Akış Sitometrisi Kullanarak Hücre Dışı Veziküllere miRNA Salınımının İzlenmesi

Özet

Burada, mikroRNA paketlemesinin dinamiklerini incelemek ve hücre dışı veziküllere (EV'ler) aktarmak için floresan etiketli mikroRNA'ların bolluğunun in vitro değerlendirmesini sağlayan basit bir protokolü açıklıyoruz.

Özet

Hücre dışı veziküller (EV'ler), çeşitli farklı hücreler tarafından salgılanan hücresel iletişimin önemli aracılarıdır. Bu EV'ler, proteinler, lipitler ve nükleik asitler (DNA, mRNA'lar, mikroRNA'lar ve diğer kodlamayan RNA'lar) dahil olmak üzere biyoaktif molekülleri bir hücreden diğerine taşıyarak alıcı hücrelerde fenotipik sonuçlara yol açar. Tüm çeşitli EV kargoları arasında, mikroRNA'lar (miRNA'lar), EV'lerdeki açık düzensizlikleri ve bollukları nedeniyle mikro çevreyi şekillendirmedeki ve alıcı hücreleri eğitmedeki rolleri nedeniyle büyük ilgi görmüştür. Ek veriler, birçok miRNA'nın aktif olarak EV'lere yüklendiğini göstermektedir. Bu açık kanıtlara rağmen, ihracatın dinamikleri ve miRNA sıralama mekanizmaları üzerine araştırmalar sınırlıdır. Burada, EV-miRNA yüklemesinin dinamiklerini anlamak ve miRNA dışa aktarımında yer alan makineleri tanımlamak için kullanılabilecek EV-miRNA'nın akış sitometrisi analizini kullanan bir protokol sunuyoruz. Bu protokolde, EV'lerde zenginleştirildiği ve donör hücrelerden tükendiği önceden belirlenmiş miRNA'lar bir florofora konjuge edilir ve donör hücrelere transfekte edilir. Floresan etiketli miRNA'lar daha sonra EV'lere yüklenmek ve qRT-PCR kullanılarak hücrelerden tükenmek üzere doğrulanır. Hem bir transfeksiyon kontrolü hem de transfekte edilmiş hücre popülasyonunu geçit yapmak için bir araç olarak, floresan etiketli bir hücresel RNA (hücre tutulan ve EV tükenmiş) dahil edilmiştir. Hem EV-miRNA hem de hücre tutulan miRNA ile transfekte edilen hücreler, 72 saat boyunca floresan sinyaller açısından değerlendirilir. EV-miRNA'lara özgü floresan sinyal yoğunluğu, hücrede tutulan miRNA'ya kıyasla hızla azalır. Bu basit protokolü kullanarak, artık miRNA yüklemesinin dinamikleri değerlendirilebilir ve miRNA'ların EV'lere yüklenmesinden sorumlu çeşitli faktörler belirlenebilir.

Giriş

MikroRNA'lar (miRNA'lar), transkripsiyon sonrası gen regülasyonundaki kritik rolleriyle bilinen, kodlamayan küçük RNA'ların en iyi karakterize edilen alt kümelerinden biridir. Çoğu miRNA'nın ekspresyonu ve biyogenezi, çekirdekteki birincil miRNA'ların (pri-miRNA'lar) transkripsiyonu ile başlayan koordineli bir dizi olayı takip eder. Mikroişlemci kompleksi tarafından öncül-miRNA'lara (pre-miRNA'lar) nükleer işlemeyi takiben, pre-miRNA'lar sitoplazmaya aktarılır ve burada RNase III endonükleaz tarafından daha fazla işleme tabi tutulurlar, 21-23 nükleotid olgun miRNA duplekslerine^{dönüşür 1}. İşlenmiş olgun miRNA'nın ipliklerinden biri, hedef haberc....

Protokol

NOT: Bu tekniği kullanmanın bir ön koşulu olarak, seçici olarak ihraç edilen miRNA'ların tanımlanması ve doğrulanması gereklidir. Farklı hücre hatları, EV'lerine göre sıralanan miRNA kargosuna göre değiştiğinden, ilgilenilen hücre hattının ve ilişkili EV'lerin kullanımdan önce miRNA'lar için değerlendirilmesi önerilir. Ek olarak, lipofektamin bazlı transfeksiyon, protokoldeki kritik adımlardan biridir; Deneyi kurmadan önce transfeksiyon verimliliğinin önceden belirlenmesi önerilir.

1. Kültürde büyüyen hücreler ve floroforla konjuge EV-miRNA ile hücrelerin transfekte edilmesi

1. 200.000 ila 400.000 hücreyi, uygun bir ....

Tartışmalar

Yeni kurulan protokol, EV-miRNA'ların transfeksiyonundan sonra EV'lere miRNA salınımının kinetiğinin yakalanmasını sağlar. Yaklaşım, sitometrenin yeteneklerine bağlı olarak birden fazla EV-miRNA'nın ve hücre-miRNA'nın eşzamanlı analizine izin verir. Ayrıca, akış sitometrisi analizi, EV miRNA biyolojisi hakkında değerli bilgiler sağlayabilirken, sınırsız değildir. Bununla birlikte, daha kapsamlı bir anlayış için diğer tekniklerle birlikte kullanıldığında bazı sınırlamaların üstesi.......

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL microcentrifuge tubes	Fisher	05-408-129
15 mL Falcon tubes	Corning	352097
6-well clear flat bottom surface treated tissue culture plates	Fisher Scientific	FB012927
ApogeeMix 25 mL, (PS80/110/500 & Si180/240/300/590/880/1300 nm)	Apogee Flow Systems	1527	To set up gating and parameters for particle detection
Attune Nxt Flow Cytometer	ThermoFisher Scientific	N/A	For fluorescence analysis in EVs
BD Fortessa Cell Analyzer	BD Biosciences	N/A	For fluorescence analysis in cells
Cell culture incubator	N/A	N/A	Maintaining temperature of 37 °C and 5% CO2
Cell Culture medium	N/A	N/A	specific for the cell-line of interest
Cell line of interest	N/A	N/A	Any cell line tested and evaluated for EV and cellular abundance of miRNAs on interest.
Cell-miRNA (miRIDIAN microRNA Mimic Red Transfection Control)	Horizon discovery	CP-004500-01-05	miRNAs predetermined to be retained by the cell-line of interest and not selectively exported out into EVs
EV-miRNA (Fluorophore conjugated miRNAs)	Integrated DNA Technologies (IDT)		miRNAs predetermined to be selectively sorted into EVs
Fluorescence microscope	N/A	N/A
Gibco Opti-MEM Reduced Serum Medium	Fisher Scientific	31-985-070
Hausser Scientific Hemocytometer	Fisher	02-671-54
Hyclone 1x PBS (for cell culture)	Fisher	SH30256FS
Lipofectamine RNAimax	Fisher Scientific	13-778-150
miRCURY LNA Reverse Transcriptase	Qiagen	339340
miRCURY LNA SYBR Green PCR	Qiagen	339347
mirVana RNA Isolation	Qiagen	AM1561
Nuclease free water	Fisher Scientific	4387936
Paraformaldehyde, 4% in PBS	Fisher	AAJ61899AK
Reagent reservoir nonsterile	VWR	89094-684
Thermo ABI QuantiStudio DX Real-Time PCR	ThermoFisher Scientific	N/A
Trypsin 0.25%	Fisher	SH3004201
Ultracentrifuge	N/A	N/A