JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

هنا ، نصف بروتوكولا مباشرا يتيح التقييم في المختبر لوفرة الحمض النووي الريبي الميكروي المسمى بالفلورسنت لدراسة ديناميكيات تغليف microRNA وتصديره إلى حويصلات خارج الخلية (EVs).

Abstract

الحويصلات خارج الخلية (EVs) هي وسطاء مهمون للاتصال الخلوي الذي تفرزه مجموعة متنوعة من الخلايا المختلفة. تنقل هذه المركبات الكهربائية الجزيئات النشطة بيولوجيا ، بما في ذلك البروتينات والدهون والأحماض النووية (الحمض النووي ، والحمض النووي الريبي المرسال ، والحمض النووي الريبي الدقيق ، وغيرها من الحمض النووي الريبي غير المشفر) ، من خلية إلى أخرى ، مما يؤدي إلى عواقب النمط الظاهري في الخلايا المتلقية. من بين جميع شحنات EV المختلفة ، حظيت microRNAs (miRNAs) بقدر كبير من الاهتمام لدورها في تشكيل البيئة المكروية وفي تثقيف الخلايا المتلقية بسبب عدم تنظيمها الواضح ووفرة في المركبات الكهربائية. تشير البيانات الإضافية إلى أن العديد من miRNAs يتم تحميلها بنشاط في المركبات الكهربائية. على الرغم من هذا الدليل الواضح ، فإن البحث عن ديناميكيات التصدير وآليات فرز miRNA محدود. هنا ، نقدم بروتوكولا باستخدام تحليل قياس التدفق الخلوي ل EV-miRNA والذي يمكن استخدامه لفهم ديناميكيات تحميل EV-miRNA وتحديد الآلات المشاركة في تصدير miRNA. في هذا البروتوكول ، يتم اقتران miRNAs المحددة مسبقا ليتم تخصيبها في EVs واستنفادها من الخلايا المانحة إلى فلوروفور ونقلها إلى الخلايا المانحة. ثم يتم التحقق من miRNAs الموسومة بالفلورسنت للتحميل في EVs والنضوب من الخلايا باستخدام qRT-PCR. كعنصر تحكم في النقل وأداة لبوابة السكان المنقولين من الخلايا ، يتم تضمين الحمض النووي الريبي الخلوي المسمى بالفلورسنت (الخلايا المحتفظ بها والمستنفدة EV). يتم تقييم الخلايا المنقولة مع كل من EV-miRNA والخلية المحتفظ بها miRNA لإشارات الفلورسنت على مدار 72 ساعة. تتضاءل شدة إشارة التألق الخاصة ب EV-miRNAs بسرعة مقارنة بالحمض النووي الريبي المرسال المحتفظ به بالخلية. باستخدام هذا البروتوكول المباشر ، يمكن للمرء الآن تقييم ديناميكيات تحميل miRNA وتحديد العوامل المختلفة المسؤولة عن تحميل miRNAs في المركبات الكهربائية.

Introduction

تعد MicroRNAs (miRNAs) واحدة من أفضل المجموعات الفرعية المميزة للحمض النووي الريبي الصغير غير المشفر ، والمعروفة بدورها الحاسم في تنظيم الجينات بعد النسخ. يتبع التعبير والتكوين الحيوي لمعظم miRNAs سلسلة منسقة من الأحداث التي تبدأ بنسخ miRNAs الأولية (pri-miRNAs) في النواة. بعد المعالجة النووية بواسطة مجمع المعالجات الدقيقة إلى سلائف miRNAs (pre-miRNAs) ، يتم تصدير ما قبل miRNAs إلى السيتوبلازم ، حيث تخضع لمزيد من المعالجة بواسطة RNase III endonuclease ، dicer إلى 21-23 نيوكليوتيدات ناضجة miRNAدوبلكس 1. يرتبط أحد خيوط miRNA الناضجة المعالجة بالحمض النووي الريبي المرسال المستهدف (mRNAs) ، مما يؤدي إلى تدهور أو قمع متعدية للأهداف2. استنادا إلى الدور متعدد الخواص ل miRNAs في تنظيم العديد من mRNAs المستهدفة المتنوعة في وقت واحد ، فليس من المستغرب أن يتم تنظيم تعبير miRNA بإحكام3. في الواقع ، يساهم التعبير غير المناسب في حالات مرضية مختلفة ، خاصة في السرطان. لا يمثل التعبير الشاذ عن miRNAs توقيعا خاصا بالمرض فحسب ، بل ظهر أيضا كهدف للإمكانات النذير والعلاجية4،5،6. بالإضافة إلى أدوارها داخل الخلايا ، فإن miRNAs لها أيضا أدوار غير مستقلة. على سبيل المثال ، يمكن تعبئة miRNAs بشكل انتقائي في EVs بواسطة الخلايا المانحة وتصديرها إلى المواقع المتلقية حيث تثير استجابات مظهرية متنوعة في علم وظائف الأعضاء الطبيعي والمرض7،8،9.

