Разработка и применение биофизических анализов для оценки образования тройных комплексов, индуцированных протеолизом, нацеленным на химеры (PROTACS)

Резюме

В данной работе мы описываем протоколы биофизической характеристики образования тройных комплексов, индуцированных протеолизом, нацеленным на химеры (PROTACS), в которых участвуют убиквитин-лигазы фон Хиппеля-Линдау E3-лигазы (VHL) и цереблона (CRBN). Биофизические методы, проиллюстрированные здесь, включают поверхностный плазмонный резонанс (SPR), биослойную интерферометрию (BLI) и изотермическую титрованную калориметрию (ITC).

Аннотация

Е3-лигазы и белки, предназначенные для деградации, могут быть индуцированы для образования комплексов гетеробифункциональными молекулами в многоступенчатом процессе. Кинетика и термодинамика взаимодействий способствуют эффективности убиквитинирования и, как следствие, деградации белка. Биофизические методы, такие как поверхностный плазмонный резонанс (SPR), биослойная интерферометрия (BLI) и изотермическая титровательная калориметрия (ITC), предоставляют ценную информацию, которую можно использовать для оптимизации этих взаимодействий. С помощью двух модельных систем был создан биофизический инструментарий для понимания кооперативности формирования тройных комплексов и влияния «эффекта крюка» на кинетику связывания. В одном случае был оценен протеолиз, нацеленный на молекулу химеры (PROTAC), которая индуцировала образование тройного комплекса между Brd4^BD2 и VHL. Гетеробифункциональная молекула MZ1 обладает нМ сродством как к белку Brd4^BD2 (SPR K D = 1 нМ, ITC K D = 4 нМ), так и к комплексу VHL (SPR K D = 29 нМ, ИТК K _D = 66 нМ). Для этой системы были разработаны надежные анализы SPR, BLI и ITC, которые воспроизводили опубликованные результаты, демонстрирующие кооперативность образования тройных комплексов. В другом случае была изучена молекула, которая индуцировала тройные комплексы между белком PPM1D с молекулярной массой 46,0 кДа и цереблоном [CRBN (319-442)]. Гетеробифункциональная молекула BRD-5110 имеет SPR K_D = 1 нМ для PPM1D, но гораздо более слабое связывание с усеченным комплексом CRBN (319-442) (SPR K_D= ~ 3 мкМ). В этом случае связывание CRBN в SPR не насыщалось, что приводило к «хуковому эффекту». Была проведена оценка требований к пропускной способности и реагентам для SPR, BLI и ITC, а также даны общие рекомендации по их применению к проектам PROTAC.

Введение

Полиубиквитинирование белков в клетке является жестко регулируемым процессом, в котором участвуют ферменты семейства убиквитин-лигаз ^1,2. Концевыми ферментами в этом пути являются убиквитин-лигазы E3, которые ковалентно присоединяют молекулы убиквитина к своим белок-связывающим партнерам³. Полиубиквитинирование этих партнеров, связывающих белки, нацелено на их протеолитическую деградацию протеасомой⁴. Эта система является частью процесса белкового гомеостаза, который был терапевтически использован для индукции деградации белков, участвующих в заболевании⁵. Малые молекулы, которые индуцируют взаимодействие между убиквитин-лигазами E3, такие как E3-лигаза фон Хиппеля-Линдау (VHL) или церебблон (CRBN), обычно состоят из боеголовки, связывающей E3-лигазу, соединенной гибким линкером с боеголовкой, которая связывается с белком, предназначенным для деградации. Эти гетеробифункциональные молекулы обычно называют протеолизом, нацеленным на химеры, или PROTACS⁶.

Разработка PROTACS включает в себя оценку способности молекул индуцировать деградацию белков в клетках. Было разработано множество систем клеточного анализа, которые отслеживают индуцированное взаимодействие между белком-мишенью и компонентами E3-лигазы, такими как VHL или CRBN, при обработке клеток молекулой PROTAC. Один из таких клеточных анализов, система nanoluc-Halotag⁷, включает в себя E3-лигазу, сплавленную с акцептором Halotag, и белок-мишень, помеченный донором нанолюка. Образование тройного комплекса сближает донор нанолюка и акцептор галотага, что позволяет передавать энергию от донора к акцептору, что приводит к излучению света. Вариации этой системы могут быть использованы для оценки клеточной проницаемости молекул PROTACS⁸ или изменения относительного уровня убиквитинирования целевого белка⁹. В то время как эти клеточные системы необходимы для оптимизации PROTACS, образование комплексов между E3-лигазами и белками, предназначенными для деградации, является многоступенчатым^{процессом.} Кинетика и термодинамика бинарных и троичных взаимодействий способствуют эффективному убиквитинированию и, как следствие, деградации белка^12,13,14.

