Rastreando a liberação de miRNA em vesículas extracelulares usando citometria de fluxo

Resumo

Aqui, descrevemos um protocolo simples que permite a avaliação in vitro da abundância de microRNAs marcados fluorescentemente para estudar a dinâmica do empacotamento de microRNA e exportação para vesículas extracelulares (EVs).

Resumo

As vesículas extracelulares (EVs) são importantes mediadores da comunicação celular que são secretadas por uma variedade de diferentes células. Esses EVs transportam moléculas bioativas, incluindo proteínas, lipídios e ácidos nucléicos (DNA, mRNAs, microRNAs e outros RNAs não codificantes), de uma célula para outra, levando a consequências fenotípicas nas células receptoras. De todas as várias cargas de EV, os microRNAs (miRNAs) têm recebido muita atenção por seu papel na formação do microambiente e na educação de células receptoras por causa de sua clara desregulação e abundância em EVs. Dados adicionais indicam que muitos miRNAs são ativamente carregados em EVs. Apesar dessas evidências claras, a pesquisa sobre a dinâmica de exportação e os mecanismos de classificação de miRNA é limitada. Aqui, nós fornecemos um protocolo usando a análise por citometria de fluxo de EV-miRNA que pode ser usado para entender a dinâmica de carregamento de EV-miRNA e identificar a maquinaria envolvida na exportação de miRNA. Nesse protocolo, os miRNAs pré-determinados para serem enriquecidos em EVs e depletados das células do doador são conjugados a um fluoróforo e transfectados para as células do doador. Os miRNAs fluorescentemente marcados são então verificados para carregamento em EVs e depleção de células usando qRT-PCR. Como um controle de transfecção e uma ferramenta para controlar a população transfectada de células, um RNA celular fluorescentemente marcado (retido e esgotado em EV) é incluído. Células transfectadas com o miRNA-EV e miRNA-retido celular são avaliadas para sinais fluorescentes ao longo de 72 h. A intensidade de sinal de fluorescência específica para os miRNAs EV diminui rapidamente em comparação com os miRNAs retidos na célula. Usando este protocolo simples, pode-se agora avaliar a dinâmica de carregamento de miRNA e identificar vários fatores responsáveis pela carga de miRNAs em EVs.

Introdução

MicroRNAs (miRNAs) são um dos subconjuntos mais bem caracterizados de pequenos RNAs não codificantes, que são conhecidos por seu papel crítico na regulação gênica pós-transcricional. A expressão e a biogênese da maioria dos miRNAs seguem uma série coordenada de eventos que começa com a transcrição dos miRNAs primários (pri-miRNAs) no núcleo. Após o processamento nuclear pelo complexo microprocessado em precursores-miRNAs (pré-miRNAs), os pré-miRNAs são exportados para o citoplasma, onde passam por processamento posterior pela RNase III endonuclease, dicer em 21-23 nucleotídeos maduros miRNA duplexes¹. Uma das fitas do miRNA maduro processado liga-se aos RNAs mensageiros alvo (mRNAs), levando à degradação ou repressão translacional dos alvos². Com base no papel pleiotrópico dos miRNAs na regulação simultânea de múltiplos mRNAs alvos, não é surpreendente que a expressão de miRNA seja fortemente regulada³. De fato, a expressão inadequada contribui para vários estados patológicos, especialmente no câncer. A expressão aberrante de miRNAs não apenas representa uma assinatura doença-específica, mas também emergiu como alvo^{de potencial} prognóstico e terapêutico4,5,6. Além de seus papéis intracelulares, os miRNAs também têm papéis não autônomos. Por exemplo, os miRNAs podem ser seletivamente empacotados em EVs por células doadoras e exportados para sítios receptores, onde provocam diversas respostas fenotípicas na fisiologia normal e da doença ^7,8,9.

