希少初代細胞のターゲットメタボロミクス

要約

ここでは、希少な細胞タイプの代謝物を正確かつ確実に測定するためのプロトコルを紹介します。細胞選別用の改良シース液や関連するブランクサンプルの生成などの技術的改善により、サンプルあたりわずか5000細胞のインプットで代謝物の包括的な定量が可能になりました。

要約

細胞機能は代謝に大きく依存しており、その根底にある代謝ネットワークの機能は、低分子中間体を測定することで研究することができます。しかし、特に造血幹細胞のような希少な細胞種において、細胞代謝の正確で信頼性の高い測定値を得るには、従来、複数の動物の細胞をプールする必要がありました。プロトコルにより、研究者は、サンプルごとに1つのマウスのみを使用して希少な細胞タイプの代謝物を測定し、より豊富な細胞タイプに対して複数の複製を生成することができます。これにより、特定のプロジェクトに必要な動物の数が減ります。ここで紹介するプロトコールには、5 g/L NaClをシース液として使用する、アセトニトリルに直接選別する、内部標準を厳密に使用してターゲット定量を利用するなど、従来のメタボロミクスプロトコルとはいくつかの重要な違いがあり、細胞代謝のより正確で包括的な測定を可能にします。単一細胞の単離、蛍光染色、選別に時間がかかるにもかかわらず、このプロトコルは細胞タイプ間および薬物治療の違いを大幅に保持することができます。

概要

代謝は、すべての生細胞で発生する重要な生物学的プロセスです。代謝プロセスには、緊密に制御され相互接続された生化学反応の広大なネットワークが含まれており、細胞がエネルギーを生成し、必須の生体分子を合成することを可能にします¹。代謝ネットワークの機能を理解するために、研究者は細胞内の低分子中間体のレベルを測定します。これらの中間体は、代謝活性の重要な指標として機能し、細胞機能に関する重要な洞察を明らかにすることができます。

質量分析(MS)は、複雑なサンプル中の代謝物を特異的に検出するための最も一般的な選択肢です^1,2。核磁気共鳴(NMR)は、化合物の絶対定量や構造解明に有利ですが、多くの場合、MSは生体液や細胞抽出物などの複雑な混合物中のより多くの成分を分離できます。多くの場合、MSは、キャピラリー電気泳動(CE)、ガスクロマトグラフィー(^{GC)、または}液体クロマトグラフィー(LC)による化合物の事前分離と組み合わされます3。分離プラットホームの選択は、主にターゲット代謝物の範囲とサンプルの種類によって左右され、実際の環境では、機械と専門知識の可用性によって決まります。3つの分離プラットホームはすべて、適切な代謝産物の範囲が広く重複していますが、制限は異なります。簡単....

プロトコル

このプロトコルに使用されたすべてのマウスの繁殖と飼育は、地方自治体(Regierungspräsidium Freiburg)の規制に従って、免疫生物学およびエピジェネティクス(MPI-IE)のマックスプランク研究所の従来の動物施設で行われました。マウスは、MPI-IEの動物福祉委員会および地方自治体によって承認されたガイドラインと規制に従って、FELASA Bの訓練を受けた職員によって_CO2 および子宮頸部脱臼で安楽死させられました。動物実験は行われておらず、マウスは健康上の負担がなかった。

注:このプロトコルで使用される LC-MS 法などの高感度分析法では、サンプル中のごくわずかな汚染でも検出できる可能性があります。したがって、このような汚染を最小限に抑えることが最も重要です。最も重要な対策は、サンプルと接触するものに触れるときはいつでも清潔な手袋を着用することです。これには、例えば、緩衝液やシース液の調製、サンプルチューブのラベリング、実験装置の洗浄などが含まれます。さらに、可能な限りシングルユースの実験器具を使用する必要があります。ガラス器具は、使用前にLC-MSグレードの溶媒ですすぐ必要があります。クリーンな作業環境は、汚染の低減にさらに役立ちます。

1. 一般的な準備

1. 内部標準原液の調製:6 mg/mL のクロロフェニルアラニン(C....

ディスカッション

このプロトコルを使用してターゲットメタボロミクスを成功裏に実施するための最も重要なステップは、1)クリーンな細胞集団をもたらす堅牢な染色およびゲーティング戦略、2)液体量の正確な取り扱い、3)すべての実験ステップ、特に代謝物抽出前のすべてのステップの再現性のあるタイミングです。理想的には、1つの実験に属するすべてのサンプルを1つのバッチで処理および測定して、?.......

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
13C yeast extract	Isotopic Solutions	ISO-1
40 µm cell strainer	Corning	352340
Acetonitrile, LC-MS grade	VWR	83640.32
ACK lysis buffer	Gibco	104921	Alternatively: Lonza, Cat# BP10-548E
Adenosine diphosphate (ADP)	Sigma Aldrich	A2754
Adenosine monophosphate (AMP)	Sigma Aldrich	A1752
Adenosine triphosphate (ATP)	Sigma Aldrich	A2383
Ammonium Carbonate, HPLC grade	Fisher Scientific	A/3686/50
Atlantis Premier BEH Z-HILIC column (100 x 2.1 mm, 1.7 µm)	Waters	186009982
B220-A647	Invitrogen	103226
B220-PE/Cy7	BioLegend	103222	RRID:AB_313005
CD11b-PE/Cy7	BioLegend	101216	RRID:AB_312799
CD150-BV605	BioLegend	115927	RRID:AB_11204248
CD3-PE	Invitrogen	12-0031-83
CD48-BV421	BioLegend	103428	RRID:AB_2650894
CD4-PE/Cy7	BioLegend	100422	RRID:AB_2660860
CD8a-PE/Cy7	BioLegend	100722	RRID:AB_312761
cKit-PE	BioLegend	105808	RRID:AB_313217
Dynabeads Untouched Mouse CD4 Cells Kit	Invitrogen	11415D
FACSAria III	BD
Gr1-PE/Cy7	BioLegend	108416	RRID:AB_313381
Heat sealing foil	Neolab	Jul-18
Isoleucine	Sigma Aldrich	58880
JetStream ESI Source	Agilent	G1958B
Leucine	Sigma Aldrich	L8000
Medronic acid	Sigma Aldrich	M9508-1G
Methanol, LC-MS grade	Carl Roth	HN41.2
NaCl	Fluka	31434-1KG
PBS	Sigma Aldrich	D8537
Sca1-APC/Cy7	BioLegend	108126	RRID:AB_10645327
TER119-PE/Cy7	BioLegend	116221	RRID:AB_2137789
Triple Quadrupole Mass Spectrometer	Agilent	6495B
Twin.tec PCR plate 96 well LoBind skirted	Eppendorf	30129512
UHPLC Autosampler	Agilent	G7157B
UHPLC Column Thermostat	Agilent	G7116B
UHPLC Pump	Agilent	G7120A
UHPLC Sample Thermostat	Agilent	G4761A