على الرغم من الأدلة الواضحة على أن miRNAs المرتبطة ب EV هي جزيئات حيوية وظيفية ، إلا أنه ليس من المفهوم تماما كيف يتم تنظيم مجموعات فرعية معينة من miRNAs في حالات المرض مثل السرطان وكيف تختار الآلية الخلوية وفرز miRNAs إلى Evs10,11. بالنظر إلى الدور المحتمل ل EV-miRNAs في تعديل البيئة المكروية ، من الأهمية بمكان تحديد الآليات التي ينطوي عليها تصدير miRNAs المختارة لتوضيح دور المركبات الكهربائية بشكل كامل في الاتصال بين الخلايا والتسبب في المرض. إن فهم عملية إطلاق miRNA في المركبات الكهربائية لن يسلط الضوء على الوسطاء المهمين لتصدير miRNA فحسب ، بل يمكن أن يوفر أيضا رؤى حول العلاجات المحتملة. لتحقيق هذا المستوى من المعرفة ، يجب تكييف الأدوات لمعالجة هذه الأسئلة التجريبية الجديدة بأمانة. في الواقع ، تنمو الدراسات التي تقيم المركبات الكهربائية بشكل كبير بسبب إدخال تقنيات وضوابط جديدة12,13. فيما يتعلق بتقييم وفرة miRNAs المصدرة إلى EVs ، كان تسلسل الجيل التالي وتفاعل البوليميراز المتسلسل للنسخ العكسي الكمي (qRT-PCR) هي الأدوات القياسية الحالية. في حين أن هذه الأدوات مفيدة لتقييم وفرة miRNAs في المركبات الكهربائية ، إلا أن هناك قيودا على حساسيتها وخصوصيتها ، واستخدام هذه الأساليب الثابتة لتقييم الديناميكيات غير كاف. يتطلب تحديد ديناميكيات تصدير miRNA إلى المركبات الكهربائية مجموعة من الأدوات المتخصصة. هنا ، نقدم بروتوكولا شاملا باستخدام miRNAs المترافقة بالفلورسنت ، لتحليل ديناميكيات إطلاق miRNA من الخلايا المانحة ودمجها في EVs. نناقش أيضا مزايا وقيود الطريقة ونقدم توصيات للاستخدام الأمثل. ستكون الطريقة متعددة الاستخدامات المقدمة في هذه الورقة مفيدة للباحثين المهتمين بدراسة إطلاق miRNA في المركبات الكهربائية وأدوارها المحتملة في الاتصالات الخلوية والمرض.

Protocol

ملاحظة: كشرط مسبق لاستخدام هذه التقنية ، يلزم تحديد والتحقق من صحة miRNAs المصدرة بشكل انتقائي. نظرا لأن خطوط الخلايا المختلفة تختلف بناء على شحنة miRNA المصنفة في المركبات الكهربائية الخاصة بها ، فمن المستحسن تقييم خط الاهتمام الخلوي والمركبات الكهربائية المرتبطة به ل miRNAs قبل الاستخدام. بالإضافة إلى ذلك ، يعد النقل القائم على ليبوفيكتامين أحد الخطوات الحاسمة في البروتوكول. يوصى بالتحديد المسبق لكفاءة النقل قبل إعداد التجربة.

