Desenvolvimento e aplicação de ensaios biofísicos para avaliação da formação de complexos ternários induzidos por proteólise visando quimeras (PROTACS)

Resumo

Descrevemos protocolos para a caracterização biofísica da formação de complexos ternários induzidos por proteólise visando quimeras (PROTACS) que envolvem os ligases ubiquitina Von Hippel-Lindau E3 ligase (BVS) e Cereblon (CRBN). Os métodos biofísicos aqui ilustrados incluem ressonância plasmônica de superfície (SPR), interferometria de biocamada (BLI) e calorimetria de titulação isotérmica (ITC).

Resumo

Ligases E3 e proteínas alvo de degradação podem ser induzidos a formar complexos por moléculas heterobifuncionais em um processo de várias etapas. A cinética e termodinâmica das interações envolvidas contribuem para a eficiência da ubiquitinação e consequente degradação da proteína. Técnicas biofísicas como ressonância plasmônica de superfície (SPR), interferometria de biocamada (BLI) e calorimetria de titulação isotérmica (ITC) fornecem informações valiosas que podem ser usadas na otimização dessas interações. Usando dois sistemas modelo, um kit de ferramentas de ensaio biofísico para entender a cooperatividade da formação de complexos ternários e o impacto do 'efeito gancho' na cinética de ligação foi estabelecido. Em um caso, uma proteólise visando quimera (PROTAC) molécula que induziu a formação de complexo ternário entre Brd4^BD2 e VHL foi avaliada. A molécula heterobifuncional, MZ1, tem afinidades nM tanto para a proteína Brd4^BD2 (SPR K D = 1 nM, ITC K D = 4 nM) quanto para o complexo VHL (SPR K D = 29 nM, ITC K _D = 66 nM). Para esse sistema, foram desenvolvidos ensaios robustos de SPR, BLI e ITC que reproduzem resultados publicados demonstrando a cooperatividade da formação ternária de complexos. No outro caso, foi estudada uma molécula que induziu complexos ternários entre uma proteína de 46,0 kDa, PPM1D, e o cereblon [CRBN (319-442)]. A molécula heterobifuncional, BRD-5110, tem um SPR K D = 1 nM para PPM1D, mas uma ligação muito mais fraca contra o complexo CRBN truncado (319-442) (SPR K_D = ~ 3 μM). Nesse caso, a vinculação para CRBN em SPR não foi saturável, resultando em um "efeito gancho". Os requisitos de rendimento e reagente para SPR, BLI e ITC foram avaliados, e recomendações gerais para sua aplicação em projetos PROTAC foram fornecidas.

Introdução

A poliubiquitinação de proteínas na célula é um processo fortemente regulado que envolve enzimas da família Ubiquitina Ligase ^1,2. As enzimas terminais na via são as ligases de ubiquitina E3 que ligam covalentemente moléculas de ubiquitina aos seus parceiros de ligação às proteínas³. A poliubiquitinação desses parceiros ligantes de proteínas os direciona para degradação proteolítica pelo proteassoma⁴. Esse sistema faz parte do processo de homeostase proteica que tem sido aproveitado terapeuticamente para induzir a degradação de proteínas envolvidas na doença⁵. Pequenas moléculas que induzem a interação entre as ligases de ubiquitina E3, como a ligase E3 de Von Hippel-Lindau (BVS) ou o cereblon (CRBN), são tipicamente compostas por uma ogiva de ligação à ligase E3 conectada por um ligante flexível a uma ogiva que se liga à proteína alvo de degradação. Essas moléculas heterobifuncionais são comumente referidas como proteólise visando quimeras ou PROTACS⁶.

O desenvolvimento do PROTACS envolve a avaliação da capacidade das moléculas de induzir a degradação de proteínas nas células. Muitos sistemas de ensaios celulares foram desenvolvidos para monitorar a interação induzida entre a proteína-alvo e os componentes da ligase E3, como VHL ou CRBN, após o tratamento das células com uma molécula de PROTAC. Um desses ensaios celulares, o sistema nanoluc-Halotag⁷, envolve uma ligase E3 fundida ao aceitador Halotag e uma proteína-alvo marcada com um doador nanoluc. A formação do complexo ternário aproxima o doador nanoluc e o aceitador Halotag, permitindo a transferência de energia do doador para o receptor, resultando na emissão de luz. Variações desse sistema podem ser usadas para avaliar a permeabilidade celular de moléculas de PROTACS⁸ ou mudanças no nível relativo de ubiquitinação de proteínas-alvo⁹. Enquanto esses sistemas celulares são essenciais para impulsionar a otimização do PROTACS, a formação de complexos entre os ligases E3 e as proteínas alvo de degradação é um processo de várias etapas^10,11. A cinética e termodinâmica das interações binárias e ternárias envolvidas contribuem para a eficiência da ubiquitinação e consequente degradação da proteína^12,13,14.