Описаны протоколы, которые могут быть адаптированы для биофизической характеристики образования тройных комплексов, индуцированных PROTACS, с использованием поверхностного плазмонного резонанса (SPR), биослойной интерферометрии (BLI) и изотермической титрующей калориметрии (ITC). Протоколы SPR и ITC для молекулы MZ1 PROTAC, которая индуцирует образование тройных комплексов между Brd4^BD2 и VHL, полученные из литературных сообщений^13,15 и описанные здесь, позволили повторить полученные результаты с некоторой модификацией описанных процедур^, которые будут обсуждаться. В настоящий отчет включено описание анализа BLI, используемого для оценки образования тройного комплекса между MZI, Brd4,^BD2 и VHL. Измерения сродства с помощью BLI согласуются с теми, которые наблюдались в SPR и ITC. Также описан ранее опубликованный протокол, в котором был разработан SPR-анализ для оценки образования тройного комплекса, индуцированного PROTAC, между PPM1D, протеинфосфатазой Ser/Thr, экспрессия которой индуцируется p53-зависимым образом¹⁶, и CRBN. В этом случае молекула PROTAC имеет наномолярное сродство к PPM1D и только микромолярное сродство к CRBN. В этом случае связывание молекулы PROTAC с CRBN не является насыщаемым, что приводит к часто наблюдаемому «эффекту крюка». Крюковый эффект является свойством трех систем организма, в которых есть два вида, которые могут образовывать гетеротримерный комплекс, когда оба связаны с молекулой-мостом (рис. 1⁾¹⁷. Эффект крючка наблюдается, когда перемычка находится в избыточной концентрации по сравнению с двумя другими видами. Результирующее состояние — это состояние, в котором бинарные взаимодействия вытесняют троичные взаимодействия. Системы, в которых наблюдается эффект крюка, требуют специальных соображений по планированию экспериментов, обсуждаемых в этом отчете. Приведены общие понятия и требования к реагентам для оценки использования биофизических анализов для оценки образования тройных комплексов, индуцированных PROTAC.

протокол

Все белки были гиперэкспрессированы в E.coli с хорошей продуктивностью и чистотой (>80%) в соответствии с литературными протоколами¹⁸. Биотинилирование проводили с помощью BirA-катализируемой реакции¹⁸. Все малые молекулы получали в исходных растворах 1 мМ в 100% ДМСО. Процедуры, описанные в настоящем документе, не требуют специального лабораторного оборудования или мер предосторожности. Следует использовать стандартные лабораторные средства индивидуальной защиты (СИЗ) (например, лабораторный халат, защитные очки и перчатки).

Белки, применяемые в этом исследовании, перечислены ниже:
VHL: биотинилированный комплекс VHL(53-213)/ElonginB (1-104)/ElonginC(17-112) с Avi-меткой на С-конце ElonginB.
Brd4^BD2: немаркированный Brd4^BD2(333-460)
CRBN: биотинилированный CRBN(319-442) с Avi-меткой на N-конце
PPM1D: немаркированный или двойной тег His8 PPM1D(1-420) на конце N

Ниже перечислены малые молекулы, примененные в этом исследовании:
MZ1 (МВт = 1002,6 Да): PROTAC, который связывается с VHL и Brd4^BD2
BRD-2512 (MW = 841,4 Da): CRBN K D ~3 мкМ, не связывается с PPM1D
BRD-5110 (МВт = 872,0 Да): CRBN K D ~3 мкМ, PPM1D K_D = 1-2 нМ
BRD-4761 (MW = 476,6 Da): не связывается с CRBN, PPM1D K_D = 1-2 нМ

1. Метод 1: ITC (изотермическая титрование, калориметрия)

ПРИМЕЧАНИЕ: Титрование проводится с помощью микрокалориметра с автоматическим введением.