1. نمو الخلايا في الثقافة ونقل الخلايا باستخدام EV-miRNA المترافق بالفلوروفور

  1. صفيحة 200,000 إلى 400,000 خلية في آبار ثلاثية في صفيحة من 6 آبار في وسط استزراع مناسب. قم بتدوير اللوحة برفق لضمان توزيع موحد للخلايا. احتضان الخلايا حتى تصل إلى التقاء 70٪ -80٪ ، حوالي 24-48 ساعة.
  2. لكل بئر يتم نقله ، قم بتخفيف كاشف النقل في 100 ميكرولتر من الوسط الخالي من المصل في أنبوب طرد مركزي دقيق وفقا لتعليمات الشركة الصانعة.
    ملاحظة: يجب تحديد التركيز الأمثل للدهون لخط اهتمام الخلية قبل هذا الإعداد.
  3. لكل بئر يتم نقله ، قم بتخفيف EV-miRNA المترافق بالفلوروفور (2nM) و cell-miRNA (2nM) بشكل منفصل في أنبوب طرد مركزي دقيق في 100 ميكرولتر من الوسائط الخالية من المصل.
    ملاحظة: يجب حساب الحجم الإجمالي للعدد الإجمالي للآبار التي تم نقلها. في هذا البروتوكول ، تم تقييم التألق في 7 نقاط زمنية. لذلك ، كان الحجم الإجمالي 700 ميكرولتر للخطوة 1.2 و 700 ميكرولتر للخطوة 1.3. بالإضافة إلى ذلك ، لالتقاط السكان الفلورسنت الإيجابي للخلايا بثقة ، يجب على المستخدم نقل الخلايا باستخدام miRNA المخفوق غير الفلوري وإنشاء بوابة تستبعد هذه الخلايا.
  4. أضف مزيج الحمض النووي الريبي المخفف (من الخطوة 1.3) إلى كاشف النقل المخفف (من الخطوة 1.2) واخلطه برفق عن طريق قلب الأنبوب 3-4 مرات. دع مزيج الحمض النووي الريبي الدهني المركب يحتضن لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (RT).
  5. قم بإزالة وسائط الاستزراع العادية من الخلايا وأضف 800 ميكرولتر من الوسائط الخالية من المصل إلى كل بئر. أضف برفق 200 ميكرولتر من مزيج الحمض النووي الريبي الدهني (من الخطوة 1.4) بالتنقيط إلى الخلايا.
    ملاحظة: تم استخدام وسائط Opti-MEM لنقل خط اهتمام الخلية (خلايا Calu6). حاول إضافة مزيج الحمض النووي الريبي الدهني مباشرة إلى وسائط الاستزراع ، وتجنب إضافة الخليط إلى جوانب اللوحة.

2. حصاد الخلايا المنقولة في نقاط زمنية مختلفة لتحليل التألق

  1. احتضان الخلايا المنقولة عند 37 درجة مئوية لمدة 7 ساعات.
    ملاحظة: للتحقق من صحة النقل المتسق لكل من miRNAs (EV-miRNA و cell-miRNA) ، يتم جمع الخلايا من بئر واحد بعد 3 ساعات من النقل لتحليل التألق باستخدام مقياس التدفق الخلوي.
  2. بعد فترة الحضانة 7 ساعات ، قم بإزالة مجمع النقل من الآبار واستبدله بوسائط كاملة.
  3. لتقييم النقطة الزمنية 7 ساعات ، احصد الخلايا واغسل الخلايا ثلاث مرات باستخدام 1x PBS.
    1. إذا كنت تعمل مع خلايا ملتصقة ، أضف 200 ميكرولتر من التربسين إلى بئر واحد وانتظر حتى تنفصل الخلايا عن اللوحة. نقل الخلايا المنفصلة إلى أنبوب الطرد المركزي الدقيق والحبيبات عن طريق الطرد المركزي في 200xg لمدة 5 دقائق.
    2. تخلص من المادة الطافية بعناية لتجنب تعطيل حبيبات الخلية. لغسل PBS الأول, أعد تعليق الحبيبات في ~ 500 ميكرولتر من 1x PBS وكرر التكوير باستخدام خطوات الطرد المركزي أعلاه. كرر غسل PBS مرتين إضافيتين.
    3. أعد تعليق حبيبات الخلية في 200 ميكرولتر من محلول بارافورمالدهايد (PFA) بنسبة 2٪ وتقييم التألق.
      ملاحظة: بعد إضافة 2٪ PFA, يمكن تخزين بيليه الخلية في 4 °C لمدة 3-4 أيام.
  4. احصد النقاط الزمنية المتبقية باتباع الخطوات الواردة في القسم 2.3. اجمع كل كريات الخلايا المخزنة وتابع الخطوات الواردة في القسم 3.