São descritos protocolos que podem ser adaptados para a caracterização biofísica da formação de complexos ternários induzidos pelo PROTACS utilizando ressonância plasmônica de superfície (SPR), interferometria de biocamada (BLI) e calorimetria de titulação isotérmica (ITC). Os protocolos SPR e ITC para a molécula MZ1 PROTAC que induz a formação de complexos ternários entre Brd4^BD2 e BVS, derivados de relatos da literatura^13,15 e aqui descritos, foram capazes de recapitular os resultados relatados com algumas modificações dos procedimentos relatados^, que serão discutidos. Uma descrição de um ensaio de BLI usado para avaliar a formação de complexos ternários entre MZI, Brd4^BD2 e BVS está incluída neste relatório. As medidas de afinidade do IPC foram consistentes com as observadas na RP e na CIT. Um protocolo publicado anteriormente no qual um ensaio de SPR foi desenvolvido para avaliar a formação de complexo ternário induzido por PROTAC entre PPM1D, uma proteína fosfatase Ser/Thr cuja expressão é induzida de forma p53-dependente¹⁶, e CRBN também é descrito. Neste caso, a molécula PROTAC tem uma afinidade nanomolar para PPM1D, mas apenas uma afinidade micromolar para CRBN. Neste caso, a ligação da molécula de PROTAC ao CRBN não é saturável, resultando no comumente observado "efeito gancho". O efeito gancho é uma propriedade de três sistemas corporais em que existem duas espécies que podem formar um complexo heterotrimérico quando ambas estão ligadas a uma molécula em ponte (Figura 1)¹⁷. O efeito gancho é observado quando a espécie em ponte está em concentração excessiva em relação às outras duas espécies. O estado resultante é aquele em que as interações binárias superam as interações ternárias. Os sistemas onde o efeito gancho é observado requerem considerações específicas de planejamento experimental discutidas neste relatório. Conceitos gerais e requisitos de reagentes para avaliar a utilização de ensaios biofísicos para a avaliação da formação de complexos ternários induzidos pelo PROTAC são fornecidos.

Protocolo

Todas as proteínas foram superexpressas em E.coli com bom rendimento e pureza (>80%), seguindo os protocolos da^literatura18. A biotinilação foi realizada utilizando-se reação catalisada por BirA¹⁸. Todas as moléculas pequenas foram preparadas em soluções estoque de 1 mM em DMSO 100%. Os procedimentos aqui descritos não requerem equipamentos ou precauções laboratoriais especializadas de segurança. Equipamentos de proteção individual (EPIs) padrão de laboratório devem ser usados (por exemplo, jaleco, óculos de segurança e luvas).

As proteínas aplicadas neste estudo estão listadas abaixo:
BVS: complexo biotinilado BVS(53-213)/ElonginB (1-104)/ElonginC(17-112) com Avi-tag no terminal C de ElonginB.
Brd4^BD2: Não marcado Brd4^BD2(333-460)
CRBN: CRBN biotinilado (319-442) com Avi-tag no terminal N
PPM1D: PPM1D(1-420) não marcado ou duplo His8-tagged no terminal N

Pequenas moléculas aplicadas neste estudo estão listadas abaixo:
MZ1 (MW = 1002,6 Da): PROTAC que se liga à BVS e Brd4^BD2
BRD-2512 (MW = 841,4 Da): CRBN K_D ~3 μM, não se liga ao PPM1D
BRD-5110 (MW = 872,0 Da): CRBN K D ~3 μM, PPM1D K_D = 1-2 nM
BRD-4761 (MW = 476,6 Da): não se liga ao CRBN, PPM1D K_D = 1-2 nM

1. Método 1: ITC (calorimetria de titulação isotérmica)

OBS: As titulações são realizadas utilizando-se um microcalorímetro com auto-injeção.