Apesar das evidências claras de que os miRNAs associados à EV são biomoléculas funcionais, não é completamente compreendido como subconjuntos específicos de miRNAs são desregulados em estados patológicos como o câncer e como a maquinaria celular seleciona e classifica os miRNAs em Evs^10,11. Dado o papel potencial dos miRNAs EV na modulação do microambiente, é fundamental identificar os mecanismos envolvidos na exportação de miRNAs selecionados para elucidar completamente o papel dos EVs na comunicação intercelular e patogênese da doença. Compreender o processo de liberação de miRNA em EVs não só destacará mediadores importantes da exportação de miRNA, mas também pode fornecer insights sobre potenciais terapêuticas. Para atingir esse nível de conhecimento, ferramentas precisam ser adaptadas para abordar fielmente essas novas questões experimentais. De fato, os estudos que avaliam EVs estão crescendo exponencialmente devido à introdução de novas técnicas e controles^12,13. Em relação à avaliação da abundância de miRNAs exportados para EVs, o sequenciamento de próxima geração e a reação em cadeia da polimerase com transcrição reversa quantitativa (qRT-PCR) têm sido as ferramentas padrão atuais. Embora essas ferramentas sejam úteis para avaliar a abundância de miRNAs em EVs, há limitações em sua sensibilidade e especificidade, e o uso dessas abordagens estáticas para avaliar a dinâmica é insuficiente. Delineando a dinâmica da exportação de miRNA para EVs requer uma combinação de ferramentas especializadas. Aqui, apresentamos um protocolo abrangente usando miRNAs fluorescentemente conjugados, para analisar a dinâmica da liberação de miRNA de células doadoras e incorporação em EVs. Também discutimos as vantagens e limitações do método e fornecemos recomendações para o uso ideal. O método versátil apresentado neste artigo será útil para pesquisadores interessados em estudar a liberação de miRNA em EVs e seus potenciais papéis na comunicação celular e na doença.

Protocolo

NOTA: Como pré-requisito para o uso desta técnica, a identificação e validação de miRNAs exportados seletivamente é necessária. Uma vez que diferentes linhagens celulares variam com base na carga de miRNA classificada em seus EVs, recomenda-se que a linhagem celular de interesse e EVs associados sejam avaliados para miRNAs antes do uso. Além disso, a transfecção à base de lipofectamina é uma das etapas críticas do protocolo; Recomenda-se pré-determinar a eficiência da transfecção antes da instalação do experimento.

1. Crescimento de células em cultura e transfecção de células com miRNA-EV conjugado a fluoróforos

1. Placa de 200.000 a 400.000 células em poços triplicados em uma placa de 6 poços em meio de cultura apropriado. Gire suavemente a placa para garantir uma distribuição celular uniforme. Incubar as células até atingirem 70%-80% de confluência, aproximadamente 24-48 h.
2. Para cada poço a ser transfectado, diluir o reagente de transfecção em 100μL de meio livre de soro em um tubo de microcentrífuga de acordo com as instruções do fabricante.
   NOTA: A concentração ideal de lipídio deve ser determinada para a linha celular de interesse antes desta configuração.
3. Para cada poço a ser transfectado, diluir o miRNA-EV conjugado a fluoróforo (2nM) e o miRNA-celular (2nM) separadamente em um tubo de microcentrífuga em 100 μL de meio livre de soro.
   NOTA: O volume total deve ser calculado para o número total de poços transfectados. Neste protocolo, a fluorescência foi avaliada em 7 momentos; portanto, o volume total foi de 700 μL para o passo 1,2 e 700 μL para o passo 1,3. Além disso, para capturar com confiança a população fluorescente positiva de células, o usuário deve transfectar células com um miRNA embaralhado não fluorescente e configurar uma porta excluindo essas células.
4. Adicionar a mistura de ARN diluída (do passo 1.3) ao reagente de transfecção diluído (do passo 1.2) e misturar suavemente invertendo o tubo 3-4 vezes. Deixe a mistura combinada de lipídio-RNA incubar por 30 min à temperatura ambiente (TR).
5. Remover o meio de cultura regular das células e adicionar 800 μL de meio sem soro a cada poço. Adicionar suavemente 200 μL da mistura de azoto lipídico e ARN (do passo 1.4) gota a gota às células.
   OBS: O meio Opti-MEM foi utilizado para transfecção da linhagem celular de interesse (células Calu6). Tente adicionar a mistura de lipídio-RNA diretamente ao meio de cultura, evitando adicionar a mistura nas laterais da placa.

