Metabolomica mirata su cellule primarie rare

Riepilogo

Qui presentiamo un protocollo per misurare in modo accurato e affidabile i metaboliti in rari tipi di cellule. I miglioramenti tecnici, tra cui un fluido di guaina modificato per la selezione cellulare e la generazione di campioni bianchi pertinenti, consentono una quantificazione completa dei metaboliti con un input di sole 5000 cellule per campione.

Abstract

La funzione cellulare dipende in modo critico dal metabolismo e la funzione delle reti metaboliche sottostanti può essere studiata misurando gli intermedi di piccole molecole. Tuttavia, l'ottenimento di misurazioni accurate e affidabili del metabolismo cellulare, in particolare in tipi di cellule rare come le cellule staminali ematopoietiche, ha tradizionalmente richiesto il raggruppamento di cellule provenienti da più animali. Un protocollo consente ora ai ricercatori di misurare i metaboliti in tipi di cellule rare utilizzando un solo topo per campione, generando al contempo più repliche per tipi di cellule più abbondanti. In questo modo si riduce il numero di animali necessari per un determinato progetto. Il protocollo qui presentato comporta diverse differenze chiave rispetto ai protocolli metabolomici tradizionali, come l'utilizzo di 5 g/L di NaCl come fluido di guaina, lo smistamento diretto in acetonitrile e l'utilizzo di una quantificazione mirata con un uso rigoroso di standard interni, consentendo misurazioni più accurate e complete del metabolismo cellulare. Nonostante il tempo necessario per l'isolamento delle singole cellule, la colorazione fluorescente e lo smistamento, il protocollo può preservare in larga misura le differenze tra i tipi di cellule e i trattamenti farmacologici.

Introduzione

Il metabolismo è un processo biologico essenziale che si verifica in tutte le cellule viventi. I processi metabolici coinvolgono una vasta rete di reazioni biochimiche strettamente regolate e interconnesse, consentendo alle cellule di produrre energia e sintetizzare biomolecole essenziali¹. Per comprendere la funzione delle reti metaboliche, i ricercatori misurano i livelli di piccole molecole intermedie all'interno delle cellule. Questi intermedi fungono da importanti indicatori dell'attività metabolica e possono rivelare informazioni critiche sulla funzione cellulare.

La spettrometria di massa (MS) è la scelta più popolare per la rilevazione specifica di metaboliti in campioni complessi ^1,2. La risonanza magnetica nucleare (NMR) presenta vantaggi nella quantificazione assoluta dei composti e nella delucidazione della struttura, ma la MS può spesso risolvere più componenti in miscele complesse come biofluidi o estratti cellulari. Il più delle volte, la MS è combinata con la separazione preventiva del composto mediante elettroforesi capillare (CE), gascromatografia (GC) o cromatografia liquida (LC)³. La scelta della piattaforma di separazione è guidata principalmente dalla gamma di metaboliti target e dal tipo di campione e, in un contesto reale, dalla disponibilità di macchine e competenze. Tutte e tre le piattaforme di separazione hanno una gamma ampia e sovrapposta di metaboliti adatti, ma limitazioni diverse. In breve, la CE può solo separare le molecole cariche e richiede molta esperienza per implementare un'analisi robusta di un gran numero di campioni⁴. La GC è limitata alle molecole che sono abbastanza piccole e apolari da evaporare prima di decomporsi³. Considerando tutte le colonne LC disponibili in commercio, due metaboliti qualsiasi possono essere separati con questa tecnologia⁵. Tuttavia, molti metodi LC mostrano un potere risolutivo inferiore rispetto ai metodi CE o GC di lunghezza simile.

La quantità tipica di materiale di partenza per le misurazioni metabolomiche è solitamente compresa tra 5 x 10^e 5 x 10⁷ cellule per campione, 5-50 mg di tessuto umido o 5-50 μL di fluido corporeo⁶. Tuttavia, può essere difficile ottenere tali quantità di materiale di partenza quando si lavora con cellule primarie di tipi di cellule rare, come ad esempio le cellule staminali ematopoietiche (HSC) o le cellule tumorali circolanti. Queste cellule sono spesso presenti in numero molto basso e non possono essere coltivate senza compromettere le caratteristiche cellulari critiche.