1. Preparação tampão: Preparar 3 L de tampão contendo 20 mM HEPES, 150 mM NaCl, 1 mM TCEP, pH 7,5.
2. Diálise: Dialyze BVS e Brd4^BD2 (~ 500 μL a 150 μM cada) contra 1 L do tampão preparado na etapa 1.1, 3 vezes a 4 °C, por 4 h, 2 h e aproximadamente 16 h, respectivamente. Salve o buffer após a última diálise para uso nas etapas subsequentes.
3. Prepare amostras em uma placa de 96 poços com uma tampa plástica.
   1. Para cada titulação, preparar 400 μL de solução para a célula, 125 μL para a seringa e 400 μL de tampão para limpeza. Adicione amostras a três poços consecutivos na placa. Uma vez que o estoque composto é preparado a 1 mM em 100% DMSO, adicione a mesma porcentagem de DMSO às soluções proteicas para garantir o tampão correspondente na célula e na seringa. Adicionar 2% de DMSO às soluções finais.
      1. Amostra para titulação de BVS em MZ1: Preparar solução celular contendo 392 μL de tampão, 4 μL de MZ1 a 1 mM (concentração final de 10 μM) e 4 μL de DMSO a 100%. Preparar uma solução de seringa contendo 122,5 μL de VHL a 85,7 μM, 2,5 μL de DMSO 100% (concentração final de 84 μM).
      2. Amostras para titulação da BVS no tampão (os dados serão utilizados para subtração de fundo dos dados gerados a partir da amostra 1.3.1.1): Preparar solução celular contendo 392 μL de tampão, 8 μL de 100% de DMSO. Preparar uma solução de seringa contendo 122,5 μL de VHL a 85,7 μM, (concentração final de 84 μM) e adicionar 2,5 μL de DMSO a 100%.
      3. Amostras para titulação de BVS em MZ1 e Brd4 BD2: Preparar solução celular contendo 392 μL de 17,1 μM Brd4^BD2 (concentração final de 16,8 μM), 3,36 μL de MZ1 a 1 mM (concentração final de 8,4 μM) e 4,64 μL de DMSO 100%. Preparar uma solução de seringa contendo 122,5 μL de VHL a 85,7 μM (concentração final de 84 μM) e 2,5 μL de DMSO a 100%.
      4. Amostras para titulação de BVS em Brd4 BD2 (fundo de 1.3.1.3): Preparar solução celular contendo 392 μL de 17,1 μM Brd4^BD2 (concentração final de 16,8 μM) e 8 μL de 100% DMSO. Preparar uma solução de seringa contendo 122,5 μL de VHL a 85,7 μM (concentração final de 84 μM) e 2,5 μL de DMSO a 100%.
4. Execute as quatro titulações no microcalorímetro. Cada uma consiste em 19 injeções de solução de seringa de 2 μL a uma taxa de 2 μL/s em intervalos de tempo de 120 s. Fazer uma injeção inicial de proteína (0,4 μL) e descartá-la durante a análise dos dados. Realizar todos os experimentos a 25 °C, agitando a 600 rpm.
5. Análise dos dados: Ajustar os dados a um modelo de sítio de ligação única para obter a estequiometria (n), a constante de dissociação (K_D) e a entalpia de ligação (ΔH) usando o software de análise fornecido pelo fabricante (Figura 2).

2. Método 2: BLI (interferometria da biocamada)

1. Realizar experimentos de BLI usando sensores revestidos com estreptavidina (SA) à temperatura ambiente (TR) com uma taxa de aquisição de 5 Hz. Durante o experimento automatizado BLI, certifique-se de que os sensores estejam estacionários dentro de uma única coluna e se movam entre diferentes colunas de uma placa preta de fundo plano de 96 poços com um volume máximo de poço de 392 μL. Encher cada poço da placa usada no experimento com 200 μL de solução.
   NOTA: BLI só é útil para detectar interações proteína-proteína (ou seja, formação de complexo ternário). Não é sensível o suficiente para detectar interações entre proteínas e pequenas moléculas.
   1. Preparação tampão: Preparar 100 mL de tampão contendo 20 mM HEPES, 150 mM NaCl, 1 mM TCEP, 0,05% P20, pH 7,5.
   2. Otimização para a etapa de imobilização: Carregar o sensor de teste para 1-3 nm, conforme recomendado pelo fabricante. Um carregamento de ~1,0 nm é usado para os procedimentos descritos aqui. Para isso, mergulhe o sensor em uma solução contendo BVS a 1,5 μg/mL por 80 s.
   3. Realizar medições cinéticas BLI aplicando sete sensores SA usando a seguinte sequência:
      1. Para a primeira fase basal, mergulhe em buffer por 60 s.
      2. Para a fase de imobilização, mergulhar em uma solução de BVS a 1,5 μg/mL por 80 s.
      3. Para a segunda fase basal, mergulhe em tampão por 60 s.
      4. Para a fase de associação, mergulhar em solução de uma concentração fixa de Brd4^BD2 a 2 μM, concentração fixa de DMSO a 2% e concentrações variáveis de MZ1 a 100 nM, 50 nM, 25 nM, 12,5 nM, 6,3 nM, 3,1 nM e 0 nM (sensor de referência) por 300 s.
      5. Para a fase de dissociação, mergulhe em tampão por 600 s.
   4. Realizar análise de dados utilizando o software do fabricante. k _on, k_off e K_D são relatados para ajuste dos dados (Figura 3).