2. Colheita de células transfectadas em vários pontos de tempo para análise de fluorescência

1. Incubar as células transfectadas a 37 °C durante 7 h.
   NOTA: Para validar a transfecção consistente de ambos os miRNAs (EV-miRNA e cell-miRNA), as células são coletadas de um poço 3 h após a transfecção para analisar a fluorescência usando o citômetro de fluxo.
2. Após o período de incubação de 7 h, remova o complexo de transfecção dos poços e substitua-o por meios completos.
3. Para avaliar o tempo de 7 h, colher as células e lavá-las três vezes com 1x PBS.
   1. Se estiver trabalhando com células aderentes, adicione 200 μL de tripsina a um poço e espere que as células se desprendam da placa. Transfira as células destacadas para um tubo de microcentrífuga e pellet por centrifugação a 200xg por 5 min.
   2. Descarte o sobrenadante cuidadosamente para evitar interromper o pellet celular. Para a primeira lavagem em PBS, ressuspenda o pellet em ~500 μL de 1x PBS e repita a peletização usando as etapas de centrifugação acima. Repita a lavagem PBS mais duas vezes.
   3. Ressuspender o pellet celular em 200 μL de solução de paraformaldeído (PFA) a 2% e avaliar a fluorescência.
      NOTA: Depois de adicionar 2% de PFA, o pellet de célula pode ser armazenado a 4 °C por 3-4 dias.
4. Colher os restantes pontos de tempo de acordo com as etapas do ponto 2.3. Recolha todos os pellets de células armazenados e prossiga com os passos na secção 3.

3. Análise por citometria de fluxo do sinal de miRNA-celular e EV-miRNA em células

1. Preparar células para análise de citometria de fluxo. Filtrar a suspensão celular da seção 2 até as tampas de filtro de 35 μm que fazem parte dos tubos FACS de poliestireno de fundo redondo para permitir a remoção de detritos e agregados celulares que possam interferir na análise de fluoróforos.
2. Configure o instrumento seguindo as instruções de calibração. Ligue o citômetro de fluxo e deixe aquecer por pelo menos 30 minutos antes de usar. Prima o sistema fluídico com fluido de bainha e verifique e ajuste o alinhamento do laser.
3. Execute o controle de qualidade para confirmar a fluídica do instrumento. Coloque água filtrada ultrapura no citômetro de fluxo e execute a uma taxa de fluxo apropriada para um tempo de aquisição adequado.
   NOTA: A taxa de fluxo e o tempo de aquisição apropriados dependerão do tipo de célula de interesse, da complexidade da amostra e da qualidade de dados desejada.
4. Abra o software de análise de dados de citometria de fluxo e confirme o desempenho do detector e lasers. Configure parâmetros de limiar e tensão para detecção com base na linha celular de interesse e fluoróforos de escolha.
   NOTA: Para todos os experimentos a jusante, células Calu6 foram usadas.
   1. Defina o limite para capturar o sinal para células Calu6 em FSC 5000. Realizar a análise para 1 x 10⁴ células para cada repetição experimental.
   2. Para explicar a sobreposição espectral entre diferentes fluoróforos, use células não transfectadas e células transfectadas independentemente com apenas um dos fluoróforos para estabelecer controles de compensação.
   3. Para a detecção de exportação de miRNAs, use candidatos a miRNAs EV (miR-451a e miR-150) conjugados a Alexa-fluor 488, e uma célula-controle de miRNA (cel-miR-67) conjugada a Cy3.
   4. Para cada EV-miRNA, conjugar o fluoróforo à extremidade 5′ da fita 5p. Antes da transfecção, recolhe a fita conjugada com fluoróforo à sua fita 3p 100% complementar.
   5. Para a análise da expressão em células transfectadas, analisar as amostras utilizando os canais FSC, SSC, FITC e PE ajustados para 258, 192, 269 e 423 unidades de tensão, respectivamente (Figura 1A, B).
5. Introduzir a amostra de controle negativo no citômetro de fluxo. Capture sinais de célula depois de definir as intensidades de dispersão direta (FSC) e dispersão lateral (SSC) em uma planilha personalizada.
6. No gráfico, escolha FSC para o eixo X, SSC para o eixo Y e porta para a população de interesse desenhando um polígono ao redor dele (veja a Figura 1B, painel inferior).
7. Crie um novo lote usando o condomínio fechado.
   1. Ajuste o eixo X para o sinal de fluorescência 1 (FS1) para detecção de miRNA celular e o eixo Y para o sinal de fluorescência 2 (FS2) para detecção de miRNA EV. Estabelecer parâmetros de compensação para os fluoróforos individuais usando células transfectadas independentemente com cada um dos miRNAs marcados fluorescentemente. No novo terreno, porta de entrada na população de interesse.
   2. Para detecção de EV-miRNA, use o canal FITC. Para a avaliação do sinal de miRNA celular, utilizar o canal de PE. No software, crie uma porta em torno das células que foram positivas para FITC e PE desenhando um polígono em torno da população de dupla fluorescência quando FITC foi selecionado para o eixo X e PE foi selecionado para o eixo Y.
8. Registre as estatísticas para a população fechada.
   1. Registre a porcentagem de células na população fechada que são positivas para FITC e PE, bem como para aquelas que são positivas para FITC ou PE.
9. Repita as etapas acima para quaisquer amostras ou controles adicionais no experimento.

