generierung relevanter Blindproben, ermöglichen eine umfassende Quantifizierung von Metaboliten mit einem Input von nur 5000 Zellen pro Probe.

Zusammenfassung

Die zelluläre Funktion hängt entscheidend vom Stoffwechsel ab, und die Funktion der zugrunde liegenden Stoffwechselnetzwerke kann durch die Messung von niedermolekularen Zwischenprodukten untersucht werden. Um genaue und zuverlässige Messungen des Zellstoffwechsels zu erhalten, insbesondere bei seltenen Zelltypen wie hämatopoetischen Stammzellen, war es jedoch traditionell erforderlich, Zellen von mehreren Tieren zu poolen. Ein Protokoll ermöglicht es Forschern nun, Metaboliten in seltenen Zelltypen mit nur einer Maus pro Probe zu messen und gleichzeitig mehrere Replikate für häufigere Zelltypen zu generieren. Dadurch reduziert sich die Anzahl der Tiere, die für ein bestimmtes Projekt benötigt werden. Das hier vorgestellte Protokoll weist mehrere wesentliche Unterschiede zu herkömmlichen Metabolomik-Protokollen auf, wie z. B. die Verwendung von 5 g/L NaCl als Mantelflüssigkeit, die direkte Sortierung in Acetonitril und die gezielte Quantifizierung unter strenger Verwendung interner Standards, die genauere und umfassendere Messungen des Zellstoffwechsels ermöglichen. Trotz des Zeitaufwands für die Isolierung einzelner Zellen, die Fluoreszenzfärbung und die Sortierung kann das Protokoll die Unterschiede zwischen Zelltypen und medikamentösen Behandlungen weitgehend erhalten.

Einleitung

Der Stoffwechsel ist ein essentieller biologischer Prozess, der in allen lebenden Zellen abläuft. Stoffwechselprozesse umfassen ein riesiges Netzwerk biochemischer Reaktionen, die eng reguliert und miteinander verbunden sind und es den Zellen ermöglichen, Energie zu produzieren und essentielle Biomoleküle zu synthetisieren¹. Um die Funktion von Stoffwechselnetzwerken zu verstehen, messen Forscher den Gehalt an niedermolekularen Zwischenprodukten in Zellen. Diese Zwischenprodukte dienen als wichtige Indikatoren für die Stoffwechselaktivität und können wichtige Erkenntnisse über die Zellfunktion liefern.

Die Massenspek....

Protokoll

Die Zucht und Haltung aller für dieses Protokoll verwendeten Mäuse erfolgte in einer konventionellen Tiereinrichtung am Max-Planck-Institut für Immunbiologie und Epigenetik (MPI-IE) gemäß den Vorschriften des Regierungspräsidiums Freiburg. Die Mäuse wurden mit CO_{2 und} Gebärmutterhalsverrenkungen von FELASA B-geschultem Personal nach Richtlinien und Vorschriften eingeschläfert, die vom Tierschutzkomitee des MPI-IE und den lokalen Behörden genehmigt wurden. Es wurden keine Tierversuche durchgeführt und die Mäuse waren gesundheitlich unbedenklich.

HINWEIS: Hochempfindliche Analysemethoden wie die in diesem Protokoll verwendete LC-MS....

Diskussion

Die wichtigsten Schritte für die erfolgreiche Implementierung einer gezielten Metabolomik mit diesem Protokoll sind 1) eine robuste Färbe- und Gating-Strategie, die saubere Zellpopulationen liefert, 2) eine präzise Handhabung von Flüssigkeitsvolumina, 3) ein reproduzierbares Timing aller experimentellen Schritte, insbesondere aller Schritte vor der Metabolitenextraktion. Im Idealfall sollten alle Proben, die zu einem Experiment gehören, in einem Batch verarbeitet und gemessen werden, um Batch-Effekte zu minimieren

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
13C yeast extract	Isotopic Solutions	ISO-1
40 µm cell strainer	Corning	352340
Acetonitrile, LC-MS grade	VWR	83640.32
ACK lysis buffer	Gibco	104921	Alternatively: Lonza, Cat# BP10-548E
Adenosine diphosphate (ADP)	Sigma Aldrich	A2754
Adenosine monophosphate (AMP)	Sigma Aldrich	A1752
Adenosine triphosphate (ATP)	Sigma Aldrich	A2383
Ammonium Carbonate, HPLC grade	Fisher Scientific	A/3686/50
Atlantis Premier BEH Z-HILIC column (100 x 2.1 mm, 1.7 µm)	Waters	186009982
B220-A647	Invitrogen	103226
B220-PE/Cy7	BioLegend	103222	RRID:AB_313005
CD11b-PE/Cy7	BioLegend	101216	RRID:AB_312799
CD150-BV605	BioLegend	115927	RRID:AB_11204248
CD3-PE	Invitrogen	12-0031-83
CD48-BV421	BioLegend	103428	RRID:AB_2650894
CD4-PE/Cy7	BioLegend	100422	RRID:AB_2660860
CD8a-PE/Cy7	BioLegend	100722	RRID:AB_312761
cKit-PE	BioLegend	105808	RRID:AB_313217
Dynabeads Untouched Mouse CD4 Cells Kit	Invitrogen	11415D
FACSAria III	BD
Gr1-PE/Cy7	BioLegend	108416	RRID:AB_313381
Heat sealing foil	Neolab	Jul-18
Isoleucine	Sigma Aldrich	58880
JetStream ESI Source	Agilent	G1958B
Leucine	Sigma Aldrich	L8000
Medronic acid	Sigma Aldrich	M9508-1G
Methanol, LC-MS grade	Carl Roth	HN41.2
NaCl	Fluka	31434-1KG
PBS	Sigma Aldrich	D8537
Sca1-APC/Cy7	BioLegend	108126	RRID:AB_10645327
TER119-PE/Cy7	BioLegend	116221	RRID:AB_2137789
Triple Quadrupole Mass Spectrometer	Agilent	6495B
Twin.tec PCR plate 96 well LoBind skirted	Eppendorf	30129512
UHPLC Autosampler	Agilent	G7157B
UHPLC Column Thermostat	Agilent	G7116B
UHPLC Pump	Agilent	G7120A
UHPLC Sample Thermostat	Agilent	G4761A