Le HSC e le cellule progenitrici multipotenti (MPP) sono le cellule meno differenziate del sistema ematopoietico e producono continuamente nuove cellule del sangue per tutta la vita di un organismo. La regolazione dell'emopoiesi è di rilevanza clinica in condizioni come la leucemia e l'anemia. Nonostante la loro importanza, le HSC e le MPP sono tra le cellule più rare all'interno del sistema ematopoietico. Da un singolo topo, tipicamente, si possono isolare circa 5000 HSC ^7,8,9. Poiché i metodi metabolomici tradizionali richiedono più materiale di input, è stato spesso necessario raggruppare le cellule di più topi per analizzare i tipi di cellule rare^10,11.

Qui, abbiamo mirato a sviluppare un protocollo che consenta la misurazione dei metaboliti in appena 5000 cellule per campione per consentire la generazione di dati metabolomici dalle HSC di un singolo topo¹². Allo stesso tempo, questo metodo consente di generare più repliche da un singolo topo per tipi di cellule più abbondanti come i linfociti. Questo approccio riduce il numero di animali necessari per un determinato progetto, contribuendo così alle "3R" (riduzione, sostituzione, perfezionamento) degli esperimenti sugli animali.

I metaboliti nelle cellule possono avere tassi di turnover molto elevati, spesso nell'ordine dei secondi¹³. Tuttavia, la preparazione dei campioni per lo smistamento delle cellule attivate dalla fluorescenza (FACS) può richiedere ore e lo smistamento FACS stesso può richiedere da minuti a ore, portando a potenziali alterazioni del metaboloma a causa di condizioni non fisiologiche. Alcuni dei reagenti utilizzati in questo protocollo (come il tampone di lisi ammonio-cloruro-potassio [ACK]) possono avere effetti simili. Queste condizioni possono causare stress cellulare e avere un impatto sui livelli e sui rapporti dei metaboliti all'interno delle cellule, portando a misurazioni imprecise o distorte del metabolismo cellulare 14,15,16. I cambiamenti metabolici dovuti alla preparazione del campione sono talvolta indicati come artefatti di smistamento. I lunghi protocolli di digestione e i reagenti aggressivi che potrebbero essere necessari per produrre sospensioni unicellulari da tessuti duri o duri possono aggravare questo problema. I cambiamenti che possono verificarsi dipendono probabilmente dal tipo di cellula e dalle condizioni di elaborazione. La natura precisa dei cambiamenti rimane sconosciuta, poiché lo stato metabolico delle cellule indisturbate nel tessuto vivente non può essere misurato.

Il protocollo qui presentato comporta diverse differenze chiave rispetto ai metodi tradizionali, vale a dire l'uso di 5 g/L di NaCl come fluido di guaina, lo smistamento diretto nel tampone di estrazione, l'iniezione di grandi volumi di campione sull'interazione idrofila cromatografia liquida-spettrometria di massa (HILIC-MS) e l'utilizzo di una quantificazione mirata, l'uso rigoroso di standard interni e controlli di fondo (Figura 1). Questo protocollo ha il potenziale per preservare in larga misura le differenze tra i tipi di cellule e tra il trattamento farmacologico e il controllo del veicolo¹². Anche per le cellule in coltura, si confronta favorevolmente con approcci alternativi, come la centrifugazione più consolidata e la rimozione manuale del surnatante. Tuttavia, poiché gli artefatti di ordinamento possono ancora verificarsi, i dati devono essere interpretati con cautela. Nonostante questa limitazione, il protocollo rappresenta un miglioramento significativo nel campo della profilazione metabolica, consentendo misurazioni più accurate e complete del metabolismo cellulare in cellule primarie rare¹².

