Seguimiento de la liberación de miARN en vesículas extracelulares mediante citometría de flujo

Resumen

Aquí, describimos un protocolo sencillo que permite la evaluación in vitro de la abundancia de microARN marcados con fluorescencia para estudiar la dinámica del empaquetamiento y exportación de microARN a vesículas extracelulares (EV).

Resumen

Las vesículas extracelulares (VE) son mediadores importantes de la comunicación celular que son secretadas por una variedad de células diferentes. Estos VE transportan moléculas bioactivas, incluidas proteínas, lípidos y ácidos nucleicos (ADN, ARNm, microARN y otros ARN no codificantes), de una célula a otra, lo que tiene consecuencias fenotípicas en las células receptoras. De todas las diversas cargas de VE, los microARN (miARN) han atraído una gran atención por su papel en la configuración del microambiente y en la educación de las células receptoras debido a su clara desregulación y abundancia en los VE. Los datos adicionales indican que muchos miARN se cargan activamente en los VE. A pesar de esta clara evidencia, la investigación sobre la dinámica de la exportación y los mecanismos de clasificación de miARN es limitada. Aquí, proporcionamos un protocolo que utiliza el análisis de citometría de flujo de EV-miRNA que se puede utilizar para comprender la dinámica de la carga de EV-miRNA e identificar la maquinaria involucrada en la exportación de miRNA. En este protocolo, los miARN predeterminados para enriquecerse en VE y agotarse de las células del donante se conjugan con un fluoróforo y se transfectan en las células del donante. A continuación, se verifica la carga de los miARN marcados con fluorescencia en los VE y el agotamiento de las células mediante qRT-PCR. Como control de transfección y como herramienta para controlar la población transfectada de células, se incluye un ARN celular marcado con fluorescencia (retenido por células y agotado por EV). Las células transfectadas tanto con el miARN EV como con el miARN retenido por células se evalúan en busca de señales fluorescentes en el transcurso de 72 h. La intensidad de la señal de fluorescencia específica para los miARN EV disminuye rápidamente en comparación con el miARN retenido en la célula. Utilizando este sencillo protocolo, ahora se podría evaluar la dinámica de la carga de miARN e identificar varios factores responsables de la carga de miARN en los VE.

Introducción

Los microARN (miARN) son uno de los subconjuntos mejor caracterizados de pequeños ARN no codificantes, que son conocidos por su papel fundamental en la regulación génica postranscripcional. La expresión y la biogénesis de la mayoría de los miRNAs siguen una serie coordinada de eventos que comienza con la transcripción de los miRNAs primarios (pri-miRNAs) en el núcleo. Después del procesamiento nuclear por el complejo del microprocesador en miARN precursores (pre-miARN), los pre-miARN se exportan al citoplasma, donde se someten a un procesamiento adicional por la endonucleasa ARNasa III, en dúplex de miARN maduros de 21-23 nucleótidos¹. Una de las hebras del miARN maduro procesado se une a los ARN mensajeros (ARNm) diana, lo que conduce a la degradación o represión traduccional de las dianas². Sobre la base del papel pleiotrópico de los miARN en la regulación simultánea de múltiples ARNm diana diversos, no es sorprendente que la expresión de miARN esté estrictamente regulada³. De hecho, la expresión inapropiada contribuye a varios estados de enfermedad, especialmente en el cáncer. La expresión aberrante de miRNAs no solo representa una firma específica de la enfermedad, sino que también ha surgido como una diana para el potencial pronóstico y terapéutico ^4,5,6. Además de sus funciones intracelulares, los miARN también tienen funciones no autónomas. Por ejemplo, las células donantes pueden empaquetar selectivamente los miARN en VE y exportarlos a los sitios receptores, donde provocan diversas respuestas fenotípicas en la fisiología normal y de la enfermedad ^7,8,9.

