Lo sviluppo e l'applicazione di saggi biofisici per la valutazione della formazione di complessi ternari indotti da chimere mirate alla proteolisi (PROTACS)

Riepilogo

Qui descriviamo i protocolli per la caratterizzazione biofisica della formazione di complessi ternari indotti da chimere mirate alla proteolisi (PROTACS) che coinvolgono le ubiquitina ligasi Von Hippel-Lindau E3 ligasi (VHL) e Cereblon (CRBN). I metodi biofisici qui illustrati includono la risonanza plasmonica di superficie (SPR), l'interferometria del biostrato (BLI) e la calorimetria di titolazione isotermica (ITC).

Abstract

Le ligasi E3 e le proteine bersaglio della degradazione possono essere indotte a formare complessi da molecole eterobifunzionali in un processo a più fasi. La cinetica e la termodinamica delle interazioni coinvolte contribuiscono all'efficienza dell'ubiquitinazione e alla conseguente degradazione della proteina. Le tecniche biofisiche come la risonanza plasmonica di superficie (SPR), l'interferometria del biostrato (BLI) e la calorimetria di titolazione isotermica (ITC) forniscono informazioni preziose che possono essere utilizzate nell'ottimizzazione di tali interazioni. Utilizzando due sistemi modello, è stato stabilito un kit di strumenti di analisi biofisica per comprendere la cooperatività della formazione di complessi ternari e l'impatto dell'"effetto gancio" sulla cinetica di legame. In un caso, è stata valutata una molecola di chimera mirata alla proteolisi (PROTAC) che induce la formazione di complessi ternari tra Brd4^BD2 e VHL. La molecola eterobifunzionale, MZ1, ha affinità nM sia per la proteina Brd4^BD2 (SPR K D = 1 nM, ITC K D = 4 nM) che per il complesso VHL (SPR K D = 29 nM, ITC K _D = 66 nM). Per questo sistema, sono stati sviluppati robusti saggi SPR, BLI e ITC che hanno riprodotto i risultati pubblicati che dimostrano la cooperatività della formazione di complessi ternari. Nell'altro caso, è stata studiata una molecola che induce complessi ternari tra una proteina da 46,0 kDa, PPM1D, e il cereblon [CRBN (319-442)]. La molecola eterobifunzionale, BRD-5110, ha un SPR K D = 1 nM per PPM1D ma un legame molto più debole contro il complesso CRBN troncato (319-442) (SPR K_D = ~ 3 μM). In quel caso, il legame per CRBN in SPR non era saturabile, determinando un "effetto gancio". Sono stati valutati i requisiti di produttività e reagenti per SPR, BLI e ITC e sono state fornite raccomandazioni generali per la loro applicazione ai progetti PROTAC.

Introduzione

La poliubiquitinazione delle proteine nella cellula è un processo strettamente regolato che coinvolge gli enzimi della famiglia delle ubiquitina ligasi ^1,2. Gli enzimi terminali nella via sono le ubiquitina ligasi E3 che legano covalentemente le molecole di ubiquitina ai loro partner che legano le proteine³. La poliubiquitinazione di questi partner di legame proteico li indirizza alla degradazione proteolitica da parte del proteasoma⁴. Questo sistema fa parte del processo di omeostasi proteica che è stato sfruttato terapeuticamente per indurre la degradazione del....

Protocollo

Tutte le proteine sono risultate sovraespresse in E.coli con buona resa e purezza (>80%) seguendo i protocolli di letteratura¹⁸. La biotinilazione è stata effettuata utilizzando una reazione catalizzata da BirA¹⁸. Tutte le piccole molecole sono state preparate in soluzioni madre da 1 mM in DMSO al 100%. Le procedure qui descritte non richiedono attrezzature di sicurezza o precauzioni di laboratorio specializzate. Devono essere utilizzati dispositivi di protezione individuale (DPI) standard da laboratorio (ad es. camice da laboratorio, occhiali di sicurezza e guanti).

Le proteine appli....

Discussione

La caratterizzazione biofisica delle interazioni binarie e ternarie tra le molecole PROTAC e i loro partner di legame proteico può fornire informazioni uniche e complementari relative a sistemi cellulari ampiamente utilizzati. Comprendere l'affinità tra ciascuna testata di una molecola PROTAC e i suoi partner di legame proteico può aiutare a guidare gli sforzi della chimica farmaceutica verso l'ottimizzazione di tali interazioni. Strutture cristalline di complessi ternari PROTAC pubblicate in precedenza hanno rivelato.......

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
96-plate	Greiner	655076	flat-bottom, black plates used In BLI experiments
96-well plate	Nunc	73520-120	Plate use for ITC sample preparation
96-well plate	Greiner	650101	Plate used to prepare samples for SPR experiments
Auto iTC200 micro-calorimeter	Malvern Panalytical		Instrument used to perform ITC experiments. Product discontinued.
Biacore S200	Cytiva	29136649	Instrument used to perform SPR experiments
MZ1	ProbeChem	PC-60099	PROTAC that binds to VHL and Brd4BD2
NTA sensor chip	Cytiva	BR100532	SPR chip used to perform SPR experiments involving PPM1D
Octet Red-384	Sartorius		Instrument used to perform BLI experiments. Product discontinued.
Plate cover	Malvern	PQA0001	Cover for Nunc 96-well plate (73520-120)
Plate cover	Cytiva	28975816	Plate cover for Greiner plate (650101)
Series S SA sensor chip	Cytiva	BR100531	SPR chip used to perform SPR experiments involving MZ1:VHL:BRD4
Streptavidin (SA) Dip and Read Biosensors	Sartorius	18-509	Coated sensors used in BLI experiments