La capacità di misurare in modo robusto ampi profili metabolici in cellule primarie rare apre la porta a nuovi esperimenti di ricerca biomedica che coinvolgono queste cellule. Ad esempio, è stato dimostrato che la regolazione metabolicamente mediata nelle HSC ha un impatto sulla capacità di auto-rinnovamento della dormienza, con implicazioni per l'anemia e la leucemia^11,17. Nelle cellule tumorali circolanti derivate da pazienti, sono state dimostrate differenze nell'espressione dei geni metabolici tra il tumore e le cellule adiacenti^18,19. Questo protocollo consente ora ai ricercatori di studiare sistematicamente queste differenze a livello metabolico, che è generalmente considerato più vicino al fenotipo cellulare che all'espressione genica.

Protocollo

L'allevamento e l'allevamento di tutti i topi utilizzati per questo protocollo sono stati condotti in una struttura per animali convenzionale presso l'Istituto Max Planck per l'immunobiologia e l'epigenetica (MPI-IE) secondo i regolamenti delle autorità locali (Regierungspräsidium Freiburg). I topi sono stati sottoposti a eutanasia con CO₂ e lussazione cervicale da personale addestrato FELASA B seguendo le linee guida e i regolamenti approvati dal comitato per il benessere degli animali del MPI-IE e dalle autorità locali. Non è stata eseguita alcuna sperimentazione animale e i topi non hanno avuto problemi di salute.

NOTA: I metodi analitici altamente sensibili come il metodo LC-MS utilizzato in questo protocollo hanno il potenziale per rilevare anche contaminazioni molto piccole nel campione. Pertanto, è della massima importanza ridurre al minimo tali contaminazioni. La misura più importante è quella di indossare guanti puliti ogni volta che si tocca qualcosa che viene a contatto con i campioni. Ciò include, ad esempio, la preparazione di tamponi e fluidi di guaina, l'etichettatura delle provette dei campioni e la pulizia delle apparecchiature di laboratorio. Inoltre, il materiale da laboratorio monouso dovrebbe essere utilizzato quando possibile. La vetreria deve essere risciacquata con solventi di grado LC-MS prima dell'uso. Un ambiente di lavoro pulito aiuta ulteriormente a ridurre le contaminazioni.

1. Preparativi generali

1. Preparare la soluzione madre standard interna: preparare 6 mg/mL di cloro-fenilalanina (CLF) e 6 mg/mL di acido amminotereftalico (ATA) in 2-propanolo al 30% v/v in acqua ultrapura.
2. Preparare il tampone di risospensione FACS: aggiungere 0,9 g di NaCl, 99,5 mL di acqua ultrapura e 0,5 mL di soluzione madre standard interna. Preraffreddare a 4 °C.
3. Preparare il fluido della guaina: in un serbatoio del fluido della guaina, sciogliere 30 g di NaCl in 6 L di acqua deionizzata e collegarlo a un selezionatore di cellule.
   NOTA: La concentrazione di NaCl nel fluido della guaina è stata ottimizzata per consentire la deflessione delle goccioline nel selezionatore che è robusta come quando si utilizza il PBS come fluido della guaina e contemporaneamente per ridurre al minimo gli effetti negativi sul rilevamento dei metaboliti mediante LC-MS¹². Concentrazioni più basse di NaCl sono vantaggiose per il rilevamento dei metaboliti, ma compromettono il robusto smistamento delle cellule.

