تطوير وتطبيق المقايسات الفيزيائية الحيوية لتقييم تكوين المركب الثلاثي الناجم عن التحلل البروتيني الذي يستهدف الوهم (PROTACS)

Summary

هنا نصف بروتوكولات التوصيف الفيزيائي الحيوي للتكوين المركب الثلاثي الناجم عن التحلل البروتيني الذي يستهدف الوهم (PROTACS) الذي يتضمن أربطة يوبيكويتين فون هيبل-لينداو E3 ligase (VHL) و Cereblon (CRBN). تشمل الطرق الفيزيائية الحيوية الموضحة هنا رنين البلازمون السطحي (SPR) ، وقياس تداخل الطبقة الحيوية (BLI) ، وقياس كالوريمتر المعايرة بالتحليل الحجمي متساوي الحرارة (ITC).

Abstract

يمكن حث الأربطة والبروتينات E3 المستهدفة للتحلل على تكوين معقدات بواسطة جزيئات غير متجانسة وظيفية في عملية متعددة الخطوات. تساهم الحركية والديناميكا الحرارية للتفاعلات المعنية في كفاءة الوجود في كل مكان وما ينتج عنه من تدهور البروتين. توفر التقنيات الفيزيائية الحيوية مثل رنين البلازمون السطحي (SPR) وقياس التداخل الحيوي (BLI) وقياس كالوريمتر المعايرة بالتحليل الحجمي متساوي الحرارة (ITC) معلومات قيمة يمكن استخدامها في تحسين تلك التفاعلات. باستخدام نظامين نموذجيين ، تم إنشاء مجموعة أدوات الفحص البيوفيزيائي لفهم تعاونية تكوين المعقد الثلاثي وتأثير "تأثير الخطاف" على حركية الربط. في إحدى الحالات ، تم تقييم التحلل البروتيني الذي يستهدف جزيء الوهم (PROTAC) الذي تسبب في تكوين معقد ثلاثي بين Brd4^BD2 و VHL. يحتوي الجزيء غير المتجانس ، MZ1 ، على صلات نانومتر لكل من بروتين Brd4^BD2 (SPR K D = 1 نانومتر ، ITC K D = 4 نانومتر) ومجمع VHL (SPR K D = 29 نانومتر ، ITC K _D = 66 نانومتر). بالنسبة لهذا النظام ، تم تطوير فحوصات SPR و BLI و ITC القوية التي أعادت إنتاج النتائج المنشورة التي توضح تعاونية التكوين المعقد الثلاثي. في الحالة الأخرى ، تمت دراسة جزيء تسبب في مجمعات ثلاثية بين بروتين 46.0 كيلو دالتون ، PPM1D ، والمخ [CRBN (319-442)]. يحتوي الجزيء غير المتجانس الوظيفي ، BRD-5110 ، على SPR K D = 1 نانومتر ل PPM1D ولكنه أضعف بكثير ضد مركب CRBN (319-442) المقطوع (SPR K_D = ~ 3 μM). في هذه الحالة ، لم يكن ربط CRBN في SPR مشبعا ، مما أدى إلى "تأثير الخطاف". وجرى تقييم متطلبات الإنتاجية والكواشف لاحتياطي البترول الاستراتيجي ومعهد بلي والمركز الدولي للاتصالات، وقدمت توصيات عامة لتطبيقها على مشاريع البرنامج الاستشاري لتكنولوجيا المعلومات والاتصالات.

Introduction

إن polyubiquitination للبروتينات في الخلية هي عملية منظمة بإحكام تتضمن إنزيمات في عائلة Ubiquitin Ligase ^1,2. الإنزيمات الطرفية في المسار هي أربطة يوبيكويتين E3 التي تربط تساهميا جزيئات يوبيكويتين بشركائها المرتبطين بالبروتين³. إن تعدد الوجود في كل مكان لشركاء ربط البروتين هؤلاء يستهدفهم للتحلل البروتيني بواسطة البروتيازوم⁴. هذا النظام هو جزء من عملية توازن البروتين التي تم الاستفادة منها علاجيا للحث على تدهور البروتينات المشاركة في المرض⁵. تتكون الجزيئات الصغيرة التي تحفز التفاعل بين أربطة يوبيكويتين E3 ، مثل Von Hippel-Lindau E3 ligase (....

Protocol

تم التعبير عن جميع البروتينات بشكل مفرط في E.coli مع إنتاجية جيدة ونقاء (>80٪) باتباع بروتوكولات الأدبيات¹⁸. تم إجراء البيوتينيل باستخدام تفاعل محفز BirA¹⁸. تم تحضير جميع الجزيئات الصغيرة في محاليل مخزون 1 مللي متر في DMSO بنسبة 100٪. لا تتطلب الإجراءات الموضحة هنا معدات أو احتياطات متخصصة لسلامة المختبرات. يجب استخدام معدات الحماية الشخصية القياسية للمختبرات (PPE) (مثل معطف المختبر ونظارات السلامة والقفازات).

البروتينات المطبقة في هذه الدراسة مذكورة أدناه:
VHL: مركب VHL (53-213) / ElonginB (1-104) / ElonginC (17-112) مع علامة Avi في المحطة C ل ElonginB.
Brd4^BD2: غير ....

النتائج

يمكن العثور على توصيف المركب الثنائي VHL: MZ1 و VHL: MZ1: Brd4^BD2 المركب الثلاثي في الشكل 2 (ITC) والشكل 3 (BLI) والشكل 4 (SPR) باستخدام مخزن مؤقت مشابه جدا. K_D المستخرج من المقايسات المتعامدة متسقة. يمكن حساب التعاون بواسطة K D (ثنائي) / K_D (ث.......

Discussion

يمكن أن يوفر التوصيف الفيزيائي الحيوي للتفاعلات الثنائية والثلاثية بين جزيئات PROTAC وشركائها في ربط البروتين رؤى فريدة وتكميلية مقارنة بالأنظمة الخلوية المستخدمة على نطاق واسع. يمكن أن يساعد فهم التقارب بين كل رأس حربي لجزيء PROTAC وشركائه في ربط البروتين في توجيه جهود الكيمياء الطبية نحو تح.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
96-plate	Greiner	655076	flat-bottom, black plates used In BLI experiments
96-well plate	Nunc	73520-120	Plate use for ITC sample preparation
96-well plate	Greiner	650101	Plate used to prepare samples for SPR experiments
Auto iTC200 micro-calorimeter	Malvern Panalytical		Instrument used to perform ITC experiments. Product discontinued.
Biacore S200	Cytiva	29136649	Instrument used to perform SPR experiments
MZ1	ProbeChem	PC-60099	PROTAC that binds to VHL and Brd4BD2
NTA sensor chip	Cytiva	BR100532	SPR chip used to perform SPR experiments involving PPM1D
Octet Red-384	Sartorius		Instrument used to perform BLI experiments. Product discontinued.
Plate cover	Malvern	PQA0001	Cover for Nunc 96-well plate (73520-120)
Plate cover	Cytiva	28975816	Plate cover for Greiner plate (650101)
Series S SA sensor chip	Cytiva	BR100531	SPR chip used to perform SPR experiments involving MZ1:VHL:BRD4
Streptavidin (SA) Dip and Read Biosensors	Sartorius	18-509	Coated sensors used in BLI experiments