3. Método 3: SPR (ressonância plasmônica de superfície)

NOTA: Todos os experimentos de SPR são realizados usando chips de sensor revestidos com estreptavidina (SA) no RT. Embora o chip NTA seja usado para a detecção entre proteína e pequenas moléculas, ele deve ser usado com cautela quando aplicado ao complexo ternário, pois um fundo muito mais alto do que o chip SA é observado, possivelmente devido a interações eletrostáticas entre a superfície do chip carregado e a proteína no analito.

1. SPR para interação BVS-MZ1
   1. Preparação do tampão.
      1. Prepare um tampão de 1 L contendo 20 mM HEPES, 150 mM NaCl, 1 mM TCEP, 0,005% P20, pH7,5 e passe por uma unidade de filtro de 0,2 μm.
      2. Retirar 20 ml de tampão para utilização futura (tampão sem DMSO) e encher novamente com 20 ml de DMSO (DMSO a 2% no tampão de execução final). Manter o DMSO a 2% em todas as amostras descritas abaixo (passos 3.1 e 3.2)
   2. Ativar o chip SA seguindo o protocolo do fabricante e imobilizar a BVS a ~2000 RU (injetar solução proteica de 5 μg/mL a 5 μL/min).
   3. Prepare MZ1 em uma diluição seriada de 3 vezes e 8 pontos com a concentração superior a 10 μM em uma placa de polipropileno translúcida de fundo cônico de 384 poços com um volume máximo de 130 μL. Cubra a placa com folhas plásticas transparentes autoadesivas compatíveis com microplacas de polipropileno.
      1. Prepare a concentração máxima com o tampão livre de DMSO para garantir o DMSO a 2% na concentração final. Para 147 μL de tampão livre de DMSO, adicionar 1,5 μL de estoque de MZ1 a 1 mM e 1,5 μL de DMSO 100%.
      2. Prepare a diluição em série de 3 vezes com o tampão de corrida contendo DMSO a 2%. A 100 μL do tampão de corrida, adicionar 50 μL de solução na concentração máxima preparada no passo 3.1.3.1 e misturar bem para preparar a^2.ª concentração mais elevada.
      3. Em seguida, transfira 50 μL da solução preparada na etapa 3.1.3.2 para os próximos 100 μL de tampão de corrida, misture bem para preparar a^3ª maior concentração e assim por diante.
   4. Execute o SPR usando a configuração multiciclo: Modo: Alto desempenho; tempo de contato: 120 s; tempo de dissociação: 300 s; vazão: 50 μL/min.
   5. Realizar a análise dos dados utilizando o software de avaliação fornecido pelo fabricante do instrumento. A análise de estado estacionário indicou K_D = 26 (± 3) nM e Rmax de ~91% (± 5%) de ligação alcançada (Figura 4A)
2. SPR para BVS: MZ1: Complexo ternário Brd4^BD2
   1. Prepare o buffer conforme descrito na etapa 3.1.1.
   2. Ativar o chip SA seguindo o protocolo do fabricante e imobilizar a BVS para ~100 RU. Injetar uma solução proteica de 0,5 μg/mL VHL a uma taxa de fluxo de 5 μL/min e tempo de contato entre 1-5 min até atingir uma densidade de superfície de ~100 RU.
   3. Preparar amostras para duas injecções de ciclo único de 5 vezes e 5 pontos numa placa de fundo redondo de poliestireno transparente de 96 poços com um volume máximo de 323 μL e cobri-la com folhas de plástico transparentes autoadesivas compatíveis com microplacas de poliestireno, conforme descrito nos passos 3.2.3.1-3.2.3.2.
      1. Controlo negativo: a substância a analisar contém apenas Brd4^BD2 .
         1. Preparar concentração máxima a 25 μM em tampão de corrida com um volume de 200 μL (#A5)
         2. Adicionar 160 μL cada de Brd4^BD2 a 2 μM no buffer de corrida para os próximos 4 poços à esquerda (#A1-A4)
         3. Transferir 40 μL de A5 para A4. Misture bem.
         4. Transferir 40 μL de A4 para A3. Misture bem. Continue fazendo isso até A1.
      2. Formação do complexo ternário: o analito contém MZ1 e Brd4^BD2.
         1. Preparar a concentração máxima adicionando 4 μL de MZ1 a 20 μM em solução de DMSO a 100% para 196 μL contendo 25,5 μM Brd4^BD2 em tampão livre de DMSO (#B5). As concentrações finais são 25 μM Brd4^BD2, 100 nM MZ1 e 2% DMSO.
         2. Adicionar 160 μL cada de Brd4^BD2 a 2 μM no buffer de corrida para os próximos 4 poços à esquerda (#B1-B4)
         3. Transferir 40 μL de B5 para B4. Misture bem.
         4. Transferir 40 μL de B4 para B3. Misture bem. Continue fazendo isso até B1.
   4. Execute o SPR usando a configuração de ciclo único: Tempo de contato: 100 s; tempo de dissociação: 720 s; vazão: 50 μL/min. Aplique três injeções de tampão antes de cada amostra para garantir um fundo estável.