2. Isolamento delle cellule B e T dalla milza

1. Preraffreddare 90 mL di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) per topo in frigorifero o su ghiaccio a 4 °C. Preraffreddare una centrifuga a 4 °C.
2. Isolamento della milza
   NOTA: È fondamentale lavorare velocemente, su ghiaccio e con tamponi freddi (4 °C) durante l'isolamento cellulare e le seguenti fasi di colorazione. In caso contrario, il profilo metabolico delle cellule potrebbe cambiare considerevolmente.
   1. Preparare 1,5 mL di PBS in una provetta di reazione da 2 mL su ghiaccio.
   2. Sopprimere un topo C57BL6/J secondo le linee guida e i metodi approvati dalle autorità locali.
   3. Sterilizzare la pelliccia con etanolo al 70%.
   4. Aprire l'addome con le forbici e rimuovere la milza usando una pinza sottile senza rompere l'organo. Mettere immediatamente la milza in PBS freddo (4 °C).
3. Generazione di una sospensione monocellulare
   1. Posizionare un colino cellulare da 70 μm su una provetta da centrifuga da 50 mL e bagnarla con PBS. Far passare la milza attraverso la rete utilizzando il poggiapollice di uno stantuffo da siringa e 30 mL di PBS freddo (4 °C)
   2. Centrifugare a 300 x g per 5 min. Rimuovere il surnatante.
   3. Risospendere il pellet in 1 mL di tampone di lisi ACK e incubare per 2 minuti a temperatura ambiente (RT; 20 °C).
   4. Aggiungere 50 mL di PBS freddo (4 °C). Centrifugare a 300 x g per 5 minuti ed eliminare il surnatante.
4. Colorazione FACS
   1. Preparare il cocktail di anticorpi in 500 μL di PBS freddo (4 °C) per topo: CD3-PE (1:200), B220-A647 (1:200).
   2. Risospendere il pellet cellulare nel cocktail di anticorpi. Trasferire in una provetta FACS da 5 mL. Incubare per 30 minuti a 4 °C al buio.
   3. Aggiungere 3 mL di PBS freddo (4 °C). Centrifugare a 300 x g per 5 minuti ed eliminare il surnatante.
   4. Risospendere il pellet cellulare in 1 mL di tampone di risospensione FACS freddo (4 °C). Filtrare le celle attraverso un tubo FACS con tappo filtrante. Le cellule sono pronte per lo smistamento basato sulla citometria a flusso.