1. Приготовление буфера: Приготовьте 3 л буфера, содержащего 20 мМ HEPES, 150 мМ NaCl, 1 мМ TCEP, pH 7,5.
2. Диализ: Диализ VHL и Brd4^BD2 (~ 500 мкл по 150 мкМ каждый) против 1 л буфера, приготовленного на стадии 1.1, 3 раза при 4 °C, в течение 4 ч, 2 ч и примерно 16 ч соответственно. Сохраните буфер после последнего диализа для использования на последующих этапах.
3. Готовят образцы на 96-луночном планшете с пластиковой крышкой.
   1. Для каждого титрования приготовьте 400 мкл раствора для клетки, 125 мкл для шприца и 400 мкл буфера для очистки. Добавьте образцы в три последовательные лунки на пластине. Поскольку исходное вещество готовится при концентрации 1 мМ в 100% ДМСО, добавьте такое же процентное содержание ДМСО в белковые растворы, чтобы обеспечить соответствующий буфер в клетке и шприце. Добавьте 2% ДМСО в конечные растворы.
      1. Образец для титрования VHL в MZ1: Приготовьте клеточный раствор, содержащий 392 мкл буфера, 4 мкл MZ1 при 1 мМ (конечная концентрация 10 мкМ) и 4 мкл 100% ДМСО. Приготовьте шприцевой раствор, содержащий 122,5 мкл VHL при 85,7 мкМ, 2,5 мкл 100% ДМСО (конечная концентрация 84 мкМ).
      2. Образцы для титрования VHL в буфер (данные будут использоваться для фонового вычитания данных, полученных из образца 1.3.1.1): Приготовьте клеточный раствор, содержащий буфер 392 мкл, 8 мкл 100% ДМСО. Приготовьте шприцевой раствор, содержащий 122,5 мкл VHL при 85,7 мкМ (конечная концентрация 84 мкМ) и добавьте 2,5 мкл 100% ДМСО.
      3. Образцы для титрования VHL в MZ1 и Brd4 BD2: Приготовьте клеточный раствор, содержащий 392 мкл 17,1 мкМ Brd4^BD2 (конечная концентрация 16,8 мкМ), 3,36 мкл MZ1 при 1 мМ (конечная концентрация 8,4 мкМ) и 4,64 мкл 100% ДМСО. Приготовьте шприцевой раствор, содержащий 122,5 мкл VHL при концентрации 85,7 мкМ (конечная концентрация 84 мкМ) и 2,5 мкл 100% ДМСО.
      4. Образцы для титрования VHL в Brd4 BD2 (фон 1.3.1.3): Готовят клеточный раствор, содержащий 392 мкл 17,1 мкМ Brd4^BD2 (конечная концентрация 16,8 мкМ) и 8 мкл 100%^ДМСО . Приготовьте шприцевой раствор, содержащий 122,5 мкл VHL при концентрации 85,7 мкМ (конечная концентрация 84 мкМ) и 2,5 мкл 100% ДМСО.
4. Запустите все четыре титрования на микрокалориметре. Каждый из них состоит из 19 инъекций шприцевого раствора объемом 2 мкл со скоростью 2 мкл/с с интервалом 120 с. Сделайте первичную инъекцию белка (0,4 мкл) и выбросьте его во время анализа данных. Проводите все эксперименты при температуре 25 °C, при перемешивании при 600 об/мин.
5. Анализ данных: Подгонка данных к модели с одним сайтом связывания для получения стехиометрии (n), константы диссоциации (K_D) и энтальпии связывания (ΔH) с помощью аналитического программного обеспечения, предоставленного производителем (рис. 2).

2. Метод 2: BLI (биослойная интерферометрия)

1. Проводите эксперименты BLI с использованием датчиков, покрытых стрептавидином (SA), при комнатной температуре (RT) с частотой сбора данных 5 Гц. Во время автоматизированного эксперимента BLI убедитесь, что датчики неподвижны в пределах одной колонны и перемещаются между различными колоннами 96-луночной черной пластины с плоским дном и максимальным объемом лунки 392 мкл. Заполните каждую лунку планшета, используемого в эксперименте, 200 мкл раствора.
   ПРИМЕЧАНИЕ: BLI полезен только для обнаружения белок-белковых взаимодействий (т.е. образования тройных комплексов). Он недостаточно чувствителен, чтобы обнаруживать взаимодействия между белками и малыми молекулами.
   1. Приготовление буфера: Приготовьте 100 мл буфера, содержащего 20 мМ HEPES, 150 мМ NaCl, 1 мМ TCEP, 0,05% P20, pH 7,5.
   2. Оптимизация для шага иммобилизации: Нагружайте тестовый датчик на длину волны 1-3 нм, как рекомендует производитель. Для описанных здесь процедур используется нагрузка ~1,0 нм. Для этого опустите датчик в раствор, содержащий VHL в концентрации 1,5 мкг/мл, на 80 с.
   3. Выполняйте кинетические измерения BLI с помощью семи датчиков SA в следующей последовательности:
      1. Для первой базовой фазы погрузитесь в буфер на 60 с.
      2. Для фазы иммобилизации погружают в раствор VHL в концентрации 1,5 мкг/мл на 80 с.
      3. Для второй фазы базового уровня погрузитесь в буфер на 60 с.
      4. Для фазы ассоциации погружают в раствор с фиксированной концентрацией Brd4^BD2 при 2 мкМ, фиксированной концентрацией ДМСО при 2% и различными концентрациями MZ1 при 100 нМ, 50 нМ, 25 нМ, 12,5 нМ, 6,3 нМ, 3,1 нМ и 0 нМ (эталонный датчик) в течение 300 с.
      5. Для фазы диссоциации погрузитесь в буфер на 600 с.
   4. Выполните анализ данных с помощью программного обеспечения производителя. k _on, k off и K_D сообщаются для подгонки данных (рис. 3).

