Kimeraları Hedefleyen Proteoliz Tarafından İndüklenen Üçlü Kompleks Oluşumunun Değerlendirilmesi için Biyofiziksel Testlerin Geliştirilmesi ve Uygulanması (PROTACS)

Özet

Burada, ubikitin ligazları Von Hippel-Lindau E3 ligaz (VHL) ve Cereblon (CRBN) içeren kimeraları (PROTACS) hedefleyen proteoliz tarafından indüklenen üçlü kompleks oluşumunun biyofiziksel karakterizasyonu için protokolleri açıklıyoruz. Burada gösterilen biyofiziksel yöntemler arasında yüzey plazmon rezonansı (SPR), biyokatman interferometrisi (BLI) ve izotermal titrasyon kalorimetrisi (ITC) bulunur.

Özet

Bozunma için hedeflenen E3 ligazları ve proteinleri, çok aşamalı bir işlemde heterobifonksiyonel moleküller tarafından kompleksler oluşturmak üzere indüklenebilir. İlgili etkileşimlerin kinetiği ve termodinamiği, ubikitinasyonun verimliliğine ve bunun sonucunda proteinin bozulmasına katkıda bulunur. Yüzey plazmon rezonansı (SPR), biyokatman interferometrisi (BLI) ve izotermal titrasyon kalorimetrisi (ITC) gibi biyofiziksel teknikler, bu etkileşimlerin optimizasyonunda kullanılabilecek değerli bilgiler sağlar. İki model sistemi kullanılarak, üçlü kompleks oluşumunun işbirliğine dayalılığını ve 'kanca etkisinin' bağlanma kinetiği üzerindeki etkisini anlamak için bir biyofiziksel tahlil araç kiti oluşturulmuştur. Bir vakada, Brd4^BD2 ve VHL arasında üçlü kompleks oluşumunu indükleyen kimera (PROTAC) molekülünü hedefleyen bir proteoliz değerlendirildi. Heterobifonksiyonel molekül olan MZ1, hem Brd4^BD2 proteini (SPR K D = 1 nM, ITC K D = 4 nM) hem de VHL kompleksi (SPR K D = 29 nM, ITC K _D = 66 nM) için nM afinitelerine sahiptir. Bu sistem için, üçlü kompleks oluşumunun işbirliğine elverişliliğini gösteren yayınlanmış sonuçları yeniden üreten sağlam SPR, BLI ve ITC tahlilleri geliştirilmiştir. Diğer durumda, 46.0 kDa'lık bir protein, PPM1D ve sereblon [CRBN (319-442)] arasında üçlü kompleksleri indükleyen bir molekül incelenmiştir. Heterobifonksiyonel molekül, BRD-5110, PPM1D için bir SPR_{KD =} 1 nM'ye sahiptir, ancak kesilmiş CRBN (319-442) kompleksine (SPR K_D = ~ 3 μM) karşı çok daha zayıf bağlanmaya sahiptir. Bu durumda, SPR'de CRBN için bağlanma doygun değildi ve bu da bir "kanca etkisi" ile sonuçlandı. SPR, BLI ve ITC için verim ve reaktif gereksinimleri değerlendirildi ve bunların PROTAC projelerine uygulanması için genel öneriler sağlandı.

Giriş

Hücredeki proteinlerin poliubikitinasyonu, Ubiquitin Ligas ailesi ^1,2'deki enzimleri içeren sıkı bir şekilde düzenlenmiş bir süreçtir. Yoldaki terminal enzimler, ubikuitin moleküllerini protein bağlayıcı ortaklarına^{kovalent olarak bağlayan E3} ubikuitin ligazlarıdır 3. Bu protein bağlayıcı ortakların poliubikitinasyonu, onları proteazom⁴ tarafından proteolitik bozunma için hedefler. Bu sistem, hastalık^5'te yer alan proteinlerin bozulmasını indüklemek için terapötik olarak kullanılan protein homeostazı sürecinin bir parçasıdır. Von Hippel-Li....

Protokol

Tüm proteinler, literatür protokolleri^18'e uygun olarak iyi verim ve saflıkta (% >80) E.coli'de aşırı eksprese edildi. Biyotinilasyon, BirA katalizli bir reaksiyon¹⁸ kullanılarak gerçekleştirildi. Tüm küçük moleküller %100 DMSO'da 1 mM stok çözeltilerde hazırlandı. Burada açıklanan prosedürler, özel laboratuvar güvenlik ekipmanı veya önlemleri gerektirmez. Standart laboratuvar kişisel koruyucu ekipmanı (KKD) kullanılmalıdır (örn. laboratuvar önlüğü, koruyucu gözlük ve eldiven).

Bu çalışmada uygulanan proteinler aşağıda listelenmiştir:
VHL: ElonginB'nin C-terminalinde Avi-etiketli b....

Tartışmalar

PROTAC molekülleri ve bunların protein bağlayıcı ortakları arasındaki ikili ve üçlü etkileşimlerin biyofiziksel karakterizasyonu, yaygın olarak kullanılan hücresel sistemlere göre benzersiz ve tamamlayıcı bilgiler sağlayabilir. Bir PROTAC molekülünün her bir savaş başlığı ile protein bağlayıcı ortakları arasındaki afiniteyi anlamak, bu etkileşimlerin optimizasyonuna yönelik tıbbi kimya çabalarını yönlendirmeye yardımcı olabilir. Üçlü PROTAC komplekslerinin daha önce yayınlanm?.......

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
96-plate	Greiner	655076	flat-bottom, black plates used In BLI experiments
96-well plate	Nunc	73520-120	Plate use for ITC sample preparation
96-well plate	Greiner	650101	Plate used to prepare samples for SPR experiments
Auto iTC200 micro-calorimeter	Malvern Panalytical		Instrument used to perform ITC experiments. Product discontinued.
Biacore S200	Cytiva	29136649	Instrument used to perform SPR experiments
MZ1	ProbeChem	PC-60099	PROTAC that binds to VHL and Brd4BD2
NTA sensor chip	Cytiva	BR100532	SPR chip used to perform SPR experiments involving PPM1D
Octet Red-384	Sartorius		Instrument used to perform BLI experiments. Product discontinued.
Plate cover	Malvern	PQA0001	Cover for Nunc 96-well plate (73520-120)
Plate cover	Cytiva	28975816	Plate cover for Greiner plate (650101)
Series S SA sensor chip	Cytiva	BR100531	SPR chip used to perform SPR experiments involving MZ1:VHL:BRD4
Streptavidin (SA) Dip and Read Biosensors	Sartorius	18-509	Coated sensors used in BLI experiments