A pesar de la clara evidencia de que los miRNAs asociados a EV son biomoléculas funcionales, no se comprende completamente cómo subconjuntos específicos de miRNAs están desregulados en estados patológicos como el cáncer y cómo la maquinaria celular selecciona y clasifica los miRNAs en^{Evs 10,11}. Dado el papel potencial de los miARN EV en la modulación del microambiente, es fundamental identificar los mecanismos implicados en la exportación de miARN seleccionados para dilucidar completamente el papel de los VE en la comunicación intercelular y la patogénesis de la enfermedad. Comprender el proceso de liberación de miARN en los VE no solo destacará los mediadores importantes de la exportación de miARN, sino que también puede proporcionar información sobre posibles terapias. Para alcanzar este nivel de conocimiento, es necesario adaptar las herramientas para abordar fielmente estas nuevas preguntas experimentales. De hecho, los estudios que evalúan los VE están creciendo exponencialmente debido a la introducción de nuevas técnicas y controles^12,13. En relación con la evaluación de la abundancia de miRNAs exportados a VE, la secuenciación de nueva generación y la reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa cuantitativa (qRT-PCR) han sido las herramientas estándar actuales. Si bien estas herramientas son útiles para evaluar la abundancia de miARN en los VE, existen limitaciones en cuanto a su sensibilidad y especificidad, y el uso de estos enfoques estáticos para evaluar la dinámica es insuficiente. Delinear la dinámica de la exportación de miARN a los VE requiere una combinación de herramientas especializadas. Aquí, presentamos un protocolo completo que utiliza miARN conjugados con fluorescencia, para analizar la dinámica de la liberación de miARN de las células donantes y la incorporación a los VE. También discutimos las ventajas y limitaciones del método y brindamos recomendaciones para un uso óptimo. El método versátil presentado en este artículo será útil para los investigadores interesados en estudiar la liberación de miARN en los VE y sus posibles funciones en la comunicación celular y la enfermedad.

Protocolo

NOTA: Como requisito previo para utilizar esta técnica, se requiere la identificación y validación de los miARN exportados selectivamente. Dado que las diferentes líneas celulares varían en función de la carga de miARN clasificada en sus EV, se recomienda que la línea celular de interés y las VE asociadas se evalúen en busca de miARN antes de su uso. Además, la transfección basada en lipofectamina es uno de los pasos críticos del protocolo; Se recomienda predeterminar la eficiencia de la transfección antes de configurar el experimento.

1. Células en cultivo y transfección de células con EV-miRNA conjugado con fluoróforos

1. Coloque de 200.000 a 400.000 células en pocillos triplicados en una placa de 6 pocillos en un medio de cultivo apropiado. Gire suavemente la placa para asegurar una distribución uniforme de las células. Incubar las células hasta que alcancen el 70%-80% de confluencia, aproximadamente 24-48 h.
2. Para cada pocillo a transfectar, diluir el reactivo de transfección en 100 μL de medio libre de suero en un tubo de microcentrífuga de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
   NOTA: La concentración óptima de lípidos debe determinarse para la línea celular de interés antes de esta configuración.
3. Para cada pocillo que se va a transfectar, diluir el EV-miRNA conjugado con fluoróforos (2nM) y el miRNA celular (2nM) por separado en un tubo de microcentrífuga en 100 μL de medio libre de suero.
   NOTA: El volumen total debe calcularse para el número total de pozos transfectados. En este protocolo, la fluorescencia se evaluó en 7 puntos temporales; por lo tanto, el volumen total fue de 700 μL para el paso 1.2 y de 700 μL para el paso 1.3. Además, para capturar con confianza la población fluorescente positiva de células, el usuario debe transfectar células con un miARN codificado no fluorescente y establecer una puerta que excluya estas células.
4. Añadir la mezcla de ARN diluido (del paso 1.3) al reactivo de transfección diluido (del paso 1.2) y mezclar suavemente invirtiendo el tubo 3-4 veces. Deje que la mezcla combinada de lípidos y ARN se incube durante 30 minutos a temperatura ambiente (RT).
5. Retire el medio de cultivo normal de las células y agregue 800 μL de medio sin suero a cada pocillo. Añadir suavemente 200 μL de la mezcla de lípidos y ARN (del paso 1.4) gota a gota a las células.
   NOTA: Se utilizó el medio Opti-MEM para transfectar la línea celular de interés (células Calu6). Trate de agregar la mezcla de lípidos y ARN directamente al medio de cultivo, evitando agregar la mezcla a los lados de la placa.