3. Способ 3: SPR (поверхностный плазмонный резонанс)

ПРИМЕЧАНИЕ: Все эксперименты SPR проводятся с использованием сенсорных чипов с покрытием из стрептавидина (SA) на RT. Несмотря на то, что чип NTA используется для детектирования между белком и малыми молекулами, его следует использовать с осторожностью при применении к тройному комплексу, так как наблюдается гораздо более высокий фон, чем у SA-чипа, возможно, из-за электростатических взаимодействий между поверхностью заряженного чипа и белком в анализируемом веществе.

1. SPR для взаимодействия VHL-MZ1
   1. Подготовка буфера.
      1. Приготовьте буфер объемом 1 л, содержащий 20 мМ HEPES, 150 мМ NaCl, 1 мМ TCEP, 0,005% P20, pH7,5, и пропустите его через фильтрующий блок 0,2 мкм.
      2. Удалите 20 мл буфера для дальнейшего использования (буфер без ДМСО) и наполните 20 мл ДМСО (2% ДМСО в окончательном прогонном буфере). Поддерживайте содержание ДМСО на уровне 2% во всех образцах, описанных ниже (шаги 3.1 и 3.2)
   2. Активируйте SA-чип в соответствии с протоколом производителя и иммобилизуйте VHL до ~2000 RU (введите раствор белка 5 мкг/мл при 5 мкл/мин).
   3. Приготовьте MZ1 в 3-кратном 8-точечном последовательном разведении с максимальной концентрацией 10 мкМ на 384-луночном коническом дне, полупрозрачном полипропиленовом планшете с максимальным объемом 130 мкл. Накройте пластину самоклеящейся прозрачной пластиковой пленкой, совместимой с полипропиленовыми микропластинами.
      1. Приготовьте верхнюю концентрацию с помощью буфера, не содержащего ДМСО, чтобы обеспечить конечную концентрацию 2% ДМСО. К 147 мкл буфера, не содержащего ДМСО, добавьте 1,5 мкл запаса MZ1 на 1 мМ и 1,5 мкл 100% ДМСО.
      2. Приготовьте 3-кратное серийное разбавление с помощью погонного буфера, содержащего 2% ДМСО. К 100 мкл проточного буфера добавляют 50 мкл раствора в максимальной концентрации, приготовленного на стадии 3.1.3.1, и хорошо перемешивают до получения^2-й самой высокой концентрации.
      3. Затем переносят 50 мкл раствора, приготовленного на стадии 3.1.3.2, в следующие 100 мкл проточного буфера, хорошо перемешивают до получения^3-й наибольшей концентрации и т. д.
   4. Запустите SPR с помощью многотактовой настройки: Режим: Высокая производительность; время контакта: 120 с; время диссоциации: 300 с; Расход: 50 мкл/мин.
   5. Выполните анализ данных с помощью оценочного программного обеспечения, предоставленного производителем прибора. Стационарный анализ показал, что K_D = 26 (± 3) нМ и Rmax ~91% (± 5%) связывания (рис. 4A)
2. SPR для VHL: MZ1: тройной комплекс Brd4^BD2
   1. Подготовьте буфер, как описано в шаге 3.1.1.
   2. Активируйте микросхему SA по протоколу производителя и иммобилизуйте VHL до ~100 RU. Вводят белковый раствор 0,5 мкг/мл VHL со скоростью потока 5 мкл/мин и временем контакта 1-5 мин до достижения поверхностной плотности ~100 RU.
   3. Подготовьте образцы для двух 5-кратных 5-точечных однотактных инъекций в 96-луночную прозрачную полистирольную круглую нижнюю пластину с максимальным объемом 323 мкл и накройте ее самоклеящейся прозрачной пластиковой пленкой, совместимой с полистирольными микропланшетами, как описано в шагах 3.2.3.1-3.2.3.2.
      1. Отрицательный контроль: аналит содержит только Brd4^BD2 .
         1. Приготовьте максимальную концентрацию при 25 мкМ в поточном буфере объемом 200 мкл (#A5)
         2. Добавьте по 160 мкл Brd4^BD2 на 2 мкМ в работающем буфере к следующим 4 лункам слева (#A1-A4)
         3. Перелейте 40 мкл А5 в А4. Хорошо перемешайте.
         4. Перенесите 40 мкл А4 в А3. Хорошо перемешайте. Продолжайте делать это до A1.
      2. Тройное комплексообразование: аналит содержит MZ1 и Brd4^BD2.
         1. Приготовьте верхнюю концентрацию, добавив 4 мкл MZ1 при 20 мкМ в 100%-ном растворе ДМСО к 196 мкл, содержащему 25,5 мкМ Brd4^BD2 в буфере без ДМСО (#B5). Конечные концентрации: 25 мкМ Brd4 BD2, 100 нМ MZ1 и 2%^ДМСО.
         2. Добавьте по 160 мкл Brd4^BD2 при 2 мкМ в работающем буфере к следующим 4 лункам слева (#B1-B4)
         3. Перелейте 40 мкл B5 в B4. Хорошо перемешайте.
         4. Перелейте 40 мкл B4 в B3. Хорошо перемешайте. Продолжайте делать это до B1.
   4. Запуск SPR с помощью однотактной установки: Время контакта: 100 с; время диссоциации: 720 с; Расход: 50 мкл/мин. Нанесите три инъекции буфера перед каждым образцом, чтобы обеспечить стабильный фон.