3. تحليل التدفق الخلوي لإشارة الخلية miRNA و EV-miRNA في الخلايا

  1. تحضير الخلايا لتحليل التدفق الخلوي. قم بتصفية تعليق الخلية من أغطية المصفاة من القسم 2 إلى 35 ميكرومتر التي تشكل جزءا من أنابيب البوليسترين FACS ذات القاع المستدير لتمكين إزالة الحطام وركام الخلايا التي قد تتداخل مع تحليل الفلوروفور.
  2. قم بإعداد الجهاز باتباع تعليمات المعايرة. قم بتشغيل مقياس التدفق الخلوي واتركه يسخن لمدة 30 دقيقة على الأقل قبل الاستخدام. قم بتجهيز نظام الموائع بسائل غمد ، وتحقق من محاذاة الليزر واضبطها.
  3. قم بتشغيل مراقبة الجودة لتأكيد سوائل الأجهزة. قم بتحميل المياه المفلترة عالية النقاء في مقياس التدفق الخلوي وقم بتشغيلها بمعدل تدفق مناسب لوقت اكتساب كاف.
    ملاحظة: يعتمد معدل التدفق المناسب ووقت الاستحواذ على نوع الخلية محل الاهتمام وتعقيد العينة وجودة البيانات المطلوبة.
  4. افتح برنامج تحليل بيانات قياس التدفق الخلوي وتأكد من أداء الكاشف والليزر. قم بإعداد معلمات العتبة والجهد للكشف بناء على خط اهتمام الخلية والفلوروفورات المختارة.
    ملاحظة: بالنسبة لجميع التجارب النهائية، تم استخدام خلايا Calu6.
    1. قم بتعيين عتبة التقاط الإشارة لخلايا Calu6 عند FSC 5000. قم بإجراء التحليل ل 1 × 104 خلايا لكل تكرار تجريبي.
    2. لحساب التداخل الطيفي بين الفلوروفورات المختلفة ، استخدم الخلايا غير المنقولة والخلايا المنقولة بشكل مستقل مع واحد فقط من الفلوروفورات لإعداد ضوابط التعويض.
    3. للكشف عن تصدير miRNA ، استخدم EV-miRNAs المرشحة (miR-451a و miR-150) مترافقة مع Alexa-fluor 488 ، وخلية تحكم miRNA (cel-miR-67) مترافقة مع Cy3.
    4. لكل EV-miRNA ، اقترن الفلوروفور بنهاية 5 من حبلا 5p. قبل النقل ، قم بتلدين حبلا الفلوروفور المترافق إلى حبلا 3p التكميلي بنسبة 100٪.
    5. لتحليل التعبير في الخلايا المنقولة ، قم بتحليل العينات باستخدام قنوات FSC و SSC و FITC و PE المضبوطة على 258 و 192 و 269 و 423 وحدة جهد ، على التوالي (الشكل 1A ، B).
  5. أدخل عينة التحكم السلبية في مقياس التدفق الخلوي. التقط إشارات الخلية بعد تحديد شدة التشتت الأمامي (FSC) والتشتت الجانبي (SSC) في ورقة عمل مخصصة.
  6. في المخطط ، اختر FSC للمحور X ، و SSC للمحور Y ، وبوابة للسكان محل الاهتمام عن طريق رسم مضلع حوله (انظر الشكل 1B ، اللوحة السفلية).
  7. إنشاء مؤامرة جديدة باستخدام السكان المسورة.
    1. اضبط المحور X على إشارة التألق 1 (FS1) للكشف عن الخلية miRNA والمحور Y على إشارة التألق 2 (FS2) لاكتشاف EV-miRNA. قم بإعداد معلمات التعويض للفلوروفورات الفردية باستخدام الخلايا التي تم نقلها بشكل مستقل مع كل من miRNAs الموسومة بالفلورسنت. في المؤامرة الجديدة ، بوابة على السكان من الاهتمام.
    2. للكشف عن EV-miRNA ، استخدم قناة FITC. لتقييم إشارة الخلية miRNA ، استخدم قناة PE. في البرنامج ، قم بإنشاء بوابة حول الخلايا التي كانت موجبة لكل من FITC و PE عن طريق رسم مضلع حول مجموعة التألق المزدوج عندما تم اختيار FITC للمحور X وتم اختيار PE للمحور Y.
  8. سجل إحصائيات السكان المسورين.
    1. سجل النسبة المئوية للخلايا في السكان المسورة الموجبة لكل من FITC و PE ، وكذلك لتلك الموجبة إما ل FITC أو PE.
  9. كرر الخطوات المذكورة أعلاه لأي عينات أو عناصر تحكم إضافية في التجربة.