4. Isolamento de EVs de células transfectadas

1. Para células cultivadas em meios contendo soro, esgotar EVs do soro para evitar contaminação cruzada.
   1. Para gerar soro depletado de EV, diluir o soro a 50% em meio de cultura celular para reduzir a viscosidade e centrifugar o soro resultante de 50% a 110.000 x g por 18 h.
   2. Recolher cuidadosamente o sobrenadante (soro sem EV) e filtrá-lo utilizando um conjunto de filtros de 0,2 μm. Use o soro 50% livre de EV resultante para gerar mídia completa, neste caso, RPMI mais 10% de soro.
   3. Para coletar EVs, adicione o meio completo esgotado de EV às células e colete os EVs 48 h após a incubação.
      NOTA: O protocolo descrito abaixo foi modificado de Kowal et ^al.14.
2. Cultivar células em placas de cultura de tecidos de 15 cm até 80% de confluência. Transfectar as células separadamente com miRNA-celular e e-miRNA em 10 mL de Opti-MEM seguindo o protocolo de transfecção na seção 1 do protocolo.
   NOTA: Nem todos os protocolos de transfecção escalam linearmente. Pode ser essencial primeiramente adaptar e avaliar as condições de transfecção em placas de 15 cm.
3. Após 7 h, aspirar o meio de transfecção e substituí-lo pelo meio depletado de EV (15 mL). Cultivar células no meio esgotado de EV por 48 h.
4. Retire o meio condicionado das células e distribua-o em um tubo centrífugo de 50 mL dentro do gabinete de biossegurança. Centrifugar o meio condicionado a 2000 x g durante 10 minutos a 4 °C para remover células mortas e detritos celulares. Transfira o sobrenadante resultante para um tubo fresco.
5. Centrifugar o sobrenadante a 10.000 x g durante 40 min a 4 °C. Remova o sobrenadante e filtre-o usando um conjunto de filtro de 0,2 μm.
6. Transfira o meio de cultura celular filtrado para um tubo de ultracentrífuga estéril dentro do gabinete de biossegurança. Pese e equilibre os tubos uns contra os outros. Girar as amostras a 110.000 x g por 90 min a 4 °C. Descarte o sobrenadante.
7. Ressuspender o pellet em um volume apropriado de 1x PBS para lavar e centrifugar a 110.000 x g por 90 min 4 °C.
   OBS: O pellet de EV foi ressuspendido em 60 mL de PBS 1x com base no volume máximo permitido para os tubos do rotor de ângulo fixo utilizados neste estudo.
8. Aspirar PBS e suspender o pellet de EV em um volume apropriado (50-100 μL) de 1x PBS fresco e vórtice. Armazene os veículos elétricos a -80 °C para utilização posterior.

