Suivi de la libération de miARN dans les vésicules extracellulaires à l’aide de la cytométrie en flux

Résumé

Nous décrivons ici un protocole simple qui permet d’évaluer in vitro l’abondance des microARN marqués par fluorescence afin d’étudier la dynamique de l’emballage et de l’exportation des microARN dans les vésicules extracellulaires (VE).

Résumé

Les vésicules extracellulaires (VE) sont d’importants médiateurs de la communication cellulaire qui sont sécrétés par une variété de cellules différentes. Ces VE transportent des molécules bioactives, notamment des protéines, des lipides et des acides nucléiques (ADN, ARNm, microARN et autres ARN non codants), d’une cellule à l’autre, entraînant des conséquences phénotypiques dans les cellules réceptrices. De toutes les cargaisons de véhicules électriques, les microARN (miARN) ont attiré beaucoup d’attention pour leur rôle dans la formation du microenvironnement et dans l’éducation des cellules réceptrices en raison de leur dérégulation évidente et de leur abondance dans les véhicules électriques. Des données supplémentaires indiquent que de nombreux miARN sont activement chargés dans les VE. Malgré ces preuves évidentes, les recherches sur la dynamique de l’exportation et les mécanismes de tri des miARN sont limitées. Ici, nous fournissons un protocole utilisant l’analyse par cytométrie en flux de l’EV-miARN qui peut être utilisé pour comprendre la dynamique de la charge EV-miARN et identifier la machinerie impliquée dans l’exportation des miARN. Dans ce protocole, les miARN prédéterminés à être enrichis en VE et appauvris à partir des cellules du donneur sont conjugués à un fluorophore et transfectés dans les cellules du donneur. Les miARN marqués par fluorescence sont ensuite vérifiés pour leur chargement dans les VE et leur épuisement des cellules à l’aide de la qRT-PCR. En tant qu’outil de contrôle de la transfection et d’identification de la population de cellules transfectées, un ARN cellulaire marqué par fluorescence (conservé par cellule et appauvri en EV) est inclus. Les cellules transfectées à la fois avec le miARN EV et le miARN retenu par la cellule sont évaluées pour les signaux fluorescents sur une période de 72 h. L’intensité du signal de fluorescence spécifique des miARN EV diminue rapidement par rapport aux miARN retenus par les cellules. À l’aide de ce protocole simple, il est maintenant possible d’évaluer la dynamique de la charge des miARN et d’identifier divers facteurs responsables de la charge des miARN dans les VE.

Introduction

Les microARN (miARN) sont l’un des sous-ensembles de petits ARN non codants les mieux caractérisés, connus pour leur rôle essentiel dans la régulation des gènes post-transcriptionnels. L’expression et la biogenèse de la plupart des miARN suivent une série coordonnée d’événements qui commence par la transcription des miARN primaires (pri-miARN) dans le noyau. Après le traitement nucléaire par le complexe de microprocesseurs en précurseurs-miARN (pré-miARN), les pré-miARN sont exportés vers le cytoplasme, où ils subissent un traitement ultérieur par l’endonucléase RNase III, en 21-23 duplex de miARN matures nucléotidiques¹. L’un des brins du miAR....

Protocole

NOTE : L’identification et la validation des miARN exportés de manière sélective sont nécessaires pour être préalables à l’utilisation de cette technique. Étant donné que les différentes lignées cellulaires varient en fonction de la cargaison de miARN triée dans leurs VE, il est recommandé d’évaluer la lignée cellulaire d’intérêt et les VE associées pour les miARN avant utilisation. De plus, la transfection à base de lipofectamine est l’une des étapes critiques du protocole ; Il est recommandé de prédéterminer l’efficacité de la transfection avant de mettre en place l’expérience.

1. Cultiver des cellules en culture et transfecter des ....

Discussion

Le protocole nouvellement établi permet de capturer la cinétique de la libération des miARN dans les VE après la transfection des miARN EV. L’approche permet l’analyse simultanée de plusieurs miARN EV et miARN cellulaires, sous réserve des capacités du cytomètre. De plus, bien que l’analyse par cytométrie en flux puisse fournir des informations précieuses sur la biologie des miARN EV, elle n’est pas sans limites. Bien que certaines des limitations puissent être surmontées lorsqu’elles sont utilisée.......

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL microcentrifuge tubes	Fisher	05-408-129
15 mL Falcon tubes	Corning	352097
6-well clear flat bottom surface treated tissue culture plates	Fisher Scientific	FB012927
ApogeeMix 25 mL, (PS80/110/500 & Si180/240/300/590/880/1300 nm)	Apogee Flow Systems	1527	To set up gating and parameters for particle detection
Attune Nxt Flow Cytometer	ThermoFisher Scientific	N/A	For fluorescence analysis in EVs
BD Fortessa Cell Analyzer	BD Biosciences	N/A	For fluorescence analysis in cells
Cell culture incubator	N/A	N/A	Maintaining temperature of 37 °C and 5% CO2
Cell Culture medium	N/A	N/A	specific for the cell-line of interest
Cell line of interest	N/A	N/A	Any cell line tested and evaluated for EV and cellular abundance of miRNAs on interest.
Cell-miRNA (miRIDIAN microRNA Mimic Red Transfection Control)	Horizon discovery	CP-004500-01-05	miRNAs predetermined to be retained by the cell-line of interest and not selectively exported out into EVs
EV-miRNA (Fluorophore conjugated miRNAs)	Integrated DNA Technologies (IDT)		miRNAs predetermined to be selectively sorted into EVs
Fluorescence microscope	N/A	N/A
Gibco Opti-MEM Reduced Serum Medium	Fisher Scientific	31-985-070
Hausser Scientific Hemocytometer	Fisher	02-671-54
Hyclone 1x PBS (for cell culture)	Fisher	SH30256FS
Lipofectamine RNAimax	Fisher Scientific	13-778-150
miRCURY LNA Reverse Transcriptase	Qiagen	339340
miRCURY LNA SYBR Green PCR	Qiagen	339347
mirVana RNA Isolation	Qiagen	AM1561
Nuclease free water	Fisher Scientific	4387936
Paraformaldehyde, 4% in PBS	Fisher	AAJ61899AK
Reagent reservoir nonsterile	VWR	89094-684
Thermo ABI QuantiStudio DX Real-Time PCR	ThermoFisher Scientific	N/A
Trypsin 0.25%	Fisher	SH3004201
Ultracentrifuge	N/A	N/A