   5. Análise dos dados: Aplicar a terceira injeção do buffer como plano de fundo para subtração. Quanto ao controle negativo, quando MZ1 não está presente, a resposta SPR entre BVS e Brd4^BD2 é desprezível. Quando MZ1 está presente, o ajuste cinético indica que a interação entre BVS e o complexo^BD2 MZ1-Brd4 tem k _on = 7,9 (± 1,5) *10⁷ /M/s, k_off = 0,014 ^s-1 e K_D = 1 nM. (Figura 4B)
3. SPR para interações CRBN e pequenas moléculas
   1. Preparação do tampão.
      1. Prepare um tampão de 1 L contendo 50 mM Tris, 100 mM NaCl, 1 mM MgCl 2, 0,5 mM TCEP, 0,005% P20, pH 7,5, e passe por uma unidade de filtro de_0,2 μm.
      2. Retirar 20 ml de tampão e reabastecer 20 ml de DMSO a 100% (DMSO a 2% no tampão de execução final). É importante manter o DMSO a 2% em todas as amostras descritas abaixo (passos 3.3, 3.4 e 3.5).
   2. Ative o chip SA seguindo o protocolo do fabricante e imobilize o CRBN para ~800 RU.
   3. Preparar compostos em diluição em série de 3 vezes e 6 pt numa placa de 384 poços com uma concentração máxima de 30 μM, conforme descrito no ponto 3.1.3.
   4. Execute o SPR usando a configuração multiciclo: Modo: Alto desempenho, tempo de contato: 60 s, tempo de dissociação: 90 s; vazão: 50 μL/min. Para este sistema, três injeções de buffer são suficientes para obter um fundo estável. Para outros sistemas de ensaio, pode ser necessário realizar injeções de tampão adicionais.
   5. Realizar análise de dados utilizando o software do fabricante.
      NOTA: A análise de estado estacionário indica que K_D de BRD-2512 e BRD-5110 estão ambos em torno de 3 μM. No entanto, a ligação só atingiu ~ 70% R_max ligação na concentração superior. Tanto a fraca afinidade quanto a forma do sensorgrama indicam que a insolubilidade do composto em altas concentrações é provável de acontecer. Assim, a K_D real pode ser maior que 3 μM. O BRD-4761, que não se liga ao CRBN, foi incluído como controle negativo.
4. SPR para interações PPM1D e pequenas moléculas
   1. Prepare o buffer conforme descrito na etapa 3.3.1. Use um chip sensor de ácido nitriloacético (NTA).
   2. Aplique um único ciclo porque a ogiva PPM1D tem um k _ligado e k_desligado lento. Gere novamente o chip NTA usando a configuração padrão do fabricante e imobilize PPM1D para ~ 1000 RU após cada injeção de composto (injetar solução proteica de 5 μg/mL a 5 μL/min).
   3. Preparar os compostos em diluição em série de 3 vezes e 5 pontos com a concentração máxima a 400 nm, conforme descrito no ponto 3.1.3.
   4. Execute o SPR usando a configuração de ciclo único: Modo: alto desempenho; tempo de contato: 90 s; tempo de dissociação: 600 s; vazão: 50 μL/min. Aplique três injeções de tampão antes de cada composto para garantir um fundo estável.
   5. Análise de dados. Aplique a terceira injeção do buffer como plano de fundo para subtração. Quanto ao controle negativo, o BRD-2512 não apresenta ligação ao PPM1D. Para BRD-4761 e BRD-5110, o ajuste cinético indicou que o KD para ambos era de 1-2 nM.
5. SPR para CRBN:PROTAC: complexo ternário PPM1D
   1. Prepare o buffer conforme descrito na etapa 3.3.1.
   2. Ativar o chip SA seguindo o protocolo do fabricante e imobilizar CRBN para ~35 RU (injetar uma solução proteica de 0,5 μg/mL a 5 μL/min).
   3. Preparar três compostos em diluição seriada de 3 vezes e 6 pontos com uma concentração máxima de 30 μM, mantendo [PPM1D] a 1 μM em todas as amostras, incluindo os espaços em branco, utilizando o método descrito no passo 3.2.3.
   4. Execute o SPR usando a configuração multiciclo: Modo: Alto desempenho; tempo de contato: 60 s; tempo de dissociação: 90 s; vazão: 50 μL/min.
   5. Realizar análise de dados utilizando o software do fabricante.
      NOTA: Enquanto o BRD-2512 e o BRD-4761 mostram resposta não/desprezível, o BRD-5110 mostra claramente o "efeito gancho" no estado estacionário com cinética liga/desliga rápida (Figura 5A-C). A resposta de ligação experimental do BRD-5110 (Figura 5C) está entre a resposta prevista da simulação ao assumir que K D (CRBN, cpd) é de 3 ou 10 μM (Figura 5E), sugerindo que o ternário K D e o binário K _D são muito semelhantes. Não há cooperatividade aparente do PPM1D: BRD-5110: formação do complexo CRBN.