3. Isolamento di HSC e MPPs dal midollo osseo

1. Sezionare e isolare il midollo osseo.
   NOTA: È molto importante lavorare velocemente e mantenere le ossa isolate e le cellule fredde (4 °C) durante l'intera procedura per consentire risultati accurati. Inoltre, per ridurre al minimo i segnali di fondo, lavorare e utilizzare uno spazio pulito e attrezzature di laboratorio.
   1. Sopprimere i topi secondo le linee guida e i metodi approvati dalle autorità locali.
   2. Spruzzare etanolo al 70% sulla parte inferiore dei topi.
   3. Sezionare le gambe e le spine usando le forbici. Fai un'incisione sulla schiena ed estendi il taglio fino all'addome. Staccare la pelle dagli arti posteriori.
   4. Strappa o taglia gli arti posteriori e assicurati che le gambe contengano la tibia, il femore e l'articolazione dell'anca.
   5. Prendi le forbici e tagliale vicino alla colonna vertebrale fino a rimuoverle completamente.
   6. Distribuire le gambe e le spine in piastre a 6 pozzetti contenenti PBS freddo (4 °C) e tenere le piastre su ghiaccio.
   7. Pulisci il femore, la tibia, l'articolazione dell'anca e le vertebre dai tessuti molli usando un bisturi e delle forbici.
   8. Schiacciare le ossa pulite con mortaio e pestello in 5 ml di PBS freddo (4 °C).
   9. Filtrare la sospensione cellulare attraverso un colino cellulare da 40 μm in una provetta da 50 ml.
   10. Ripetere i passaggi 3.1.8-3.1.9 fino a quando le ossa appaiono completamente bianche.
2. Lisi degli eritrociti:
   1. Centrifugare la sospensione cellulare raccolta a 400 x g per 5 minuti a 4 °C ed eliminare il surnatante.
   2. Risospendere il pellet cellulare in 1 mL di tampone ACK freddo (4 °C). Incubare per 5 minuti con ghiaccio.
   3. Aggiungere PBS freddo (4 °C) per arrestare la reazione (opzionale).
   4. Centrifugare a 400 x g per 5 minuti a 4 °C ed eliminare il surnatante.
3. Esaurimento del lignaggio:
   NOTA: Per arricchire le cellule negative del lignaggio (Lin-), è stato utilizzato un kit di selezione negativa per le cellule CD4.
   1. Preparare le perline magnetiche:
      1. Aggiungere 500 μL di microsfere in provette per microcentrifuga da 2 mL. Posizionare le provette su un magnete e gettare il surnatante.
      2. Lavare le perle con 1 mL di PBS freddo (4 °C) ed eliminare il surnatante.
      3. Aggiungere 500 μL di PBS freddo (4 °C) e mantenere le perle fredde (4 °C).
   2. Incubare le cellule con 500 μL di cocktail di lignaggio (50 μL di anticorpo fornito dal kit + 450 μL di PBS) per 25 minuti (agitazione, 4 °C) al buio.
   3. Lavare le celle con PBS freddo (4 °C).
   4. Centrifugare la provetta a 400 x g per 5 minuti a 4 °C ed eliminare il surnatante.
   5. Risospendere le cellule in 1000 μL di PBS freddo (4 °C) e trasferire la sospensione cellulare nella soluzione di microsfere.
   6. Incubare per 15 minuti su una ruota rotante a 4 °C.
   7. Posiziona i tubi su un magnete e attendi che la soluzione si schiarisca. Trasferire il surnatante in una provetta FACS fresca.
   8. Lavare le perle con 500 μL di PBS.
   9. Posiziona i tubi su un magnete e attendi che la soluzione si schiarisca.
   10. Trasferire il surnatante nella provetta FACS fresca.
   11. Centrifugare a 400 x g per 5 minuti a 4 °C ed eliminare il surnatante.
4. Colorazione per FACS
   1. Preparare 300 μL di miscela di anticorpi per topo in PBS a freddo (4 °C).
   2. Mix di anticorpi per cellule staminali/progenitrici: HSCs: CD4 (1:1000) / CD8a (1:1000) / B220 (1:1000) / Ter119 (1:500) / Gr-1 (1:1000) / CD11b - PeCy7 (1:1000), c-Kit - PE (1:1000), Sca1 - APC-Cy7 (1:500), CD48 - BV421 (1:1000), CD150 - BV605 (1:300)
   3. Incubare le cellule per 40 minuti al buio a 4 °C.
   4. Lavare con 1 mL di PBS freddo (4 °C). Centrifugare a 400 x g per 5 minuti a 4 °C ed eliminare il surnatante.
   5. Risospendere il pellet cellulare in 1 mL di tampone di risospensione FACS e filtrare le cellule attraverso una provetta FACS con tappo filtrante.

