キメラを標的としたタンパク質分解による三元複合体形成評価のための生物物理学的アッセイの開発と応用(PROTACS)

要約

ここでは、ユビキチンリガーゼVon Hippel-Lindau E3リガーゼ(VHL)およびセレブロン(CRBN)を含むキメラ(PROTACS)を標的とするタンパク質分解によって誘導される三元複合体形成の生物物理学的特性評価のためのプロトコルについて説明します。 本明細書に例示される生物物理学的方法には、表面プラズモン共鳴(SPR)、生物層干渉法(BLI)、および等温滴定熱量測定(ITC)が含まれる。

要約

分解を標的とするE3リガーゼおよびタンパク質は、多段階プロセスにおいて、ヘテロ二官能性分子によって複合体を形成するように誘導することができる。関与する相互作用の速度論と熱力学は、ユビキチン化の効率とその結果生じるタンパク質の分解に寄与します。表面プラズモン共鳴(SPR)、バイオレイヤー干渉法(BLI)、等温滴定カロリメトリー(ITC)などの生物物理学的手法は、これらの相互作用の最適化に使用できる貴重な情報を提供します。2つのモデルシステムを用いて、三元複合体形成の協同性と結合速度論に対する「フック効果」の影響を理解するための生物物理学的アッセイツールキットを確立しました。1つの症例では、Brd4^BD2とVHLの間の三元複合体形成を誘導するキメラを標的とするタンパク質分解(PROTAC)分子が評価されました。ヘテロ二官能性分子であるMZ1は、Brd4^BD2タンパク質(SPR K D = 1 nM、ITC K D = 4 nM)とVHL複合体(SPR K D = 29 nM、ITC K _D = 66 nM)の両方にnM親和性を持っています。このシステムでは、三元複合体形成の協同性を実証する発表された結果を再現した堅牢なSPR、BLI、およびITCアッセイが開発されました。もう一つは、46.0kDaのタンパク質PPM1Dとセレブロン[CRBN(319-442)]の間に三元複合体を誘導する分子を研究した。ヘテロ二官能性分子であるBRD-5110は、PPM1DのSPR K_D = 1 nMを有するが、切断型CRBN(319-442)複合体に対する結合ははるかに弱い(SPR K_D=~3 μM)。その場合、SPRにおけるCRBNの結合は飽和しておらず、「フック効果」が生じました。SPR、BLI、およびITCのスループットと試薬の要件が評価され、PROTACプロジェクトへの適用に関する一般的な推奨事項が提供されました。

概要

細胞内のタンパク質のポリユビキチン化は、ユビキチンリガーゼファミリーの酵素が関与する厳密に制御されたプロセスです^1,2。経路の末端酵素は、ユビキチン分子をタンパク質結合パートナーに共有結合させるE3ユビキチンリガーゼである³。これらのタンパク質結合パートナーのポリユビキチン化は、プロテ^アソームによるタンパク質分解の標的となります4。このシステムは^{、疾患に関与する}タンパク質の分解を誘導するために治療的に活用されているタンパク質の恒常性維持プロセスの一部です5。フォン・ヒッペル・リンダウE3リガーゼ(VHL)やセレブロン(CRBN)などのE3ユビキチンリガーゼ間の相互作用を誘導する低分子は、典型的には、分解の標的となるタンパク質に結合する弾頭に柔軟なリンカーによって接続されたE3リガーゼ結合弾頭から構成される。これらのヘテロ二官能性分子は、一般にキメラを標的とするタンパク質分解またはPROTACS⁶と呼ばれています。

PROTACSの開発には、細胞内のタンパク質の分解を誘導する分子の能力を評価することが含まれます。細胞をPROTAC分子で処理した際に、標的タンパク質とVHLや....

プロトコル

すべての蛋白質は文献の議定書¹⁸に従ってよい収穫および純度(>80%)のエシェリヒア属大腸菌で過剰発現した。ビオチン化は、BirA触媒反応を用いて行った¹⁸。すべての低分子は、100% DMSO 中の 1 mM ストック溶液で調製しました。ここに記載されている手順は、特別な実験室の安全装置や予防措置を必要としません。標準的な実験室用個人用保護具(PPE)を使用する必要があります(つまり、白衣、安全ゴーグル、手袋)。

この研究で適用されたタンパク質は、以下の通りです。
VHL:ビオチン化VHL(53-213)/ElonginB(1-104)/ElonginC(17-112)複合体とElonginBのC末端にAviタグ。
Brd4^BD2: タグなし Brd4^BD2(333-460)
CRBN:ビオチン化CRBN(319-442)とN末端にAviタグ
PPM1D:N末端の非タグまたは二重His8タグPPM1D(1-420)

この研究で適用された低分子は、以下の通りです。
MZ1 (MW = 1002.6 Da): VHLおよびBrd4^BD2に結合するPROTAC
BRD-2512 (MW = 841.4 Da): ....

ディスカッション

PROTAC分子とそのタンパク質結合パートナー間の二元的および三元的相互作用の生物物理学的特性評価は、広く使用されている細胞システムに関してユニークで補完的な洞察を提供することができます。PROTAC分子の各弾頭とそのタンパク質結合パートナーとの間の親和性を理解することは、これらの相互作用の最適化に向けた創薬化学の取り組みの指針となります。以前に発表された三元系PROT.......

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
96-plate	Greiner	655076	flat-bottom, black plates used In BLI experiments
96-well plate	Nunc	73520-120	Plate use for ITC sample preparation
96-well plate	Greiner	650101	Plate used to prepare samples for SPR experiments
Auto iTC200 micro-calorimeter	Malvern Panalytical		Instrument used to perform ITC experiments. Product discontinued.
Biacore S200	Cytiva	29136649	Instrument used to perform SPR experiments
MZ1	ProbeChem	PC-60099	PROTAC that binds to VHL and Brd4BD2
NTA sensor chip	Cytiva	BR100532	SPR chip used to perform SPR experiments involving PPM1D
Octet Red-384	Sartorius		Instrument used to perform BLI experiments. Product discontinued.
Plate cover	Malvern	PQA0001	Cover for Nunc 96-well plate (73520-120)
Plate cover	Cytiva	28975816	Plate cover for Greiner plate (650101)
Series S SA sensor chip	Cytiva	BR100531	SPR chip used to perform SPR experiments involving MZ1:VHL:BRD4
Streptavidin (SA) Dip and Read Biosensors	Sartorius	18-509	Coated sensors used in BLI experiments