4. عزل EVs من الخلايا المنقولة

  1. بالنسبة للخلايا المزروعة في وسائط تحتوي على المصل ، استنفد EVs من المصل لمنع التلوث المتبادل.
    1. لتوليد مصل مستنفد EV ، قم بتخفيف المصل إلى 50٪ في وسائط زراعة الخلايا لتقليل اللزوجة وأجهزة الطرد المركزي للمصل الناتج بنسبة 50٪ عند 110000 × جم لمدة 18 ساعة.
    2. اجمع المادة الطافية (المصل الخالي من EV) بعناية وقم بترشيحها باستخدام مجموعة مرشح 0.2 ميكرومتر. استخدمي المصل الناتج الخالي من EV بنسبة 50٪ لتوليد وسائط كاملة ، في هذه الحالة ، RPMI بالإضافة إلى مصل 10٪.
    3. لجمع EVs ، أضف الوسائط الكاملة المستنفدة ل EV إلى الخلايا واجمع EVs بعد 48 ساعة من الحضانة.
      ملاحظة: عدل البروتوكول المبين أدناه من Kowal et al.14.
  2. تنمو الخلايا في أطباق زراعة الأنسجة 15 سم إلى التقاء 80٪. قم بنقل الخلايا بشكل منفصل باستخدام cell-miRNA و EV-miRNA في 10 مل من Opti-MEM باتباع بروتوكول النقل في القسم 1 من البروتوكول.
    ملاحظة: لا يتم توسيع نطاق جميع بروتوكولات النقل خطيا. قد يكون من الضروري أولا تكييف وتقييم ظروف النقل في ألواح 15 سم.
  3. بعد 7 ساعات ، قم بشفط وسائط النقل واستبدلها بالوسائط المستنفدة للمركبات الكهربائية (15 مل). تنمو الخلايا في الوسائط المستنفدة EV لمدة 48 ساعة.
  4. قم بإزالة الوسائط المكيفة من الخلايا ووزعها في أنبوب طرد مركزي سعة 50 مل داخل خزانة السلامة البيولوجية. أجهزة الطرد المركزي للوسائط المكيفة عند 2000 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية لإزالة الخلايا الميتة وحطام الخلايا. نقل طاف الناتجة إلى أنبوب جديد.
  5. جهاز طرد مركزي طاف عند 10000 × جم لمدة 40 دقيقة عند 4 درجات مئوية. قم بإزالة المادة الطافية وتصفيتها باستخدام مجموعة مرشح 0.2 ميكرومتر.
  6. انقل وسائط زراعة الخلايا المفلترة إلى أنبوب طرد مركزي فائق معقم داخل خزانة السلامة البيولوجية. وزن وموازنة الأنابيب ضد بعضها البعض. قم بتدوير العينات عند 110000 × جم لمدة 90 دقيقة عند 4 درجات مئوية. تخلص من المادة الطافية.
  7. أعد تعليق الحبيبات في حجم مناسب من 1x PBS للغسيل والطرد المركزي عند 110,000 × g لمدة 90 دقيقة 4 درجة مئوية.
    ملاحظة: تم إعادة تعليق حبيبات EV في 60 مل من 1x PBS بناء على الحد الأقصى للحجم المسموح به للأنابيب الدوارة ذات الزاوية الثابتة المستخدمة في هذه الدراسة.
  8. نضح PBS وتعليق حبيبات EV في حجم مناسب (50-100 ميكرولتر) من 1x PBS جديد ودوامة. قم بتخزين المركبات الكهربائية في درجة حرارة -80 درجة مئوية لاستخدامها لاحقا.