   5. Анализ данных: Примените третью инъекцию буфера в качестве фона для вычитания. В качестве отрицательного контроля, когда MZ1 отсутствует, отклик SPR между VHL и Brd4^BD2 пренебрежимо мал. При наличии MZ1 кинетическая подгонка указывает на взаимодействие между VHL и комплексом MZ1-Brd4^BD2 имеет k _on = 7,9 (± 1,5) * 10⁷ /M/s, k_off = 0,014 ^с-1 и K_D = 1 нМ. (Рисунок 4Б)
3. SPR для CRBN и маломолекулярных взаимодействий
   1. Подготовка буфера.
      1. Приготовьте буфер объемом 1 л, содержащий 50 мМ Tris, 100 мМ NaCl, 1 мМ MgCl 2, 0,5 мМ TCEP, 0,005% P20, pH 7,5, и пропустите его через фильтрующий блок_0,2 мкм.
      2. Удалите 20 мл буфера и залейте 20 мл 100% ДМСО (2% ДМСО в конечном рабочем буфере). Важно поддерживать содержание ДМСО на уровне 2% во всех образцах, описанных ниже (шаги 3.3, 3.4 и 3.5).
   2. Активируйте микросхему SA по протоколу производителя и иммобилизуйте CRBN до ~800 RU.
   3. Готовят соединения в 3-кратном последовательном разведении по 6 точек на 384-луночном планшете с максимальной концентрацией 30 мкМ, как описано в 3.1.3.
   4. Запустите SPR с помощью многотактовой настройки: Режим: Высокопроизводительный, время контакта: 60 с, время диссоциации: 90 с; Расход: 50 мкл/мин. Для этой системы достаточно трех буферных инъекций для получения стабильного фона. Для других пробирных систем может потребоваться выполнение дополнительных буферных инъекций.
   5. Выполните анализ данных с помощью программного обеспечения производителя.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Стационарный анализ показывает, что K_D BRD-2512 и BRD-5110 составляют около 3 мкМ. Однако связывание достигало только ~ 70%_Rmax связывания при максимальной концентрации. Как слабое сродство, так и форма сенсорной диаграммы указывают на вероятность нерастворимости соединений при высоких концентрациях. Таким образом, фактическое значение K_D может быть выше 3 мкМ. BRD-4761, который не связывается с CRBN, был включен в качестве отрицательного контроля.
4. SPR для PPM1D и низкомолекулярных взаимодействий
   1. Подготовьте буфер, как описано в шаге 3.3.1. Используйте чип датчика нитрилоуксусной кислоты (NTA).
   2. Применяйте однотактный, потому что боеголовка PPM1D имеет медленное включение k и выключение k. Регенерируйте чип NTA, используя настройки производителя по умолчанию, и иммобилизуйте PPM1D до ~ 1000 RU после каждой инъекции соединения (вводите белковый раствор 5 мкг/мл при 5 мкл/мин).
   3. Готовят соединения в 3-кратном 5-точечном последовательном разведении с максимальной концентрацией при 400 нМ, как описано в 3.1.3.
   4. Запустите SPR с помощью однотактной настройки: Режим: высокопроизводительный; время контакта: 90 с; время диссоциации: 600 с; Расход: 50 мкл/мин. Нанесите три инъекции буфера перед каждым соединением, чтобы обеспечить стабильный фон.
   5. Анализ данных. Примените третью инъекцию буфера в качестве фона для вычитания. Как отрицательный контроль, BRD-2512 не проявляет связывания с PPM1D. Для BRD-4761 и BRD-5110 кинетическая подгонка показала, что KD для обоих составляет 1-2 нМ.
5. SPR для CRBN:PROTAC: тройной комплекс PPM1D
   1. Подготовьте буфер, как описано в шаге 3.3.1.
   2. Активировать SA-чип в соответствии с протоколом производителя и иммобилизовать CRBN до ~35 RU (ввести белковый раствор 0,5 мкг/мл при 5 мкл/мин).
   3. Приготовьте три соединения в 3-кратном 6-точечном последовательном разведении с максимальной концентрацией 30 мкМ при сохранении [PPM1D] на уровне 1 мкМ во всех образцах, включая заготовки, используя метод, описанный в шаге 3.2.3.
   4. Запустите SPR с помощью многотактовой настройки: Режим: Высокая производительность; время контакта: 60 с; время диссоциации: 90 с; Расход: 50 мкл/мин.
   5. Выполните анализ данных с помощью программного обеспечения производителя.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В то время как BRD-2512 и BRD-4761 демонстрируют нулевую/незначительную реакцию, BRD-5110 отчетливо демонстрирует «эффект крюка» в установившемся состоянии с быстрой кинетикой включения/выключения (рис. 5A-C). Экспериментальная реакция связывания BRD-5110 (рис. 5C) находится между предсказанными результатами моделирования реакциями при предположении, что K D (CRBN, cpd) составляет 3 или 10 мкМ (рис. 5E), что позволяет предположить, что троичный K D и бинарный K _D очень похожи. Отсутствует явная кооперативность PPM1D:BRD-5110:CRBN комплексообразования.