4. Smistamento FACS

1. Impostare il selezionatore di celle.
   1. Inserire la punta dell'ugello da 70 μm. Attiva laser da 405 nm, 488 nm, 561 nm e 633 nm.
   2. Impostare la modalità di ordinamento su Purezza a 4 vie: maschera di resa 0, maschera di purezza 32, maschera di fase 0
   3. Impostare la frequenza di caduta su 90.400 Hz e regolare l'ampiezza e il ritardo di caduta secondo le istruzioni del produttore. Impostare la tensione di placca a 5000 V.
   4. Definire i cancelli di smistamento secondo le istruzioni del produttore.
      1. Per tutti i tipi di cellule, selezionare prima le singole cellule in base al segnale di dispersione diretta e laterale di dispersione, quindi selezionare in base alla colorazione specifica del tipo di cellula.
      2. Per le cellule B, selezionare la popolazione AF647-positiva e PE-negativa.
      3. Per le cellule T, selezionare la popolazione PE-positiva e AF647-negativa.
      4. Per le HSC, selezionare la popolazione PE-Cy7-bassa, PE-positiva, APC-Cy7-positiva, BV605-positiva, BV421-negativa.
      5. Per gli MPP, selezionare la popolazione PE-Cy7-bassa, PE-positiva, APC-Cy7-positiva, BV421-positiva, BV605-negativa.
      6. Per i campioni di detriti, selezionare gli eventi troppo piccoli per rappresentare le cellule intatte in base al segnale di dispersione diretta e laterale. I tipici grafici FACS che mostrano queste strategie di gating sono mostrati nella Figura 2 e nella Figura 3.
   5. Regolare la portata per ottenere meno di 15.000 eventi/s.
2. Preparare il piatto di raccolta
   1. Preparare la soluzione madre dell'estratto di lievito: risospendere 1 aliquota di estratto di lievito ¹³C in 7,5 mL di H₂O ultrapuro e 2,5 mL di metanolo.
   2. Preparare il tampone di estrazione: aggiungere 10 μL di soluzione madre di estratto di lievito ¹³C a 10 mL di acetonitrile e mescolare.
   3. Preparare la piastra di raccolta: aggiungere 25 μL di tampone di estrazione a ciascun pozzetto di una piastra PCR a 96 pozzetti che verrà utilizzata per raccogliere il campione. Per ridurre al minimo l'evaporazione, coprire i pozzetti con coperchi PCR (strisce tagliate in singoletti).
3. Eseguire l'ordinamento delle celle.
   1. Aprire i pozzetti di raccolta secondo necessità per raccogliere le cellule selezionate e chiuderli il prima possibile per ridurre al minimo l'evaporazione.
4. Se i campioni non possono essere misurati immediatamente, conservarli in contenitori sigillati a -80 °C per diversi giorni. Dopo lo scongelamento, sonicare i campioni per 5 minuti per garantire la completa risospensione dei metaboliti.

5. Misurazione LC-QQQ-MS

1. Preparazione dei solventi LC
   1. Preparare la soluzione madre di acido medronico (100 mM): sciogliere 17,6 mg di acido medronico in 1 mL di H₂O ultrapuro.
   2. Preparare il tampone A: sciogliere 1,92 g di carbonato di ammonio in 1 L di H₂O ultrapuro e aggiungere 50 μL di soluzione madre di acido medronico.
   3. Preparare il tampone B: mescolare 50 mL di tampone con 450 mL di acetonitrile.
   4. Preparare la miscela per il test LC: mescolare 1 ppm ciascuno di leucina, isoleucina, AMP, ADP e ATP in acetonitrile 80:20: H₂O ultrapuro.
      NOTA: Le scorte di acido medronico possono essere conservate a -20 °C per diversi mesi; altri tamponi possono essere mantenuti a RT per 2 giorni.
2. Metodo programmato LC-QQQ-MS
   1. Ottimizzare le impostazioni MS specifiche della mescola (ad esempio, l'energia di collisione) secondo le istruzioni del produttore. Per gli strumenti Agilent serie 6495, utilizzare le impostazioni nella Tabella supplementare 1.
   2. Ottimizza le impostazioni MS specifiche della sorgente in base alle istruzioni del produttore. Per gli strumenti con sorgente ESI riscaldata JetStream, utilizzare i seguenti parametri: temperatura del gas: 240 °C, flusso del gas: 15 L/min, nebulizzatore: 50 psi, temperatura del gas della guaina: 400 °C, flusso del gas della guaina: 11 L/min, tensione capillare: 2000 V, tensione dell'ugello: 300 V.
   3. Ottimizza le impostazioni delle ottiche a trasferimento ionico secondo le istruzioni del produttore. Per gli strumenti Agilent con ottica ionica iFunnel, utilizzare i seguenti parametri: RF ad alta pressione positiva: 110 V, RF ad alta pressione negativa: 90 V, RF a bassa pressione positiva: 80 V, RF a bassa pressione negativa: 60 V.
   4. Programmare il gradiente LC: 0 min, 95% B, 150 μL/min; 18 min, 55% B, 150 μL/min; 19 min, 30% B, 150 μL/min; 21,5 min, 30% B, 150 μL/min; 22 min, 95% B, 150 μL/min; 22,7 min, 95% B, 200 μL/min, 23,5 min, 95% B, 400 μL/min; Tempo di sosta 28 min. Temperatura della colonna: 35 °C.
3. Configurare lo strumento LC-MS.
   1. Collegare la colonna cromatografica al vano colonna a temperatura controllata.
   2. Collegare i buffer ed eliminare tutte le linee.
   3. Eseguire almeno 4 campioni vuoti o campioni di pool per bilanciare la colonna.
4. Eseguire la miscela di test LC per verificare le prestazioni cromatografiche. Assicurarsi che siano soddisfatti i seguenti criteri. In caso contrario, pulire o risolvere i problemi dello strumento prima di eseguire i campioni.
   1. Verificare che la contropressione iniziale sia <150 bar e che la contropressione massima sia <400 bar.
   2. Verificare che i tempi di ritenzione siano in una finestra di ±1 minuto come segue: isoleucina 6,0 min, leucina 6,4 min, AMP 9,5 min, ADP 11,2 min e ATP 12,7 min.
   3. Assicurarsi che la valle tra leucina e isoleucina nella transizione +132->86 sia < 20 % dell'altezza del picco.
   4. Assicurarsi che la differenza tra il tempo di ritenzione AMP e ADP sia compresa tra 1,5 e 1,9 minuti e la differenza tra il tempo di ritenzione ADP e ATP sia compresa tra 1,1 e 1,9 minuti.
5. Impostare l'elenco di lavoro
   1. Iniziare con un campione bianco per ridurre al minimo il carry-over dalla miscela di test LC.
   2. Eseguire i campioni in ordine casuale.
   3. Termina con un campione vuoto per pulire la colonna per esperimenti futuri.

