Desenvolvimento e aplicação de ensaios biofísicos para avaliação da formação de complexos ternários induzidos por proteólise visando quimeras (PROTACS)

Resumo

Descrevemos protocolos para a caracterização biofísica da formação de complexos ternários induzidos por proteólise visando quimeras (PROTACS) que envolvem os ligases ubiquitina Von Hippel-Lindau E3 ligase (BVS) e Cereblon (CRBN). Os métodos biofísicos aqui ilustrados incluem ressonância plasmônica de superfície (SPR), interferometria de biocamada (BLI) e calorimetria de titulação isotérmica (ITC).

Resumo

Ligases E3 e proteínas alvo de degradação podem ser induzidos a formar complexos por moléculas heterobifuncionais em um processo de várias etapas. A cinética e termodinâmica das interações envolvidas contribuem para a eficiência da ubiquitinação e consequente degradação da proteína. Técnicas biofísicas como ressonância plasmônica de superfície (SPR), interferometria de biocamada (BLI) e calorimetria de titulação isotérmica (ITC) fornecem informações valiosas que podem ser usadas na otimização dessas interações. Usando dois sistemas modelo, um kit de ferramentas de ensaio biofísico para entender a cooperatividade da formação de complexos ternários e o impacto do 'efeito gancho' na cinética de ligação foi estabelecido. Em um caso, uma proteólise visando quimera (PROTAC) molécula que induziu a formação de complexo ternário entre Brd4^BD2 e VHL foi avaliada. A molécula heterobifuncional, MZ1, tem afinidades nM tanto para a proteína Brd4^BD2 (SPR K D = 1 nM, ITC K D = 4 nM) quanto para o complexo VHL (SPR K D = 29 nM, ITC K _D = 66 nM). Para esse sistema, foram desenvolvidos ensaios robustos de SPR, BLI e ITC que reproduzem resultados publicados demonstrando a cooperatividade da formação ternária de complexos. No outro caso, foi estudada uma molécula que induziu complexos ternários entre uma proteína de 46,0 kDa, PPM1D, e o cereblon [CRBN (319-442)]. A molécula heterobifuncional, BRD-5110, tem um SPR K D = 1 nM para PPM1D, mas uma ligação muito mais fraca contra o complexo CRBN truncado (319-442) (SPR K_D = ~ 3 μM). Nesse caso, a vinculação para CRBN em SPR não foi saturável, resultando em um "efeito gancho". Os requisitos de rendimento e reagente para SPR, BLI e ITC foram avaliados, e recomendações gerais para sua aplicação em projetos PROTAC foram fornecidas.

Introdução

A poliubiquitinação de proteínas na célula é um processo fortemente regulado que envolve enzimas da família Ubiquitina Ligase ^1,2. As enzimas terminais na via são as ligases de ubiquitina E3 que ligam covalentemente moléculas de ubiquitina aos seus parceiros de ligação às proteínas³. A poliubiquitinação desses parceiros ligantes de proteínas os direciona para degradação proteolítica pelo proteassoma⁴. Esse sistema faz parte do processo de homeostase proteica que tem sido aproveitado terapeuticamente para induzir a degradação de proteínas envolvidas na doença

Protocolo

Todas as proteínas foram superexpressas em E.coli com bom rendimento e pureza (>80%), seguindo os protocolos da^literatura18. A biotinilação foi realizada utilizando-se reação catalisada por BirA¹⁸. Todas as moléculas pequenas foram preparadas em soluções estoque de 1 mM em DMSO 100%. Os procedimentos aqui descritos não requerem equipamentos ou precauções laboratoriais especializadas de segurança. Equipamentos de proteção individual (EPIs) padrão de laboratório devem ser usados (por exemplo, jaleco, óculos de segurança e luvas).

As proteínas aplicadas neste estudo estão listadas abaixo....

Discussão

A caracterização biofísica das interações binárias e ternárias entre moléculas de PROTAC e seus parceiros de ligação a proteínas pode fornecer informações únicas e complementares relativas a sistemas celulares amplamente utilizados. Compreender a afinidade entre cada ogiva de uma molécula PROTAC e seus parceiros de ligação a proteínas pode ajudar a orientar os esforços de química medicinal para a otimização dessas interações. Estruturas cristalinas de complexos ternários PROTAC previamente public.......

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
96-plate	Greiner	655076	flat-bottom, black plates used In BLI experiments
96-well plate	Nunc	73520-120	Plate use for ITC sample preparation
96-well plate	Greiner	650101	Plate used to prepare samples for SPR experiments
Auto iTC200 micro-calorimeter	Malvern Panalytical		Instrument used to perform ITC experiments. Product discontinued.
Biacore S200	Cytiva	29136649	Instrument used to perform SPR experiments
MZ1	ProbeChem	PC-60099	PROTAC that binds to VHL and Brd4BD2
NTA sensor chip	Cytiva	BR100532	SPR chip used to perform SPR experiments involving PPM1D
Octet Red-384	Sartorius		Instrument used to perform BLI experiments. Product discontinued.
Plate cover	Malvern	PQA0001	Cover for Nunc 96-well plate (73520-120)
Plate cover	Cytiva	28975816	Plate cover for Greiner plate (650101)
Series S SA sensor chip	Cytiva	BR100531	SPR chip used to perform SPR experiments involving MZ1:VHL:BRD4
Streptavidin (SA) Dip and Read Biosensors	Sartorius	18-509	Coated sensors used in BLI experiments