Таргетная метаболомика на редких первичных клетках

Резюме

Здесь мы представляем протокол для точного и надежного измерения метаболитов в редких типах клеток. Технические усовершенствования, в том числе модифицированная жидкость оболочки для сортировки клеток и генерация соответствующих пустых образцов, позволяют проводить всестороннюю количественную оценку метаболитов с вводом всего 5000 клеток на образец.

Аннотация

Клеточная функция критически зависит от метаболизма, и функцию лежащих в ее основе метаболических сетей можно изучить, измеряя низкомолекулярные промежуточные продукты. Тем не менее, получение точных и надежных измерений клеточного метаболизма, особенно в редких типах клеток, таких как гемопоэтические стволовые клетки, традиционно требовало объединения клеток нескольких животных. Теперь протокол позволяет исследователям измерять метаболиты в редких типах клеток, используя только одну мышь на образец, создавая при этом несколько репликаций для более распространенных типов клеток. Это уменьшает количество животных, которые требуются для данного проекта. Протокол, представленный здесь, имеет несколько ключевых отличий от традиционных протоколов метаболомики, таких как использование 5 г/л NaCl в качестве жидкости оболочки, сортировка непосредственно в ацетонитрил и использование целевого количественного определения со строгим использованием внутренних стандартов, что позволяет проводить более точные и всесторонние измерения клеточного метаболизма. Несмотря на время, необходимое для выделения отдельных клеток, флуоресцентного окрашивания и сортировки, протокол может в значительной степени сохранить различия между типами клеток и лекарственными препаратами.

Введение

Метаболизм – это важнейший биологический процесс, происходящий во всех живых клетках. Метаболические процессы включают в себя обширную сеть биохимических реакций, которые жестко регулируются и взаимосвязаны, позволяя клеткам вырабатывать энергию и синтезировать необходимые^{биомолекулы.} Чтобы понять функцию метаболических сетей, исследователи измеряют уровни низкомолекулярных промежуточных продуктов в клетках. Эти промежуточные продукты служат важными индикаторами метаболической активности и могут дать важную информацию о клеточной функции.

Масс-спектрометрия (МС) является наиболее популярным выбором для специфического....

протокол

Разведение и содержание всех мышей, использованных для этого протокола, проводилось в обычном животноводческом помещении в Институте иммунобиологии и эпигенетики Макса Планка (MPI-IE) в соответствии с правилами местных властей (Regierungspräsidium Freiburg). Мышей усыпляли с помощью_СО2 и вывиха шейки матки персоналом, прошедшим обучение по программе FELASA B, в соответствии с руководящими принципами и правилами, утвержденными комитетом по защите животных MPI-IE и местными властями. Никаких экспериментов на животных не проводилось, и у мышей не было проблем со здоровьем.

ПРИМЕЧАНИЕ: Высокочувствительные аналитические методы, такие....

Результаты

Сортировка FACS позволяет выделять чистые популяции различных типов клеток из одной и той же клеточной суспензии (рис. 2 и рис. 3). Специфичность этого метода заключается в окрашивании различных типов клеток специфическими поверхностными маркерами (наприм?.......

Обсуждение

Наиболее важными шагами для успешной реализации таргетной метаболомики с использованием этого протокола являются: 1) надежная стратегия окрашивания и стробирования, которая позволит получить популяции чистых клеток, 2) точное обращение с объемами жидкости, 3) воспроизводимое время все.......

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
13C yeast extract	Isotopic Solutions	ISO-1
40 µm cell strainer	Corning	352340
Acetonitrile, LC-MS grade	VWR	83640.32
ACK lysis buffer	Gibco	104921	Alternatively: Lonza, Cat# BP10-548E
Adenosine diphosphate (ADP)	Sigma Aldrich	A2754
Adenosine monophosphate (AMP)	Sigma Aldrich	A1752
Adenosine triphosphate (ATP)	Sigma Aldrich	A2383
Ammonium Carbonate, HPLC grade	Fisher Scientific	A/3686/50
Atlantis Premier BEH Z-HILIC column (100 x 2.1 mm, 1.7 µm)	Waters	186009982
B220-A647	Invitrogen	103226
B220-PE/Cy7	BioLegend	103222	RRID:AB_313005
CD11b-PE/Cy7	BioLegend	101216	RRID:AB_312799
CD150-BV605	BioLegend	115927	RRID:AB_11204248
CD3-PE	Invitrogen	12-0031-83
CD48-BV421	BioLegend	103428	RRID:AB_2650894
CD4-PE/Cy7	BioLegend	100422	RRID:AB_2660860
CD8a-PE/Cy7	BioLegend	100722	RRID:AB_312761
cKit-PE	BioLegend	105808	RRID:AB_313217
Dynabeads Untouched Mouse CD4 Cells Kit	Invitrogen	11415D
FACSAria III	BD
Gr1-PE/Cy7	BioLegend	108416	RRID:AB_313381
Heat sealing foil	Neolab	Jul-18
Isoleucine	Sigma Aldrich	58880
JetStream ESI Source	Agilent	G1958B
Leucine	Sigma Aldrich	L8000
Medronic acid	Sigma Aldrich	M9508-1G
Methanol, LC-MS grade	Carl Roth	HN41.2
NaCl	Fluka	31434-1KG
PBS	Sigma Aldrich	D8537
Sca1-APC/Cy7	BioLegend	108126	RRID:AB_10645327
TER119-PE/Cy7	BioLegend	116221	RRID:AB_2137789
Triple Quadrupole Mass Spectrometer	Agilent	6495B
Twin.tec PCR plate 96 well LoBind skirted	Eppendorf	30129512
UHPLC Autosampler	Agilent	G7157B
UHPLC Column Thermostat	Agilent	G7116B
UHPLC Pump	Agilent	G7120A
UHPLC Sample Thermostat	Agilent	G4761A