5. Análise por citometria de fluxo do sinal de miRNA-celular e EV-miRNA em EVs

1. Para preparar a suspensão de EV para análise de citometria de fluxo, dilua os EVs em um volume apropriado de 1x PBS ultrafiltrado.
   NOTA: O volume de carga para a análise de citometria de fluxo de EVs deve ser determinado com base no número de EVs em amostras. Grosso modo, se houver ~30.000 partículas na suspensão EV, o volume final deve ser de ~500-600 μL em 1x PBS. Uma amostra limpa tem cerca de 35-50 partículas/μL.
2. Use o citômetro de nanofluxo ou um equipamento alternativo poderoso o suficiente para analisar partículas nanométricas.
   NOTA: Aqui, o citômetro de nanofluxo Attune NxT foi usado.
3. Abra o software e configure o instrumento seguindo as instruções de calibração recomendadas. Execute o teste de desempenho usando nanoesferas de desempenho. Se as nanoesferas forem detectadas na faixa de tamanho padrão, o desempenho é ideal. Determinar a taxa de fluxo apropriada para a detecção de partículas de EV.
4. Execute o controle de qualidade usando água filtrada ultrapura para confirmar a fluídicidade do instrumento e o desempenho do detector e lasers.
5. Usando esferas de calibração adequadas para o experimento, ajuste o citômetro de fluxo para detectar com precisão contas de tamanhos diferentes e medir sinais de fluorescência.
   OBS: Para a montagem da análise de EV por citometria de fluxo, foram utilizadas esferas ApogeeMix. Estas esferas contêm uma mistura de esferas de sílica não fluorescente e esferas de poliestireno fluorescente que variam em tamanhos de 80 nm a 1300 nm.
   1. Estabeleça os parâmetros para avaliar a sensibilidade e resolução de diferentes populações na mistura de cordões de acordo com o protocolo do fabricante. Use o gating apropriado para resolver a população de contas do ruído do instrumento.
6. Vórtice as amostras cuidadosamente para distribuir uniformemente os EVs antes de carregar para análise.
7. Abra o software de análise de dados de citometria de fluxo e introduza o PBS ultrafiltrado. Configure o gating para partículas EV usando PBS ultrafiltrado, garantindo que o gating corresponda ao tamanho apropriado de partículas com base nas esferas na etapa 5.5.
8. Carregue a amostra de controle negativo para analisar os EVs à medida que eles passam pelo citômetro de fluxo. Capture sinais EV enquanto plota FSC no eixo X e SSC no eixo Y.
   NOTA: O limite de SSC para capturar EVs foi definido em 300. O volume de aquisição foi fixado em 95 μL de um total de 145 μL de volume extraído. O fluxo foi fixado em 12,5 μL/min. A análise foi realizada com partículas de 1 x 10⁶ EV. A população de EV é heterogênea e resultará em alguns detritos isolados juntamente com EVs. A detecção geral de partículas no gráfico FSC vs. SSC destaca partículas em uma faixa diversificada, o que é esperado ao usar preparações brutas de EV.
9. Crie um novo lote usando o condomínio fechado.
   1. Desta vez, escolha o sinal de fluorescência 1 (FS1) para detecção de miRNA celular no eixo X e o sinal de fluorescência 2 (FS2) para detecção de miRNA-EV no eixo Y.
   2. Estabelecer parâmetros de compensação para os fluoróforos usando as amostras de EV isoladas de células transfectadas com um único miRNA. No novo terreno, portão sobre a população EV de interesse.
   3. Para a análise da expressão de miRNAs conjugados a fluoróforos em EVs isolados das células transfectadas, analise as amostras de EV usando os canais FSC, SSC, BL1 e YL1 ajustados para 370, 370, 400 e 400 unidades de tensão, respectivamente (Figura 2A, B).
   4. Registre as estatísticas para a população fechada e visualize-as usando histogramas e diagramas de pontos.
10. Repita as etapas acima para quaisquer amostras ou controles adicionais no experimento.