6. Pre-elaborazione dei dati in automRm

NOTA: i passaggi seguenti illustrano la conversione da .d a .mzML in msconvert, la preparazione di metabdb, il caricamento di dati e modelli e metabdb e le strategie generali per la revisione manuale dei picchi.

1. Converti i dati grezzi dal formato .d al formato .mzML utilizzando ProteoWizard²⁰ con le seguenti impostazioni: precisione di codifica binaria: 32 bit, livelli MS 1-2, indice di scrittura selezionato, Usa compressione zlib selezionato.
2. Avviare R.
3. Installare automRm²¹ secondo la documentazione della confezione (richiesto solo una volta prima del primo utilizzo).
4. Avvia la GUI di automRm in R: automRm::automrm_gui()
5. Elabora il batch di file .d nella scheda Elabora > Elabora batch.
   1. Selezionare .xlsx file contenente le informazioni sui metaboliti. Questo file deve corrispondere al metodo LC-QQQ-MS.
   2. Selezionare. File RData contenente il modello ML di prelievo dei picchi.
   3. Selezionare. RData contenente il modello di Machine Learning per la creazione di report di picco.
   4. Selezionare la cartella del progetto contenente i file .mzML.
   5. Avviare la pre-elaborazione dei dati facendo clic su Elabora batch.
6. Al termine della pre-elaborazione, aprire peakoverview.pdf per verificare la corretta rilevazione dei picchi cromatografici. Facoltativamente, caricare il file automRmdata_Review.RData dalla scheda Review della GUI di automRm per modificare manualmente il filtraggio e l'integrazione dei picchi.
7. Apri il peakinfo.xlsx dalla cartella del progetto e controlla i dati.
   1. Controllare il segnale standard interno ¹³C nella scheda 13CArea: Assicurarsi che non vi siano differenze sistematiche nei valori di intensità tra i gruppi sperimentali e tra i campioni di cellule e i campioni di detriti. Se tali differenze esistono, utilizzare solo i dati delle schede NormArea o NormHeight per l'analisi successiva; in caso contrario, utilizzare i dati delle schede RawArea o RawHeight.
   2. Controllare l'intensità del segnale degli standard interni ATA e CLF nella scheda RawArea. Assicurarsi che non vi siano differenze sistematiche nell'intensità di entrambi i composti tra i gruppi sperimentali.
   3. Per ciascun metabolita, confrontare l'intensità del segnale dei campioni contenenti cellule con i campioni di detriti della stessa sospensione cellulare. Utilizzare un test statistico appropriato per identificare i metaboliti in cui i campioni contenenti cellule hanno intensità più elevate rispetto ai campioni di detriti. Includere solo i metaboliti che superano questo test nell'analisi successiva dei dati.