Результаты

Характеристику бинарного комплекса VHL:MZ1 и тройного комплекса VHL:MZ1:Brd4^BD2 можно найти на рисунке 2 (ITC), рисунке 3 (BLI) и рисунке 4 (SPR) с использованием очень похожего буфера. _{K D}, извлеченный из ортогональных анализов, является последо...

Обсуждение

Биофизическая характеристика бинарных и троичных взаимодействий между молекулами PROTAC и их партнерами по связыванию с белками может дать уникальную и дополняющую информацию о широко используемых клеточных системах. Понимание сродства между каждой боеголовкой молекулы PROTAC и ее партн?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
96-plate	Greiner	655076	flat-bottom, black plates used In BLI experiments
96-well plate	Nunc	73520-120	Plate use for ITC sample preparation
96-well plate	Greiner	650101	Plate used to prepare samples for SPR experiments
Auto iTC200 micro-calorimeter	Malvern Panalytical		Instrument used to perform ITC experiments. Product discontinued.
Biacore S200	Cytiva	29136649	Instrument used to perform SPR experiments
MZ1	ProbeChem	PC-60099	PROTAC that binds to VHL and Brd4BD2
NTA sensor chip	Cytiva	BR100532	SPR chip used to perform SPR experiments involving PPM1D
Octet Red-384	Sartorius		Instrument used to perform BLI experiments. Product discontinued.
Plate cover	Malvern	PQA0001	Cover for Nunc 96-well plate (73520-120)
Plate cover	Cytiva	28975816	Plate cover for Greiner plate (650101)
Series S SA sensor chip	Cytiva	BR100531	SPR chip used to perform SPR experiments involving MZ1:VHL:BRD4
Streptavidin (SA) Dip and Read Biosensors	Sartorius	18-509	Coated sensors used in BLI experiments