6. Validando a liberação de miRNAs em EVs através de qRT-PCR

1. Extraia o RNA de EVs e células parentais usando o kit de isolamento de RNA miRVana seguindo as instruções do fabricante.
   NOTA: A quantificação de RNA isolado de EVs não é possível porque a quantidade total de RNA isolado de EVs normalmente não ultrapassa o limite de quantidade mínima de uma nanogota padrão. Isso se deve à depleção do RNA ribossomal das amostras de EV, que pode ser validada usando o Bioanalisador Agilent. Assim, o escore de integridade para quantificação de RNA-EV geralmente não é confiável e não é a verdadeira representação da quantidade de RNA-EV. Portanto, para a quantificação por qRT-PCR do RNA-EV e RNA-celular, volumes iguais de isolados de RNA após o isolamento de um número igual de células foram usados. Para a normalização da qRT-PCR, foram usados miRNAs presentes em múltiplas amostras, determinados a partir de dados de sequenciamento de RNA previamente adquiridos.
2. Converter o RNA extraído em cDNA usando um kit de transcriptase reversa específico para pequenos RNAs.
3. Configure a reação de qRT-PCR usando um molde de cDNA e primers específicos de miRNA seguindo as instruções do fabricante.
   NOTA: Para experimentos de validação, o kit de PCR miRCURY LNA qRT e os primers correspondentes do fabricante foram usados para avaliar a expressão de miRNA-celular e EV-miRNA.

Resultados

Aqui, utilizamos a citometria de fluxo como uma ferramenta poderosa para investigar a liberação de miRNA das células em EVs. Usando este protocolo, a análise por citometria de fluxo das células transfectadas com miRNA-celular e miRNA-EV revelou uma diminuição sequencial do sinal de fluorescência correspondente ao miRNA-EV, enquanto o sinal correspondente ao miRNA-celular foi retido nas células. Para garantir que a conjugação de fluoróforos não interfira na liberação de miRNA em EVs, o miR-451a foi conjugad...

Discussão

O protocolo recém-estabelecido permite capturar a cinética de liberação de miRNA em EVs pós-transfecção de EV-miRNAs. A abordagem permite a análise simultânea de múltiplos miRNAs EV e miRNAs celulares, sujeitos às capacidades do citômetro. Além disso, embora a análise por citometria de fluxo possa fornecer informações valiosas sobre a biologia do miRNA EV, ela não está isenta de limitações. No entanto, algumas das limitações podem ser superadas quando utilizadas em conjunto com outras técnicas para...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL microcentrifuge tubes	Fisher	05-408-129
15 mL Falcon tubes	Corning	352097
6-well clear flat bottom surface treated tissue culture plates	Fisher Scientific	FB012927
ApogeeMix 25 mL, (PS80/110/500 & Si180/240/300/590/880/1300 nm)	Apogee Flow Systems	1527	To set up gating and parameters for particle detection
Attune Nxt Flow Cytometer	ThermoFisher Scientific	N/A	For fluorescence analysis in EVs
BD Fortessa Cell Analyzer	BD Biosciences	N/A	For fluorescence analysis in cells
Cell culture incubator	N/A	N/A	Maintaining temperature of 37 °C and 5% CO2
Cell Culture medium	N/A	N/A	specific for the cell-line of interest
Cell line of interest	N/A	N/A	Any cell line tested and evaluated for EV and cellular abundance of miRNAs on interest.
Cell-miRNA (miRIDIAN microRNA Mimic Red Transfection Control)	Horizon discovery	CP-004500-01-05	miRNAs predetermined to be retained by the cell-line of interest and not selectively exported out into EVs
EV-miRNA (Fluorophore conjugated miRNAs)	Integrated DNA Technologies (IDT)		miRNAs predetermined to be selectively sorted into EVs
Fluorescence microscope	N/A	N/A
Gibco Opti-MEM Reduced Serum Medium	Fisher Scientific	31-985-070
Hausser Scientific Hemocytometer	Fisher	02-671-54
Hyclone 1x PBS (for cell culture)	Fisher	SH30256FS
Lipofectamine RNAimax	Fisher Scientific	13-778-150
miRCURY LNA Reverse Transcriptase	Qiagen	339340
miRCURY LNA SYBR Green PCR	Qiagen	339347
mirVana RNA Isolation	Qiagen	AM1561
Nuclease free water	Fisher Scientific	4387936
Paraformaldehyde, 4% in PBS	Fisher	AAJ61899AK
Reagent reservoir nonsterile	VWR	89094-684
Thermo ABI QuantiStudio DX Real-Time PCR	ThermoFisher Scientific	N/A
Trypsin 0.25%	Fisher	SH3004201
Ultracentrifuge	N/A	N/A