5. تحليل التدفق الخلوي لإشارة الخلية miRNA و EV-miRNA في المركبات الكهربائية

  1. لإعداد تعليق EV لتحليل قياس التدفق الخلوي ، قم بتخفيف EVs في حجم مناسب من 1x PBS فائق الترشيح.
    ملاحظة: يجب تحديد حجم التحميل لتحليل قياس التدفق الخلوي للمركبات الكهربائية بناء على عدد المركبات الكهربائية في العينات. تقريبا ، إذا كان هناك ~ 30000 جسيم في تعليق EV ، فيجب أن يكون الحجم النهائي ~ 500-600 ميكرولتر في 1x PBS. تحتوي العينة النظيفة على حوالي 35-50 جسيما / ميكرولتر.
  2. استخدم مقياس التدفق الخلوي النانوي أو جهاز بديل قوي بما يكفي لتحليل الجسيمات بحجم النانو.
    ملاحظة: هنا ، تم استخدام مقياس التدفق الخلوي النانوي Attune NxT.
  3. افتح البرنامج وقم بإعداد الجهاز باتباع تعليمات المعايرة الموصى بها. قم بإجراء اختبار الأداء باستخدام خرز نانو الأداء. إذا تم الكشف عن حبات النانو في نطاق الحجم القياسي ، يكون الأداء هو الأمثل. تحديد معدل التدفق المناسب للكشف عن جزيئات EV.
  4. قم بتشغيل مراقبة الجودة باستخدام المياه المفلترة عالية النقاء لتأكيد سوائل الجهاز وأداء الكاشف والليزر.
  5. باستخدام حبات المعايرة المناسبة للتجربة ، اضبط مقياس التدفق الخلوي لاكتشاف الخرزات ذات الأحجام المختلفة بدقة وقياس إشارات التألق.
    ملاحظة: لإعداد تحليل EV عن طريق قياس التدفق الخلوي ، تم استخدام حبات ApogeeMix. تحتوي هذه الخرزات على خليط من حبات السيليكا غير الفلورية وحبات البوليسترين الفلورية التي تتراوح أحجامها من 80 نانومتر إلى 1300 نانومتر.
    1. قم بإعداد المعلمات لتقييم حساسية ودقة المجموعات السكانية المختلفة في مزيج الخرزة وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة. استخدم البوابة المناسبة لحل عدد الخرزات من ضوضاء الجهاز.
  6. دوامة العينات بدقة لتوزيع المركبات الكهربائية بالتساوي قبل التحميل للتحليل.
  7. افتح برنامج تحليل بيانات قياس التدفق الخلوي وقدم برنامج تلفزيوني فائق التصفية. قم بإعداد البوابة لجزيئات EV باستخدام PBS فائق التصفية مع التأكد من أن البوابة تتوافق مع الحجم المناسب للجسيمات بناء على الخرزات في الخطوة 5.5.
  8. قم بتحميل عينة التحكم السلبية لتحليل المركبات الكهربائية أثناء مرورها عبر مقياس التدفق الخلوي. التقط إشارات EV أثناء رسم FSC على المحور X و SSC على المحور Y.
    ملاحظة: تم تعيين عتبة SSC لالتقاط المركبات الكهربائية عند 300. تم تحديد حجم الاستحواذ عند 95 ميكرولتر من إجمالي حجم مسحوب قدره 145 ميكرولتر. تم ضبط معدل التدفق على 12.5 ميكرولتر / دقيقة. تم إجراء التحليل باستخدام 1 × 106 جسيمات EV. سكان المركبات الكهربائية غير متجانسة وستؤدي إلى عزل بعض الحطام جنبا إلى جنب مع المركبات الكهربائية. يسلط الكشف الشامل عن الجسيمات في مخطط FSC مقابل SSC الضوء على الجسيمات في نطاق متنوع ، وهو أمر متوقع عند استخدام مستحضرات EV الخام.
  9. إنشاء مؤامرة جديدة باستخدام السكان المسورة.
    1. هذه المرة ، اختر إشارة مضان 1 (FS1) للكشف عن الخلية miRNA على المحور X وإشارة مضان 2 (FS2) للكشف عن EV-miRNA على المحور Y.
    2. قم بإعداد معلمات التعويض للفلوروفورات باستخدام عينات EV المعزولة من الخلايا المنقولة باستخدام miRNA واحد. في المؤامرة الجديدة ، بوابة على السكان EV من الاهتمام.
    3. لتحليل التعبير عن miRNAs المترافق بالفلوروفور في المركبات الكهربائية المعزولة من الخلايا المنقولة ، قم بتحليل عينات EV باستخدام قنوات FSC و SSC و BL1 و YL1 المضبوطة على 370 و 370 و 400 و 400 وحدة جهد ، على التوالي (الشكل 2A ، B).
    4. سجل إحصائيات السكان المسورة وتصورها باستخدام الرسوم البيانية ومخططات النقاط.
  10. كرر الخطوات المذكورة أعلاه لأي عينات أو عناصر تحكم إضافية في التجربة.