Risultati

Il sorting FACS consente l'isolamento di popolazioni pulite di diversi tipi di cellule dalla stessa sospensione cellulare (Figura 2 e Figura 3). La specificità di questo metodo si basa sulla colorazione dei diversi tipi di cellule con specifici marcatori di superficie (ad esempio, cellule B e cellule T della milza) o combinazioni specifiche di marcatori di superficie (ad esempio HSC e MPP). La colorazione dei marcatori intracellulari richiede in genere la perme...

Discussione

I passaggi più critici per un'implementazione di successo della metabolomica mirata utilizzando questo protocollo sono 1) una robusta strategia di colorazione e gating che produrrà popolazioni cellulari pulite 2) una gestione precisa dei volumi di liquido, 3) una tempistica riproducibile di tutte le fasi sperimentali, in particolare tutte le fasi precedenti all'estrazione del metabolita. Idealmente, tutti i campioni appartenenti a un esperimento dovrebbero essere processati e misurati in un lotto per ridurre al minimo ...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
13C yeast extract	Isotopic Solutions	ISO-1
40 µm cell strainer	Corning	352340
Acetonitrile, LC-MS grade	VWR	83640.32
ACK lysis buffer	Gibco	104921	Alternatively: Lonza, Cat# BP10-548E
Adenosine diphosphate (ADP)	Sigma Aldrich	A2754
Adenosine monophosphate (AMP)	Sigma Aldrich	A1752
Adenosine triphosphate (ATP)	Sigma Aldrich	A2383
Ammonium Carbonate, HPLC grade	Fisher Scientific	A/3686/50
Atlantis Premier BEH Z-HILIC column (100 x 2.1 mm, 1.7 µm)	Waters	186009982
B220-A647	Invitrogen	103226
B220-PE/Cy7	BioLegend	103222	RRID:AB_313005
CD11b-PE/Cy7	BioLegend	101216	RRID:AB_312799
CD150-BV605	BioLegend	115927	RRID:AB_11204248
CD3-PE	Invitrogen	12-0031-83
CD48-BV421	BioLegend	103428	RRID:AB_2650894
CD4-PE/Cy7	BioLegend	100422	RRID:AB_2660860
CD8a-PE/Cy7	BioLegend	100722	RRID:AB_312761
cKit-PE	BioLegend	105808	RRID:AB_313217
Dynabeads Untouched Mouse CD4 Cells Kit	Invitrogen	11415D
FACSAria III	BD
Gr1-PE/Cy7	BioLegend	108416	RRID:AB_313381
Heat sealing foil	Neolab	Jul-18
Isoleucine	Sigma Aldrich	58880
JetStream ESI Source	Agilent	G1958B
Leucine	Sigma Aldrich	L8000
Medronic acid	Sigma Aldrich	M9508-1G
Methanol, LC-MS grade	Carl Roth	HN41.2
NaCl	Fluka	31434-1KG
PBS	Sigma Aldrich	D8537
Sca1-APC/Cy7	BioLegend	108126	RRID:AB_10645327
TER119-PE/Cy7	BioLegend	116221	RRID:AB_2137789
Triple Quadrupole Mass Spectrometer	Agilent	6495B
Twin.tec PCR plate 96 well LoBind skirted	Eppendorf	30129512
UHPLC Autosampler	Agilent	G7157B
UHPLC Column Thermostat	Agilent	G7116B
UHPLC Pump	Agilent	G7120A
UHPLC Sample Thermostat	Agilent	G4761A