Resultados

A caracterização da BVS: complexo binário MZ1 e BVS: MZ1: complexo ternário^{Brd4 BD2} pode ser encontrada na Figura 2 (ITC), Figura 3 (BLI) e Figura 4 (SPR) usando um buffer muito semelhante. O K_D extraído dos ensaios ortogonais é consistente. A cooperatividade pode ser calculada por K D (binário) / K_D (ternário), o que é altamente positivo (15 do ITC ou 26 do SPR).

Discussão

A caracterização biofísica das interações binárias e ternárias entre moléculas de PROTAC e seus parceiros de ligação a proteínas pode fornecer informações únicas e complementares relativas a sistemas celulares amplamente utilizados. Compreender a afinidade entre cada ogiva de uma molécula PROTAC e seus parceiros de ligação a proteínas pode ajudar a orientar os esforços de química medicinal para a otimização dessas interações. Estruturas cristalinas de complexos ternários PROTAC previamente public...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
96-plate	Greiner	655076	flat-bottom, black plates used In BLI experiments
96-well plate	Nunc	73520-120	Plate use for ITC sample preparation
96-well plate	Greiner	650101	Plate used to prepare samples for SPR experiments
Auto iTC200 micro-calorimeter	Malvern Panalytical		Instrument used to perform ITC experiments. Product discontinued.
Biacore S200	Cytiva	29136649	Instrument used to perform SPR experiments
MZ1	ProbeChem	PC-60099	PROTAC that binds to VHL and Brd4BD2
NTA sensor chip	Cytiva	BR100532	SPR chip used to perform SPR experiments involving PPM1D
Octet Red-384	Sartorius		Instrument used to perform BLI experiments. Product discontinued.
Plate cover	Malvern	PQA0001	Cover for Nunc 96-well plate (73520-120)
Plate cover	Cytiva	28975816	Plate cover for Greiner plate (650101)
Series S SA sensor chip	Cytiva	BR100531	SPR chip used to perform SPR experiments involving MZ1:VHL:BRD4
Streptavidin (SA) Dip and Read Biosensors	Sartorius	18-509	Coated sensors used in BLI experiments