6. التحقق من صحة إطلاق miRNAs في المركبات الكهربائية من خلال qRT-PCR

  1. استخرج الحمض النووي الريبي من المركبات الكهربائية والخلايا الأم باستخدام مجموعة عزل miRVana RNA باتباع تعليمات الشركة المصنعة.
    ملاحظة: القياس الكمي للحمض النووي الريبي المعزول من المركبات الكهربائية غير ممكن لأن الكمية الإجمالية للحمض النووي الريبي المعزول من المركبات الكهربائية لا تتجاوز عادة الحد الأدنى لكمية قطرة نانو القياسية. ويرجع ذلك إلى استنفاد الحمض النووي الريبوزي الريبوسومي من عينات EV ، والتي يمكن التحقق من صحتها باستخدام المحلل الحيوي Agilent. وبالتالي ، فإن درجة السلامة للقياس الكمي EV-RNA عادة ما تكون غير موثوقة وليست التمثيل الحقيقي لكمية EV-RNA. لذلك ، من أجل القياس الكمي qRT-PCR ل EV-RNA و RNA الخلوي ، تم استخدام أحجام متساوية من عزلات الحمض النووي الريبي بعد العزل من عدد متساو من الخلايا. لتطبيع qRT-PCR ، تم استخدام miRNAs الموجودة في كل مكان عبر عينات متعددة كما هو محدد من بيانات تسلسل الحمض النووي الريبي المكتسبة سابقا.
  2. قم بتحويل الحمض النووي الريبي المستخرج إلى cDNA باستخدام مجموعة النسخ العكسي الخاصة بالحمض النووي الريبي الصغير.
  3. قم بإعداد تفاعل qRT-PCR باستخدام قالب cDNA وبادئات خاصة ب miRNA باتباع إرشادات الشركة المصنعة.
    ملاحظة: لتجارب التحقق من الصحة ، تم استخدام مجموعة miRCURY LNA qRT PCR والبادئات المقابلة من الشركة المصنعة لتقييم تعبير الخلية miRNA و EV-miRNA.

النتائج

هنا ، نستخدم قياس التدفق الخلوي كأداة قوية للتحقيق في إطلاق miRNA من الخلايا إلى EVs. باستخدام هذا البروتوكول ، كشف تحليل قياس التدفق الخلوي للخلايا المنقولة باستخدام cell-miRNA و EV-miRNA عن انخفاض متسلسل في إشارة التألق المقابلة ل EV-miRNA ، بينما تم الاحتفاظ بالإشارة المقابلة ل cell-miRNA في الخلايا. للتأكد...

Discussion

يتيح البروتوكول الذي تم إنشاؤه حديثا التقاط حركية إطلاق miRNA في المركبات الكهربائية بعد نقل EV-miRNAs. يسمح هذا النهج بالتحليل المتزامن للعديد من EV-miRNAs و cell-miRNAs ، وفقا لقدرات مقياس الخلايا. علاوة على ذلك ، في حين أن تحليل قياس التدفق الخلوي يمكن أن يوفر رؤى قيمة في بيولوجيا EV miRNA ، إلا أنه لا يخلو ?...

Disclosures

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

Acknowledgements

نحن نقدر الدعم والمشورة من الدكتورة جيل هاتشكروفت ، مديرة المرفق الأساسي لقياس التدفق الخلوي في جامعة بوردو. تم دعم هذا العمل من قبل R01CA226259 و R01CA205420 إلى A.L.K. ، وجائزة الابتكار من جمعية الرئة الأمريكية (ANALA2023) IA-1059916 إلى ALK ، ومنحة Purdue Shared Resources Facility P30CA023168 ، ومنحة فولبرايت للدكتوراه الرائدة التي منحتها وزارة الخارجية بالولايات المتحدة الأمريكية إلى H.H.H.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
1.5 mL microcentrifuge tubesFisher05-408-129
15 mL Falcon tubesCorning352097
6-well clear flat bottom surface treated tissue culture platesFisher ScientificFB012927
ApogeeMix 25 mL, (PS80/110/500 & Si180/240/300/590/880/1300 nm) Apogee Flow Systems1527To set up gating and parameters for particle detection 
Attune Nxt Flow CytometerThermoFisher ScientificN/AFor fluorescence analysis in EVs
BD Fortessa Cell AnalyzerBD BiosciencesN/AFor fluorescence analysis in cells 
Cell culture incubatorN/AN/AMaintaining temperature of 37 °C and 5% CO2
Cell Culture mediumN/AN/Aspecific for the cell-line of interest
Cell line of interest N/AN/AAny cell line tested and evaluated for EV and cellular abundance of miRNAs on interest.
Cell-miRNA (miRIDIAN microRNA Mimic Red Transfection Control)Horizon discoveryCP-004500-01-05miRNAs predetermined to be retained by the cell-line of interest and not selectively exported out into EVs
EV-miRNA (Fluorophore conjugated miRNAs)Integrated DNA Technologies (IDT)miRNAs predetermined to be selectively sorted into EVs 
Fluorescence microscopeN/AN/A
Gibco Opti-MEM Reduced Serum MediumFisher Scientific31-985-070
Hausser Scientific HemocytometerFisher02-671-54
Hyclone 1x PBS (for cell culture)FisherSH30256FS
Lipofectamine RNAimaxFisher Scientific13-778-150
miRCURY LNA Reverse TranscriptaseQiagen339340
miRCURY LNA SYBR Green PCRQiagen 339347
mirVana RNA IsolationQiagenAM1561
Nuclease free waterFisher Scientific4387936
Paraformaldehyde, 4% in PBSFisherAAJ61899AK
Reagent reservoir nonsterileVWR89094-684
Thermo ABI QuantiStudio DX Real-Time PCRThermoFisher ScientificN/A
Trypsin 0.25%Fisher SH3004201
UltracentrifugeN/AN/A

