유세포 분석을 사용하여 세포외 소포체로의 miRNA 방출 추적

요약

여기서는 형광 표지된 microRNA의 풍부함에 대한 체외 평가를 통해 microRNA 패키징의 역학을 연구하고 세포외 소포체(EV)로 내보낼 수 있는 간단한 프로토콜을 설명합니다.

초록

세포외 소포체(EV)는 다양한 세포에서 분비되는 세포 통신의 중요한 매개체입니다. 이러한 EV는 단백질, 지질 및 핵산(DNA, mRNA, microRNA 및 기타 비암호화 RNA)을 포함한 생체 활성 분자를 한 세포에서 다른 세포로 셔틀하여 수용 세포에서 표현형 결과를 초래합니다. 다양한 EV 화물 중에서 microRNA(miRNA)는 EV의 명확한 조절 장애와 풍부함으로 인해 미세 환경을 형성하고 수용 세포를 교육하는 역할로 많은 주목을 받았습니다. 추가 데이터는 많은 miRNA가 EV에 활발하게 로드된다는 것을 나타냅니다. 이러한 명백한 증거에도 불구하고, miRNA 분류의 역학 및 메커니즘에 대한 연구는 제한적입니다. 여기서는 EV-miRNA 로딩의 역학을 이해하고 miRNA 내보내기와 관련된 메커니즘을 식별하는 데 사용할 수 있는 EV-miRNA의 유세포 분석을 사용하는 프로토콜을 제공합니다. 이 프로토콜에서는 EV에서 농축되고 공여체 세포에서 고갈되도록 미리 결정된 miRNA를 형광단에 접합하고 공여체 세포로 transfection합니다. 그런 다음 형광 태그가 부착된 miRNA는 qRT-PCR을 사용하여 EV에 로딩되고 세포에서 고갈되는지 확인합니다. transfection control 및 transfection된 세포 집단을 게이팅하기 위한 도구로서, 형광 표지된 세포 RNA(세포 보유 및 EV 고갈)가 포함되어 있습니다. EV-miRNA 및 cell-retained-miRNA로 transfection된 세포는 72시간 동안 형광 신호에 대해 평가됩니다. EV-miRNA에 특이적인 형광 신호 강도는 세포 보유 miRNA에 비해 빠르게 감소합니다. 이 간단한 프로토콜을 사용하여 이제 miRNA 로딩의 역학을 평가하고 miRNA를 EV에 로딩하는 다양한 요인을 식별할 수 있습니다.

서문

MicroRNA(miRNA)는 전사 후 유전자 조절에 중요한 역할을 하는 것으로 알려진 작은 비암호화 RNA의 가장 특징적인 하위 집합 중 하나입니다. 대부분의 miRNA의 발현과 생물발생은 핵에서 일차 miRNA(pri-miRNA)의 전사로 시작되는 일련의 조정된 사건을 따릅니다. 마이크로프로세서 복합체에 의해 precursor-miRNA(pre-miRNA)로 핵 처리된 후, pre-miRNA는 세포질로 내보내지고, 여기서 RNase III 엔도뉴클레아제에 의해 추가 처리를 거쳐 21-23개의 뉴클레오티드 성숙 miRNA 듀플렉스로 다이서됩니다¹. 처리된 성숙한 miRNA의 가닥 중 하나가 표적 메신저 RNA(mRNA)에 결합하여 표적의 분해 또는 번역 억제를 유도합니다². 여러 다양한 표적 mRNA를 동시에 조절하는 miRNA의 다원성 역할에 기초하여 miRNA 발현이 엄격하게 조절되는 것은 놀라운 일이 아닙니다³. 실제로, 부적절한 표현은 다양한 질병 상태, 특히 암의 원인이 됩니다. miRNA의 비정상적인 발현은 질병 특이적 시그니처를 나타낼 뿐만 아니라 예후 및 치료 잠재력의 표적으로 부상했습니다 ^4,5,....

프로토콜

참고: 이 기술을 사용하기 위한 전제 조건으로, 선택적으로 내보낸 miRNA의 식별 및 검증이 필요합니다. EV로 분류된 miRNA 화물에 따라 세포주가 다르기 때문에 사용 전에 관심 세포주 및 관련 EV에서 miRNA를 평가하는 것이 좋습니다. 또한 리포펙타민 기반 transfection은 프로토콜의 중요한 단계 중 하나입니다. 실험을 설정하기 전에 transfection 효율을 미리 결정하는 것이 좋습니다.

1. 형광단 접합 EV-miRNA를 이용한 배양 및 transfecting 세포에서 세포 성장

1. 200,000 내지 400,000 세포를 적절한 배양 배지에서 6-웰 플레이트의 삼중 웰에 플레이트한다. 균일한 세포 분포를 보장하기 위해 플레이트를 부드럽게 휘젓습니다. 세포가 70%-80% 밀도에 도달할 때까지 약 24-48시간 동안 배양합니다.
2. transfection할 각 웰에 대해 제조업체의 지침에 따라 microcentrifuge 튜브에 있는 100μL의 무혈청 배지에 transfection 시약을 희석합니다.
   참고: 이 설정 전에 관심 세포주에 대한 최적의 지질 농도를 결정해야 합니다.
3. transfection할 각 웰에 대해 형광단 접합 EV-....

토론

새로 확립된 프로토콜은 EV-miRNA의 transfection 후 EV로 miRNA 방출의 역학을 캡처할 수 있습니다. 이 접근법을 사용하면 세포분석기의 기능에 따라 여러 EV-miRNA 및 cell-miRNA를 동시에 분석할 수 있습니다. 또한 유세포 분석 분석은 EV miRNA 생물학에 대한 귀중한 통찰력을 제공할 수 있지만 한계가 없는 것은 아닙니다. 그러나 보다 포괄적인 이해를 위해 다른 기술과 함께 사용할 때 일부 제한 사항을 극복할.......

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL microcentrifuge tubes	Fisher	05-408-129
15 mL Falcon tubes	Corning	352097
6-well clear flat bottom surface treated tissue culture plates	Fisher Scientific	FB012927
ApogeeMix 25 mL, (PS80/110/500 & Si180/240/300/590/880/1300 nm)	Apogee Flow Systems	1527	To set up gating and parameters for particle detection
Attune Nxt Flow Cytometer	ThermoFisher Scientific	N/A	For fluorescence analysis in EVs
BD Fortessa Cell Analyzer	BD Biosciences	N/A	For fluorescence analysis in cells
Cell culture incubator	N/A	N/A	Maintaining temperature of 37 °C and 5% CO2
Cell Culture medium	N/A	N/A	specific for the cell-line of interest
Cell line of interest	N/A	N/A	Any cell line tested and evaluated for EV and cellular abundance of miRNAs on interest.
Cell-miRNA (miRIDIAN microRNA Mimic Red Transfection Control)	Horizon discovery	CP-004500-01-05	miRNAs predetermined to be retained by the cell-line of interest and not selectively exported out into EVs
EV-miRNA (Fluorophore conjugated miRNAs)	Integrated DNA Technologies (IDT)		miRNAs predetermined to be selectively sorted into EVs
Fluorescence microscope	N/A	N/A
Gibco Opti-MEM Reduced Serum Medium	Fisher Scientific	31-985-070
Hausser Scientific Hemocytometer	Fisher	02-671-54
Hyclone 1x PBS (for cell culture)	Fisher	SH30256FS
Lipofectamine RNAimax	Fisher Scientific	13-778-150
miRCURY LNA Reverse Transcriptase	Qiagen	339340
miRCURY LNA SYBR Green PCR	Qiagen	339347
mirVana RNA Isolation	Qiagen	AM1561
Nuclease free water	Fisher Scientific	4387936
Paraformaldehyde, 4% in PBS	Fisher	AAJ61899AK
Reagent reservoir nonsterile	VWR	89094-684
Thermo ABI QuantiStudio DX Real-Time PCR	ThermoFisher Scientific	N/A
Trypsin 0.25%	Fisher	SH3004201
Ultracentrifuge	N/A	N/A