Seguimiento de la liberación de miARN en vesículas extracelulares mediante citometría de flujo

Resumen

Aquí, describimos un protocolo sencillo que permite la evaluación in vitro de la abundancia de microARN marcados con fluorescencia para estudiar la dinámica del empaquetamiento y exportación de microARN a vesículas extracelulares (EV).

Resumen

Las vesículas extracelulares (VE) son mediadores importantes de la comunicación celular que son secretadas por una variedad de células diferentes. Estos VE transportan moléculas bioactivas, incluidas proteínas, lípidos y ácidos nucleicos (ADN, ARNm, microARN y otros ARN no codificantes), de una célula a otra, lo que tiene consecuencias fenotípicas en las células receptoras. De todas las diversas cargas de VE, los microARN (miARN) han atraído una gran atención por su papel en la configuración del microambiente y en la educación de las células receptoras debido a su clara desregulación y abundancia en los VE. Los datos adicionales indican que muchos miARN se cargan activamente en los VE. A pesar de esta clara evidencia, la investigación sobre la dinámica de la exportación y los mecanismos de clasificación de miARN es limitada. Aquí, proporcionamos un protocolo que utiliza el análisis de citometría de flujo de EV-miRNA que se puede utilizar para comprender la dinámica de la carga de EV-miRNA e identificar la maquinaria involucrada en la exportación de miRNA. En este protocolo, los miARN predeterminados para enriquecerse en VE y agotarse de las células del donante se conjugan con un fluoróforo y se transfectan en las células del donante. A continuación, se verifica la carga de los miARN marcados con fluorescencia en los VE y el agotamiento de las células mediante qRT-PCR. Como control de transfección y como herramienta para controlar la población transfectada de células, se incluye un ARN celular marcado con fluorescencia (retenido por células y agotado por EV). Las células transfectadas tanto con el miARN EV como con el miARN retenido por células se evalúan en busca de señales fluorescentes en el transcurso de 72 h. La intensidad de la señal de fluorescencia específica para los miARN EV disminuye rápidamente en comparación con el miARN retenido en la célula. Utilizando este sencillo protocolo, ahora se podría evaluar la dinámica de la carga de miARN e identificar varios factores responsables de la carga de miARN en los VE.

Introducción

Los microARN (miARN) son uno de los subconjuntos mejor caracterizados de pequeños ARN no codificantes, que son conocidos por su papel fundamental en la regulación génica postranscripcional. La expresión y la biogénesis de la mayoría de los miRNAs siguen una serie coordinada de eventos que comienza con la transcripción de los miRNAs primarios (pri-miRNAs) en el núcleo. Después del procesamiento nuclear por el complejo del microprocesador en miARN precursores (pre-miARN), los pre-miARN se exportan al citoplasma, donde se someten a un procesamiento adicional por la endonucleasa ARNasa III, en dúplex de miARN maduros de 21-23 nucleótidos¹. Una de l....

Protocolo

NOTA: Como requisito previo para utilizar esta técnica, se requiere la identificación y validación de los miARN exportados selectivamente. Dado que las diferentes líneas celulares varían en función de la carga de miARN clasificada en sus EV, se recomienda que la línea celular de interés y las VE asociadas se evalúen en busca de miARN antes de su uso. Además, la transfección basada en lipofectamina es uno de los pasos críticos del protocolo; Se recomienda predeterminar la eficiencia de la transfección antes de configurar el experimento.

1. Células en cultivo y transfección de células con EV-miRNA conjugado con fluoróforos

....

Discusión

El protocolo recientemente establecido permite capturar la cinética de liberación de miARN en los VE después de la transfección de los MIARN de EV. El enfoque permite el análisis simultáneo de múltiples EV-miRNAs y miRNAs celulares, sujeto a las capacidades del citómetro. Además, aunque el análisis de citometría de flujo puede proporcionar información valiosa sobre la biología de los miARN de los VE, no está exento de limitaciones. Sin embargo, algunas de las limitaciones pueden superarse cuando se utilizan.......

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL microcentrifuge tubes	Fisher	05-408-129
15 mL Falcon tubes	Corning	352097
6-well clear flat bottom surface treated tissue culture plates	Fisher Scientific	FB012927
ApogeeMix 25 mL, (PS80/110/500 & Si180/240/300/590/880/1300 nm)	Apogee Flow Systems	1527	To set up gating and parameters for particle detection
Attune Nxt Flow Cytometer	ThermoFisher Scientific	N/A	For fluorescence analysis in EVs
BD Fortessa Cell Analyzer	BD Biosciences	N/A	For fluorescence analysis in cells
Cell culture incubator	N/A	N/A	Maintaining temperature of 37 °C and 5% CO2
Cell Culture medium	N/A	N/A	specific for the cell-line of interest
Cell line of interest	N/A	N/A	Any cell line tested and evaluated for EV and cellular abundance of miRNAs on interest.
Cell-miRNA (miRIDIAN microRNA Mimic Red Transfection Control)	Horizon discovery	CP-004500-01-05	miRNAs predetermined to be retained by the cell-line of interest and not selectively exported out into EVs
EV-miRNA (Fluorophore conjugated miRNAs)	Integrated DNA Technologies (IDT)		miRNAs predetermined to be selectively sorted into EVs
Fluorescence microscope	N/A	N/A
Gibco Opti-MEM Reduced Serum Medium	Fisher Scientific	31-985-070
Hausser Scientific Hemocytometer	Fisher	02-671-54
Hyclone 1x PBS (for cell culture)	Fisher	SH30256FS
Lipofectamine RNAimax	Fisher Scientific	13-778-150
miRCURY LNA Reverse Transcriptase	Qiagen	339340
miRCURY LNA SYBR Green PCR	Qiagen	339347
mirVana RNA Isolation	Qiagen	AM1561
Nuclease free water	Fisher Scientific	4387936
Paraformaldehyde, 4% in PBS	Fisher	AAJ61899AK
Reagent reservoir nonsterile	VWR	89094-684
Thermo ABI QuantiStudio DX Real-Time PCR	ThermoFisher Scientific	N/A
Trypsin 0.25%	Fisher	SH3004201
Ultracentrifuge	N/A	N/A