2. Recolección de células transfectadas en varios puntos de tiempo para el análisis de fluorescencia

1. Incubar las células transfectadas a 37 °C durante 7 h.
   NOTA: Para validar la transfección consistente de ambos miARN (EV-miRNA y miARN celular), se recolectan células de un pocillo 3 h después de la transfección para analizar la fluorescencia utilizando el citómetro de flujo.
2. Después del período de incubación de 7 h, retire el complejo de transfección de los pocillos y reemplácelo con medios completos.
3. Para evaluar el punto de tiempo de 7 h, recoja las células y lávelas tres veces con 1x PBS.
   1. Si trabaja con células adherentes, agregue 200 μL de tripsina a un pocillo y espere a que las células se desprendan de la placa. Transfiera las células desprendidas a un tubo de microcentrífuga y gránulos por centrifugación a 200xg durante 5 min.
   2. Deseche el sobrenadante con cuidado para evitar alterar el gránulo de la célula. Para el primer lavado de PBS, vuelva a suspender el gránulo en ~ 500 μL de 1x PBS y repita la granulación siguiendo los pasos de centrifugación anteriores. Repita el lavado con PBS dos veces más.
   3. Vuelva a suspender el gránulo celular en 200 μL de solución de paraformaldehído (PFA) al 2% y evalúe la fluorescencia.
      NOTA: Después de agregar un 2% de PFA, el gránulo celular se puede almacenar a 4 °C durante 3-4 días.
4. Coseche los puntos de tiempo restantes siguiendo los pasos de la sección 2.3. Recoja todos los gránulos de celda almacenados y continúe con los pasos de la sección 3.

3. Análisis de citometría de flujo de la señal célula-miRNA y EV-miRNA en células

1. Preparar las células para el análisis de citometría de flujo. Filtre la suspensión celular de la sección 2 a las tapas de filtro de 35 μm que forman parte de los tubos FACS de poliestireno de fondo redondo para permitir la eliminación de desechos y agregados celulares que puedan interferir con el análisis de fluoróforos.
2. Configure el instrumento siguiendo las instrucciones de calibración. Encienda el citómetro de flujo y deje que se caliente durante al menos 30 minutos antes de usarlo. Prepare el sistema de fluídica con líquido de vaina y verifique y ajuste la alineación del láser.
3. Ejecute el control de calidad para confirmar la fluídica del instrumento. Cargue agua filtrada ultrapura en el citómetro de flujo y hágalo funcionar a un caudal adecuado para un tiempo de adquisición adecuado.
   NOTA: El caudal y el tiempo de adquisición adecuados dependerán del tipo de celda de interés, la complejidad de la muestra y la calidad de datos deseada.
4. Abra el software de análisis de datos de citometría de flujo y confirme el rendimiento del detector y los láseres. Configure parámetros de umbral y voltaje para la detección en función de la línea celular de interés y los fluoróforos elegidos.
   NOTA: Para todos los experimentos posteriores, se utilizaron células Calu6.
   1. Establezca el umbral para capturar la señal de las celdas Calu6 en FSC 5000. Realice el análisis para 1 x 10⁴ celdas para cada repetición experimental.
   2. Para tener en cuenta la superposición espectral entre diferentes fluoróforos, utilice células no transfectadas y células transfectadas de forma independiente con solo uno de los fluoróforos para establecer controles de compensación.
   3. Para la detección de la exportación de miARN, utilice EV-miRNAs candidatos (miR-451a y miR-150) conjugados con Alexa-fluor 488, y una célula de control-miRNA (cel-miR-67) conjugada con Cy3.
   4. Para cada EV-miRNA, conjuge el fluoróforo con el extremo 5′ de la hebra 5p. Antes de la transfección, recocer la hebra conjugada con fluoróforos a su hebra 3p 100% complementaria.
   5. Para el análisis de expresión en células transfectadas, analice las muestras utilizando los canales FSC, SSC, FITC y PE configurados en 258, 192, 269 y 423 unidades de voltaje, respectivamente (Figura 1A, B).
5. Introduzca la muestra de control negativo en el citómetro de flujo. Capture las señales de la célula después de definir las intensidades de dispersión directa (FSC) y dispersión lateral (SSC) en una hoja de cálculo personalizada.
6. En la gráfica, elija FSC para el eje X, SSC para el eje Y y puerta para la población de interés dibujando un polígono a su alrededor (consulte la Figura 1B, panel inferior).
7. Cree una nueva parcela utilizando la población cerrada.
   1. Establezca el eje X en la señal de fluorescencia 1 (FS1) para la detección de miARN celular y el eje Y en la señal de fluorescencia 2 (FS2) para la detección de miARN EV. Establezca parámetros de compensación para los fluoróforos individuales utilizando células transfectadas de forma independiente con cada uno de los miARN marcados con fluorescencia. En la nueva parcela, puerta sobre la población de interés.
   2. Para la detección de miARN EV, utilice el canal FITC. Para la evaluación de la señal célula-miARN, utilice el canal PE. En el software, cree una puerta alrededor de las celdas que fueron positivas tanto para FITC como para PE dibujando un polígono alrededor de la población de doble fluorescencia cuando se seleccionó FITC para el eje X y PE para el eje Y.
8. Registre las estadísticas de la población cerrada.
   1. Registre el porcentaje de células en la población cerrada que son positivas tanto para FITC como para PE, así como para aquellas que son positivas para FITC o PE.
9. Repita los pasos anteriores para cualquier muestra o control adicional en el experimento.

4. Aislamiento de las VE de las células transfectadas

1. En el caso de las células cultivadas en medios que contienen suero, se deben agotar los VE del suero para evitar la contaminación cruzada.
   1. Para generar suero agotado en EV, diluir el suero al 50% en medios de cultivo celular para reducir la viscosidad y centrifugar el suero resultante al 50% a 110.000 x g durante 18 h.
   2. Recoja el sobrenadante (suero libre de EV) con cuidado y fíltrelo con un conjunto de filtro de 0,2 μm. Utilice el suero resultante 50% libre de EV para generar medios completos, en este caso, RPMI más 10% de suero.
   3. Para recolectar los EV, agregue el medio completo agotado de EV a las celdas y recoja los EV 48 h después de la incubación.
      NOTA: El protocolo que se describe a continuación ha sido modificado a partir de Kowal et ^al.14.
2. Cultive células en placas de cultivo de tejidos de 15 cm hasta una confluencia del 80%. Transfectar las células por separado con miRNA celular y miARN EV en 10 ml de Opti-MEM siguiendo el protocolo de transfección de la sección 1 del protocolo.
   NOTA: No todos los protocolos de transfección se escalan linealmente. Puede ser esencial adaptar y evaluar primero las condiciones de transfección en placas de 15 cm.
3. Después de 7 h, aspire el medio de transfección y reemplácelo con el medio agotado de EV (15 mL). Cultive células en el medio agotado de EV durante 48 h.
4. Retire el medio acondicionado de las células y dispense en un tubo de centrífuga de 50 ml dentro de la cabina de bioseguridad. Centrifugar el medio acondicionado a 2000 x g durante 10 min a 4 °C para eliminar las células muertas y los restos celulares. Transfiera el sobrenadante resultante a un tubo nuevo.
5. Centrifugar el sobrenadante a 10.000 x g durante 40 min a 4 °C. Retire el sobrenadante y fíltrelo con un conjunto de filtro de 0,2 μm.
6. Transfiera los medios de cultivo celular filtrados a un tubo de ultracentrífuga estéril dentro de la cabina de bioseguridad. Pesa y equilibra los tubos entre sí. Centrifugar las muestras a 110.000 x g durante 90 min a 4 °C. Deseche el sobrenadante.
7. Vuelva a suspender el pellet en un volumen adecuado de 1x PBS para lavar y centrifugar a 110.000 x g durante 90 min 4 °C.
   NOTA: El gránulo EV se resuspendió en 60 mL de 1x PBS según el volumen máximo permitido para los tubos de rotor de ángulo fijo utilizados en este estudio.
8. Aspire PBS y suspenda el gránulo EV en un volumen adecuado (50-100 μL) de PBS fresco 1x y vórtice. Almacene los vehículos eléctricos a -80 °C para su uso posterior.

5. Análisis por citometría de flujo de la señal célula-miRNA y EV-miRNA en EV

1. Para preparar la suspensión de EV para el análisis de citometría de flujo, diluya los EV en un volumen adecuado de PBS 1x ultrafiltrado.
   NOTA: El volumen de carga para el análisis de citometría de flujo de VE debe determinarse en función del número de VE en las muestras. Aproximadamente, si hay ~30.000 partículas en la suspensión EV, el volumen final debería ser de ~500-600 μL en 1x PBS. Una muestra limpia tiene alrededor de 35-50 partículas/μL.
2. Utilice el citómetro de nanoflujo o un equipo alternativo lo suficientemente potente como para analizar partículas de tamaño nanométrico.
   NOTA: En este caso, se utilizó el citómetro de nanoflujo Attune NxT.
3. Abra el software y configure el instrumento siguiendo las instrucciones de calibración recomendadas. Realice la prueba de rendimiento utilizando nanoperlas de rendimiento. Si las nanoperlas se detectan en el rango de tamaño estándar, el rendimiento es óptimo. Determinar el caudal adecuado para la detección de partículas EV.
4. Ejecute el control de calidad utilizando agua filtrada ultrapura para confirmar la fluídica del instrumento y el rendimiento del detector y los láseres.
5. Usando perlas de calibración adecuadas para el experimento, configure el citómetro de flujo para detectar con precisión perlas de diferentes tamaños y medir las señales de fluorescencia.
   NOTA: Para la configuración del análisis EV por citometría de flujo, se utilizaron perlas ApogeeMix. Estas perlas contienen una mezcla de perlas de sílice no fluorescentes y perlas de poliestireno fluorescente que varían en tamaños de 80 nm a 1300 nm.
   1. Configure los parámetros para evaluar la sensibilidad y la resolución de diferentes poblaciones en la mezcla de perlas de acuerdo con el protocolo del fabricante. Utilice la compuerta adecuada para resolver la población de cordones a partir del ruido del instrumento.
6. Agite las muestras a fondo para distribuir uniformemente los vehículos eléctricos antes de cargarlos para su análisis.
7. Abra el software de análisis de datos de citometría de flujo e introduzca el PBS ultrafiltrado. Configure la compuerta para las partículas de EV utilizando PBS ultrafiltrado mientras se asegura de que la compuerta corresponda al tamaño adecuado de partículas en función de las perlas en el paso 5.5.
8. Cargue la muestra de control negativo para analizar los EV a medida que pasan por el citómetro de flujo. Capture señales EV mientras traza FSC en el eje X y SSC en el eje Y.
   NOTA: El umbral de SSC para capturar vehículos eléctricos se estableció en 300. El volumen de adquisición se fijó en 95 μL de un total de 145 μL de volumen estirado. El caudal se fijó en 12,5 μL/min. El análisis se realizó con partículas 1 x 10⁶ EV. La población de vehículos eléctricos es heterogénea y dará lugar a algunos escombros aislados junto con los vehículos eléctricos. La detección general de partículas en el gráfico FSC vs. SSC destaca las partículas en un rango diverso, lo que se espera cuando se utilizan preparaciones de EV crudo.
9. Cree una nueva parcela utilizando la población cerrada.
   1. Esta vez, elija la señal de fluorescencia 1 (FS1) para la detección de miARN celular en el eje X y la señal de fluorescencia 2 (FS2) para la detección de miARN EV en el eje Y.
   2. Configure los parámetros de compensación para los fluoróforos utilizando las muestras de EV aisladas de células transfectadas con un solo miARN. En la nueva parcela, puerta de entrada a la población de vehículos eléctricos de interés.
   3. Para el análisis de la expresión de miARN conjugados con fluoróforos en EV aislados de las células transfectadas, analice las muestras de EV utilizando los canales FSC, SSC, BL1 e YL1 configurados en 370, 370, 400 y 400 unidades de voltaje, respectivamente (Figura 2A, B).
   4. Registre las estadísticas de la población cerrada y visualícelas mediante histogramas y diagramas de puntos.
10. Repita los pasos anteriores para cualquier muestra o control adicional en el experimento.

6. Validación de la liberación de miRNAs en VE a través de qRT-PCR

1. Extraiga el ARN de los VE y las células madre utilizando el kit de aislamiento de ARN miRVana siguiendo las instrucciones del fabricante.
   NOTA: La cuantificación del ARN aislado de los VE no es posible porque la cantidad total de ARN aislado de los VE no suele cruzar el umbral de cantidad mínima de una nanogota estándar. Esto se debe al agotamiento del ARN ribosómico de las muestras de EV, que se puede validar con el Bioanalizador Agilent. Por lo tanto, la puntuación de integridad para la cuantificación de ARN-EV no suele ser fiable y no es la verdadera representación de la cantidad de ARN-EV. Por lo tanto, para la cuantificación de qRT-PCR del ARN-EV y el ARN celular, se utilizaron volúmenes iguales de aislados de ARN después del aislamiento de un número igual de células. Para la normalización de la qRT-PCR, se utilizaron miARN presentes de forma ubicua en múltiples muestras, según lo determinado a partir de los datos de secuenciación de ARN adquiridos previamente.
2. Convierta el ARN extraído en ADNc utilizando un kit de transcriptasa inversa específico para ARN pequeños.
3. Configure la reacción qRT-PCR utilizando una plantilla de ADNc y cebadores específicos de miARN siguiendo las instrucciones del fabricante.
   NOTA: Para los experimentos de validación, se utilizó el kit de PCR miRCURY LNA qRT y los cebadores correspondientes del fabricante para evaluar la expresión de miARN celular y miARN EV.

Resultados

Aquí, utilizamos la citometría de flujo como una herramienta poderosa para investigar la liberación de miARN de las células en las VE. Utilizando este protocolo, el análisis de citometría de flujo de células transfectadas con miRNA celular y miARN EV reveló una disminución secuencial de la señal de fluorescencia correspondiente al miARN EV, mientras que la señal correspondiente al miARN celular se retuvo en las células. Para garantizar que la conjugación de fluoróforos no interfiera con la liberación de mi...

Discusión

El protocolo recientemente establecido permite capturar la cinética de liberación de miARN en los VE después de la transfección de los MIARN de EV. El enfoque permite el análisis simultáneo de múltiples EV-miRNAs y miRNAs celulares, sujeto a las capacidades del citómetro. Además, aunque el análisis de citometría de flujo puede proporcionar información valiosa sobre la biología de los miARN de los VE, no está exento de limitaciones. Sin embargo, algunas de las limitaciones pueden superarse cuando se utilizan...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL microcentrifuge tubes	Fisher	05-408-129
15 mL Falcon tubes	Corning	352097
6-well clear flat bottom surface treated tissue culture plates	Fisher Scientific	FB012927
ApogeeMix 25 mL, (PS80/110/500 & Si180/240/300/590/880/1300 nm)	Apogee Flow Systems	1527	To set up gating and parameters for particle detection
Attune Nxt Flow Cytometer	ThermoFisher Scientific	N/A	For fluorescence analysis in EVs
BD Fortessa Cell Analyzer	BD Biosciences	N/A	For fluorescence analysis in cells
Cell culture incubator	N/A	N/A	Maintaining temperature of 37 °C and 5% CO2
Cell Culture medium	N/A	N/A	specific for the cell-line of interest
Cell line of interest	N/A	N/A	Any cell line tested and evaluated for EV and cellular abundance of miRNAs on interest.
Cell-miRNA (miRIDIAN microRNA Mimic Red Transfection Control)	Horizon discovery	CP-004500-01-05	miRNAs predetermined to be retained by the cell-line of interest and not selectively exported out into EVs
EV-miRNA (Fluorophore conjugated miRNAs)	Integrated DNA Technologies (IDT)		miRNAs predetermined to be selectively sorted into EVs
Fluorescence microscope	N/A	N/A
Gibco Opti-MEM Reduced Serum Medium	Fisher Scientific	31-985-070
Hausser Scientific Hemocytometer	Fisher	02-671-54
Hyclone 1x PBS (for cell culture)	Fisher	SH30256FS
Lipofectamine RNAimax	Fisher Scientific	13-778-150
miRCURY LNA Reverse Transcriptase	Qiagen	339340
miRCURY LNA SYBR Green PCR	Qiagen	339347
mirVana RNA Isolation	Qiagen	AM1561
Nuclease free water	Fisher Scientific	4387936
Paraformaldehyde, 4% in PBS	Fisher	AAJ61899AK
Reagent reservoir nonsterile	VWR	89094-684
Thermo ABI QuantiStudio DX Real-Time PCR	ThermoFisher Scientific	N/A
Trypsin 0.25%	Fisher	SH3004201
Ultracentrifuge	N/A	N/A