References

  1. Kasinski, A. L., Slack, F. J. MicroRNAs en route to the clinic: Progress in validating and targeting microRNAs for cancer therapy. Nature Reviews Cancer. 11 (12), 849-864 (2011).
  2. Treiber, T., Treiber, N., Meister, G. Regulation of microRNA biogenesis and its crosstalk with other cellular pathways. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (1), 5-20 (2019).
  3. Lu, J., et al. MicroRNA expression profiles classify human cancers. Nature. 435 (7043), 834-838 (2005).
  4. Orellana, E., Tenneti, S., Rangasamy, L., Lyle, L., Low, P., Kasinski, A. FolamiRs: Ligand-targeted, vehicle-free delivery of microRNAs for the treatment of cancer. Science Translational Medicine. 9 (401), eaam9327 (2017).
  5. Orellana, E., et al. Enhancing microRNA activity through increased endosomal release mediated by nigericin. Molecular Therapy- Nucleic Acids. 16, 505-518 (2019).
  6. Abdelaal, A. M., et al. A first-in-class fully modified version of miR-34a with outstanding stability, activity, and anti-tumor efficacy. Oncogene. , (2023).
  7. Crescitelli, R., et al. Distinct RNA profiles in subpopulations of extracellular vesicles: Apoptotic bodies, microvesicles and exosomes. Journal of Extracellular Vesicles. 2, (2013).
  8. Hasan, H., et al. Extracellular vesicles released by non-small cell lung cancer cells drive invasion and permeability in non-tumorigenic lung epithelial cells. Scientific Reports. 12 (1), 972 (2022).
  9. Costa-Silva, B., et al. Pancreatic cancer exosomes initiate pre-metastatic niche formation in the liver. Nature Cell Biology. 17 (6), 816-826 (2015).
  10. Villarroya-Beltri, C., et al. Sumoylated hnRNPA2B1 controls the sorting of miRNAs into exosomes through binding to specific motifs. Nature Communications. 4, 2980 (2013).
  11. Cha, D., et al. KRAS-dependent sorting of miRNA to exosomes. elife. 4, e07197 (2015).
  12. Gandham, S., et al. Technologies and standardization in research on extracellular vesicles. Trends in Biotechnology. 38 (10), 1066-1098 (2020).
  13. Théry, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).
  14. Kowal, J., et al. Proteomic comparison defines novel markers to characterize heterogeneous populations of extracellular vesicle subtypes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (8), E968-E977 (2016).
  15. Sork, H., et al. Heterogeneity and interplay of the extracellular vesicle small RNA transcriptome and proteome. Scientific Reports. 8 (1), 10813 (2018).
  16. Mittelbrunn, M., et al. Unidirectional transfer of microRNA-loaded exosomes from T cells to antigen-presenting cells. Nature Communications. 2, 282 (2011).
  17. Chiou, N. T., Kageyama, R., Ansel, K. M. Selective export into extracellular vesicles and function of tRNA fragments during T cell activation. Cell Reports. 25 (12), 3356-3370 (2018).
  18. Guzewska, M. M., Witek, K. J., Karnas, E., Rawski, M., Zuba-Surma, E., Kaczmarek, M. M. miR-125b-5p impacts extracellular vesicle biogenesis, trafficking, and EV subpopulation release in the porcine trophoblast by regulating ESCRT-dependent pathway. The FASEB Journal. 37 (8), e23054 (2023).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

MiRNA MicroRNAs MiRNA EV miRNA QRT PCR

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved