Suivi de la libération de miARN dans les vésicules extracellulaires à l’aide de la cytométrie en flux

Résumé

Nous décrivons ici un protocole simple qui permet d’évaluer in vitro l’abondance des microARN marqués par fluorescence afin d’étudier la dynamique de l’emballage et de l’exportation des microARN dans les vésicules extracellulaires (VE).

Résumé

Les vésicules extracellulaires (VE) sont d’importants médiateurs de la communication cellulaire qui sont sécrétés par une variété de cellules différentes. Ces VE transportent des molécules bioactives, notamment des protéines, des lipides et des acides nucléiques (ADN, ARNm, microARN et autres ARN non codants), d’une cellule à l’autre, entraînant des conséquences phénotypiques dans les cellules réceptrices. De toutes les cargaisons de véhicules électriques, les microARN (miARN) ont attiré beaucoup d’attention pour leur rôle dans la formation du microenvironnement et dans l’éducation des cellules réceptrices en raison de leur dérégulation évidente et de leur abondance dans les véhicules électriques. Des données supplémentaires indiquent que de nombreux miARN sont activement chargés dans les VE. Malgré ces preuves évidentes, les recherches sur la dynamique de l’exportation et les mécanismes de tri des miARN sont limitées. Ici, nous fournissons un protocole utilisant l’analyse par cytométrie en flux de l’EV-miARN qui peut être utilisé pour comprendre la dynamique de la charge EV-miARN et identifier la machinerie impliquée dans l’exportation des miARN. Dans ce protocole, les miARN prédéterminés à être enrichis en VE et appauvris à partir des cellules du donneur sont conjugués à un fluorophore et transfectés dans les cellules du donneur. Les miARN marqués par fluorescence sont ensuite vérifiés pour leur chargement dans les VE et leur épuisement des cellules à l’aide de la qRT-PCR. En tant qu’outil de contrôle de la transfection et d’identification de la population de cellules transfectées, un ARN cellulaire marqué par fluorescence (conservé par cellule et appauvri en EV) est inclus. Les cellules transfectées à la fois avec le miARN EV et le miARN retenu par la cellule sont évaluées pour les signaux fluorescents sur une période de 72 h. L’intensité du signal de fluorescence spécifique des miARN EV diminue rapidement par rapport aux miARN retenus par les cellules. À l’aide de ce protocole simple, il est maintenant possible d’évaluer la dynamique de la charge des miARN et d’identifier divers facteurs responsables de la charge des miARN dans les VE.

Introduction

Les microARN (miARN) sont l’un des sous-ensembles de petits ARN non codants les mieux caractérisés, connus pour leur rôle essentiel dans la régulation des gènes post-transcriptionnels. L’expression et la biogenèse de la plupart des miARN suivent une série coordonnée d’événements qui commence par la transcription des miARN primaires (pri-miARN) dans le noyau. Après le traitement nucléaire par le complexe de microprocesseurs en précurseurs-miARN (pré-miARN), les pré-miARN sont exportés vers le cytoplasme, où ils subissent un traitement ultérieur par l’endonucléase RNase III, en 21-23 duplex de miARN matures nucléotidiques¹. L’un des brins du miARN mature traité se lie aux ARN messagers cibles (ARNm), conduisant à la dégradation ou à la répression traductionnelle des cibles². Sur la base du rôle pléiotrope des miARN dans la régulation simultanée de plusieurs ARNm cibles diverses, il n’est pas surprenant que l’expression des miARN soit étroitement régulée³. En effet, une expression inappropriée contribue à divers états pathologiques, en particulier dans le cancer. L’expression aberrante des miARN représente non seulement une signature spécifique à la maladie, mais est également apparue comme une cible pour le potentiel pronostique et thérapeutique ^4,5,6. En plus de leurs rôles intracellulaires, les miARN ont également des rôles non autonomes. Par exemple, les miARN peuvent être emballés sélectivement dans des VE par des cellules donneuses et exportés vers des sites receveurs où ils suscitent diverses réponses phénotypiques dans la physiologie normale et pathologique ^7,8,9.

Malgré des preuves évidentes que les miARN associés aux VE sont des biomolécules fonctionnelles, on ne comprend pas complètement comment des sous-ensembles spécifiques de miARN sont dérégulés dans des états pathologiques tels que le cancer et comment la machinerie cellulaire sélectionne et trie les miARN en Evs^10,11. Compte tenu du rôle potentiel des microARN EV dans la modulation du microenvironnement, il est essentiel d’identifier les mécanismes impliqués dans l’exportation de certains miARN afin d’élucider pleinement le rôle des VE dans la communication intercellulaire et la pathogenèse de la maladie. Comprendre le processus de libération des miARN dans les VE permettra non seulement de mettre en évidence les médiateurs importants de l’exportation des miARN, mais aussi de fournir des informations sur les thérapies potentielles. Pour atteindre ce niveau de connaissance, il est nécessaire d’adapter les outils pour répondre fidèlement à ces nouvelles questions expérimentales. En effet, les études qui évaluent les VE connaissent une croissance exponentielle en raison de l’introduction de nouvelles techniques et de nouveaux contrôles^12,13. En ce qui concerne l’évaluation de l’abondance des miARN exportés dans les VE, le séquençage de nouvelle génération et la réaction en chaîne par polymérase à transcription inverse quantitative (qRT-PCR) sont les outils standard actuels. Bien que ces outils soient utiles pour évaluer l’abondance des miARN dans les VE, leur sensibilité et leur spécificité sont limitées, et l’utilisation de ces approches statiques pour évaluer la dynamique est insuffisante. La délimitation de la dynamique de l’exportation des miARN dans les VE nécessite une combinaison d’outils spécialisés. Nous présentons ici un protocole complet utilisant des miARN conjugués par fluorescence, afin d’analyser la dynamique de la libération des miARN à partir des cellules donneuses et de leur incorporation dans les VE. Nous discutons également des avantages et des limites de la méthode et fournissons des recommandations pour une utilisation optimale. La méthode polyvalente présentée dans cet article sera utile aux chercheurs intéressés par l’étude de la libération de miARN dans les VE et de leurs rôles potentiels dans la communication cellulaire et les maladies.

Protocole

NOTE : L’identification et la validation des miARN exportés de manière sélective sont nécessaires pour être préalables à l’utilisation de cette technique. Étant donné que les différentes lignées cellulaires varient en fonction de la cargaison de miARN triée dans leurs VE, il est recommandé d’évaluer la lignée cellulaire d’intérêt et les VE associées pour les miARN avant utilisation. De plus, la transfection à base de lipofectamine est l’une des étapes critiques du protocole ; Il est recommandé de prédéterminer l’efficacité de la transfection avant de mettre en place l’expérience.

1. Cultiver des cellules en culture et transfecter des cellules avec des miARN EV conjugués aux fluorophores

1. Plaquer 200 000 à 400 000 cellules dans des puits triplés dans une plaque à 6 puits dans un milieu de culture approprié. Faites tourner doucement la plaque pour assurer une distribution uniforme des cellules. Incuber les cellules jusqu’à ce qu’elles atteignent 70 à 80 % de confluence, environ 24 à 48 h.
2. Pour chaque puits à transfecter, diluer le réactif de transfection dans 100 μL de milieu sans sérum dans un tube de microcentrifugation selon les instructions du fabricant.
   REMARQUE : La concentration optimale de lipides doit être déterminée pour la lignée cellulaire d’intérêt avant cette configuration.
3. Pour chaque puits à transfecter, diluer séparément le miARN EV conjugué au fluorophore (2 nM) et le miARN cellulaire (2 nM) dans un tube de microcentrifugation dans 100 μL de milieu sans sérum.
   NOTA : Le volume total doit être calculé pour le nombre total de puits transfectés. Dans ce protocole, la fluorescence a été évaluée à 7 points temporels ; par conséquent, le volume total était de 700 μL pour l’étape 1.2 et de 700 μL pour l’étape 1.3. De plus, pour capturer en toute confiance la population de cellules fluorescentes positives, l’utilisateur doit transfecter les cellules avec un miARN brouillé non fluorescent et mettre en place une porte excluant ces cellules.
4. Ajouter le mélange d’ARN dilué (à partir de l’étape 1.3) au réactif de transfection dilué (à partir de l’étape 1.2) et mélanger doucement en retournant le tube 3 à 4 fois. Laissez incuber le mélange combiné lipide-ARN pendant 30 minutes à température ambiante (RT).
5. Retirez le milieu de culture ordinaire des cellules et ajoutez 800 μL de milieu sans sérum dans chaque puits. Ajouter délicatement 200 μL du mélange lipide-ARN (à partir de l’étape 1.4) goutte à goutte dans les cellules.
   REMARQUE : Le milieu Opti-MEM a été utilisé pour la transfection de la lignée cellulaire d’intérêt (cellules Calu6). Essayez d’ajouter le mélange lipide-ARN directement dans le milieu de culture, en évitant d’ajouter le mélange sur les côtés de la plaque.

2. Récolte de cellules transfectées à différents moments pour l’analyse de la fluorescence

1. Incuber les cellules transfectées à 37 °C pendant 7 h.
   REMARQUE : Pour valider la transfection cohérente des deux miARN (microARN EV et miARN cellulaire), les cellules sont prélevées dans un puits 3 h après la transfection pour analyser la fluorescence à l’aide du cytomètre en flux.
2. Après la période d’incubation de 7 h, retirer le complexe de transfection des puits et le remplacer par un milieu complet.
3. Pour évaluer le point de temps de 7 heures, récoltez les cellules et lavez-les trois fois avec 1x PBS.
   1. Si vous travaillez avec des cellules adhérentes, ajoutez 200 μL de trypsine dans un puits et attendez que les cellules se détachent de la plaque. Transférez les cellules détachées dans un tube de microcentrifugation et une pastille par centrifugation à 200xg pendant 5 min.
   2. Jetez le surnageant avec précaution pour éviter de perturber la pastille cellulaire. Pour le premier lavage PBS, remettez le granulé en suspension dans ~500 μL de 1x PBS et répétez la granulation en utilisant les étapes de centrifugation ci-dessus. Répétez le lavage PBS deux fois de plus.
   3. Remettre la pastille cellulaire en suspension dans 200 μL de solution de paraformaldéhyde (PFA) à 2 % et évaluer la fluorescence.
      REMARQUE : Après avoir ajouté 2% de PFA, la pastille cellulaire peut être stockée à 4 °C pendant 3-4 jours.
4. Récoltez les points temporels restants en suivant les étapes de la section 2.3. Récupérez tous les granulés cellulaires stockés et suivez les étapes de la section 3.

3. Analyse par cytométrie en flux du signal de miARN cellulaire et de miARN EV dans les cellules

1. Préparer les cellules pour l’analyse par cytométrie en flux. Filtrer la suspension cellulaire de la section 2 à travers les capuchons de crépine de 35 μm qui font partie des tubes FACS en polystyrène à fond rond pour permettre l’élimination des débris et des agrégats cellulaires qui pourraient interférer avec l’analyse des fluorophores.
2. Configurez l’instrument en suivant les instructions d’étalonnage. Allumez le cytomètre en flux et laissez-le se réchauffer pendant au moins 30 minutes avant de l’utiliser. Amorcez le système fluidique avec du liquide de gaine, puis vérifiez et ajustez l’alignement du laser.
3. Exécuter le contrôle de la qualité pour confirmer la fluidique de l’instrument. Chargez de l’eau filtrée ultrapure dans le cytomètre en flux et faites-le fonctionner à un débit approprié pour un temps d’acquisition adéquat.
   REMARQUE : Le débit et le temps d’acquisition appropriés dépendront du type de cellule d’intérêt, de la complexité de l’échantillon et de la qualité des données souhaitées.
4. Ouvrez le logiciel d’analyse des données de cytométrie en flux et confirmez les performances du détecteur et des lasers. Configurez des paramètres de seuil et de tension pour la détection en fonction de la lignée cellulaire d’intérêt et des fluorophores de votre choix.
   REMARQUE : Pour toutes les expériences en aval, des cellules Calu6 ont été utilisées.
   1. Définissez le seuil de capture du signal pour les cellules Calu6 au niveau FSC 5000. Effectuez l’analyse pour 1 x 10⁴ cellules pour chaque répétition expérimentale.
   2. Pour tenir compte du chevauchement spectral entre les différents fluorophores, utilisez des cellules non transfectées et des cellules transfectées indépendamment avec un seul des fluorophores pour mettre en place des contrôles de compensation.
   3. Pour la détection de l’exportation de miARN, utilisez des miARN-EV candidats (miR-451a et miR-150) conjugués à Alexa-fluor 488, et un miARN-miARN de cellule témoin (cel-miR-67) conjugué à Cy3.
   4. Pour chaque miARN EV, conjuguer le fluorophore à l’extrémité 5′ du brin 5p. Avant la transfection, recuire le brin conjugué au fluorophore en son brin 3p 100% complémentaire.
   5. Pour l’analyse de l’expression dans les cellules transfectées, analysez les échantillons à l’aide des canaux FSC, SSC, FITC et PE réglés sur 258, 192, 269 et 423 unités de tension, respectivement (Figure 1A, B).
5. Introduire l’échantillon témoin négatif dans le cytomètre en flux. Capturez les signaux de cellule après avoir défini les intensités de diffusion directe (FSC) et de diffusion latérale (SSC) dans une feuille de calcul personnalisée.
6. Dans le diagramme, choisissez FSC pour l’axe X, SSC pour l’axe Y et gate pour la population d’intérêt en dessinant un polygone autour de celle-ci (voir Figure 1B, panneau inférieur).
7. Créez un nouveau tracé à l’aide de la population fermée.
   1. Réglez l’axe X sur le signal de fluorescence 1 (FS1) pour la détection des miARN cellulaires et l’axe Y sur le signal de fluorescence 2 (FS2) pour la détection des miARN EV. Définissez les paramètres de compensation pour les fluorophores individuels à l’aide de cellules transfectées indépendamment avec chacun des miARN marqués par fluorescence. Dans la nouvelle parcelle, porte sur la population d’intérêt.
   2. Pour la détection des miARN EV, utilisez le canal FITC. Pour l’évaluation du signal cellule-miARN, utilisez le canal PE. Dans le logiciel, créez une porte autour des cellules qui étaient positives pour FITC et PE en dessinant un polygone autour de la population à double fluorescence lorsque FITC a été sélectionné pour l’axe X et PE a été sélectionné pour l’axe Y.
8. Enregistrez les statistiques de la population fermée.
   1. Enregistrez le pourcentage de cellules de la population fermée qui sont positives à la fois pour le FITC et l’EP, ainsi que pour celles qui sont positives pour le FITC ou l’EP.
9. Répétez les étapes ci-dessus pour tous les échantillons ou contrôles supplémentaires de l’expérience.

4. Isoler les VE des cellules transfectées

1. Pour les cellules cultivées dans des milieux contenant du sérum, épuiser les VE du sérum pour éviter la contamination croisée.
   1. Pour générer un sérum appauvri en VE, diluez le sérum à 50 % dans un milieu de culture cellulaire pour réduire la viscosité et centrifugez le sérum à 50 % obtenu à 110 000 x g pendant 18 h.
   2. Collectez soigneusement le surnageant (sérum sans EV) et filtrez-le à l’aide d’un ensemble de filtre de 0,2 μm. Utilisez le sérum sans EV à 50 % obtenu pour générer un milieu complet, dans ce cas, RPMI plus 10 % de sérum.
   3. Pour collecter les VE, ajoutez le milieu complet appauvri en VE dans les cellules et collectez les VE 48 h après l’incubation.
      NOTE : Le protocole décrit ci-dessous a été modifié à partir de Kowal et ^al.14.
2. Cultivez des cellules dans des boîtes de culture tissulaire de 15 cm jusqu’à ce qu’elles atteignent 80 % de confluence. Transfecter les cellules séparément avec des miARN cellulaires et des miARN EV dans 10 mL d’Opti-MEM en suivant le protocole de transfection de la section 1 du protocole.
   REMARQUE : Tous les protocoles de transfection ne sont pas mis à l’échelle de manière linéaire. Il peut être essentiel d’adapter et d’évaluer d’abord les conditions de transfection dans des plaques de 15 cm.
3. Après 7 h, aspirez le milieu de transfection et remplacez-le par le milieu appauvri en EV (15 mL). Cultivez des cellules dans le milieu appauvri en VE pendant 48 h.
4. Retirez le milieu conditionné des cellules et distribuez-le dans un tube à centrifuger de 50 ml à l’intérieur de l’enceinte de sécurité biologique. Centrifuger le milieu conditionné à 2000 x g pendant 10 min à 4 °C pour éliminer les cellules mortes et les débris cellulaires. Transférez le surnageant obtenu dans un tube frais.
5. Centrifuger le surnageant à 10 000 x g pendant 40 min à 4 °C. Retirez le surnageant et filtrez-le à l’aide d’un ensemble de filtre de 0,2 μm.
6. Transférez le milieu de culture cellulaire filtré dans un tube d’ultracentrifugation stérile à l’intérieur de l’enceinte de sécurité biologique. Pesez et équilibrez les tubes les uns par rapport aux autres. Faire tourner les échantillons à 110 000 x g pendant 90 min à 4 °C. Jeter le surnageant.
7. Remettre le granulé en suspension dans un volume approprié de 1x PBS pour laver et centrifuger à 110 000 x g pendant 90 min à 4 °C.
   NOTA : La pastille EV a été remise en suspension dans 60 mL de PBS 1x en fonction du volume maximal autorisé pour les tubes de rotor à angle fixe utilisés dans cette étude.
8. Aspirer le PBS et suspendre le plomb EV dans un volume approprié (50-100 μL) de PBS frais 1x et vortex. Conservez les véhicules électriques à -80 °C pour une utilisation ultérieure.

5. Analyse par cytométrie en flux du signal des miARN cellulaires et des miARN EV dans les VE

1. Pour préparer la suspension EV pour l’analyse par cytométrie en flux, diluer les VE dans un volume approprié de PBS 1x ultrafiltré.
   NOTA : Le volume de charge pour l’analyse par cytométrie en flux des VE doit être déterminé en fonction du nombre de VE dans les échantillons. En gros, s’il y a ~30 000 particules dans la suspension EV, le volume final devrait être de ~500-600 μL dans 1x PBS. Un échantillon propre contient environ 35 à 50 particules/μL.
2. Utilisez le nano-cytomètre en flux ou un équipement alternatif suffisamment puissant pour analyser des particules de taille nanométrique.
   REMARQUE : Ici, le cytomètre en flux nano-Attune NxT a été utilisé.
3. Ouvrez le logiciel et configurez l’instrument en suivant les instructions d’étalonnage recommandées. Effectuez le test de performance à l’aide de nanobilles de performance. Si les nanobilles sont détectées dans la gamme de taille standard, les performances sont optimales. Déterminer le débit approprié pour la détection des particules EV.
4. Effectuez un contrôle de la qualité à l’aide d’eau filtrée ultra-pure pour confirmer la fluidique de l’instrument et les performances du détecteur et des lasers.
5. À l’aide de billes d’étalonnage adaptées à l’expérience, réglez le cytomètre en flux pour détecter avec précision les billes de différentes tailles et mesurer les signaux de fluorescence.
   REMARQUE : Pour la configuration de l’analyse EV par cytométrie en flux, des billes ApogeeMix ont été utilisées. Ces billes contiennent un mélange de billes de silice non fluorescentes et de billes de polystyrène fluorescent dont la taille varie de 80 nm à 1300 nm.
   1. Configurer les paramètres pour évaluer la sensibilité et la résolution des différentes populations dans le mélange de billes selon le protocole du fabricant. Utilisez le déclenchement approprié pour résoudre la population de billes à partir du bruit de l’instrument.
6. Effectuez un vortex complet sur les échantillons pour répartir uniformément les VE avant de les charger pour analyse.
7. Ouvrez le logiciel d’analyse de données de cytométrie en flux et introduisez le PBS ultra-filtré. Réglez le déclenchement pour les particules EV à l’aide de PBS ultra-filtré tout en vous assurant que le déclenchement correspond à la taille appropriée des particules en fonction des billes à l’étape 5.5.
8. Chargez l’échantillon témoin négatif pour analyser les VE lorsqu’ils passent dans le cytomètre en flux. Capturez les signaux EV tout en traçant le FSC sur l’axe X et le SSC sur l’axe Y.
   REMARQUE : Le seuil de SSC pour la capture des VE a été fixé à 300. Le volume d’acquisition a été fixé à 95 μL sur un total de 145 μL de volume tiré. Le débit a été fixé à 12,5 μL/min. L’analyse a été réalisée avec 1 x 10 particules^{de 6} EV. La population de VE est hétérogène et se traduira par l’isolement de certains débris en même temps que les VE. La détection globale des particules dans le graphique FSC vs SSC met en évidence les particules dans une gamme variée, ce qui est attendu lors de l’utilisation de préparations brutes de VE.
9. Créez un nouveau tracé à l’aide de la population fermée.
   1. Cette fois, choisissez le signal de fluorescence 1 (FS1) pour la détection des miARN cellulaires sur l’axe X et le signal de fluorescence 2 (FS2) pour la détection des miARN EV sur l’axe Y.
   2. Définir les paramètres de compensation pour les fluorophores à l’aide des échantillons EV isolés à partir de cellules transfectées avec un seul miARN. Dans le nouveau graphique, porte sur la population EV d’intérêt.
   3. Pour l’analyse de l’expression des miARN conjugués aux fluorophores dans les VE isolés des cellules transfectées, analysez les échantillons de VE à l’aide des canaux FSC, SSC, BL1 et YL1 réglés sur 370, 370, 400 et 400 unités de tension, respectivement (Figure 2A, B).
   4. Enregistrez les statistiques de la population fermée et visualisez-les à l’aide d’histogrammes et de diagrammes à points.
10. Répétez les étapes ci-dessus pour tous les échantillons ou contrôles supplémentaires de l’expérience.

6. Validation de la libération de miARN dans les VE par qRT-PCR

1. Extrayez l’ARN des VE et des cellules mères à l’aide du kit d’isolement de l’ARN miRVana en suivant les instructions du fabricant.
   REMARQUE : La quantification de l’ARN isolé des VE n’est pas possible car la quantité totale d’ARN isolé des VE ne dépasse généralement pas le seuil de quantité minimale d’une nano-goutte standard. Cela est dû à l’épuisement de l’ARN ribosomique des échantillons EV, qui peut être validé à l’aide du bioanalyseur Agilent. Ainsi, le score d’intégrité pour la quantification de l’ARN-EV n’est généralement pas fiable et n’est pas la représentation réelle de la quantité d’ARN-EV. Par conséquent, pour la quantification qRT-PCR de l’ARN-EV et de l’ARN cellulaire, des volumes égaux d’isolats d’ARN après isolement d’un nombre égal de cellules ont été utilisés. Pour la normalisation de la qRT-PCR, des miARN omniprésents dans plusieurs échantillons, tels que déterminés à partir de données de séquençage de l’ARN acquises précédemment, ont été utilisés.
2. Convertissez l’ARN extrait en ADNc à l’aide d’un kit de transcriptase inverse spécifique pour les petits ARN.
3. Configurez la réaction qRT-PCR à l’aide d’un modèle d’ADNc et d’amorces spécifiques aux miARN en suivant les instructions du fabricant.
   REMARQUE : Pour les expériences de validation, le kit de PCR qRT miRCURY LNA et les amorces correspondantes du fabricant ont été utilisés pour évaluer l’expression des miARN cellulaires et des miARN EV.

Résultats

Ici, nous utilisons la cytométrie en flux comme un outil puissant pour étudier la libération de miARN des cellules dans les VE. À l’aide de ce protocole, l’analyse par cytométrie en flux de cellules transfectées avec des miARN cellulaires et des miARN EV a révélé une diminution séquentielle du signal de fluorescence correspondant au miARN EV, tandis que le signal correspondant au miARN cellulaire était retenu dans les cellules. Pour s’assurer que la conjugaison des fluorophores n’interfère pas avec la...

Discussion

Le protocole nouvellement établi permet de capturer la cinétique de la libération des miARN dans les VE après la transfection des miARN EV. L’approche permet l’analyse simultanée de plusieurs miARN EV et miARN cellulaires, sous réserve des capacités du cytomètre. De plus, bien que l’analyse par cytométrie en flux puisse fournir des informations précieuses sur la biologie des miARN EV, elle n’est pas sans limites. Bien que certaines des limitations puissent être surmontées lorsqu’elles sont utilisée...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL microcentrifuge tubes	Fisher	05-408-129
15 mL Falcon tubes	Corning	352097
6-well clear flat bottom surface treated tissue culture plates	Fisher Scientific	FB012927
ApogeeMix 25 mL, (PS80/110/500 & Si180/240/300/590/880/1300 nm)	Apogee Flow Systems	1527	To set up gating and parameters for particle detection
Attune Nxt Flow Cytometer	ThermoFisher Scientific	N/A	For fluorescence analysis in EVs
BD Fortessa Cell Analyzer	BD Biosciences	N/A	For fluorescence analysis in cells
Cell culture incubator	N/A	N/A	Maintaining temperature of 37 °C and 5% CO2
Cell Culture medium	N/A	N/A	specific for the cell-line of interest
Cell line of interest	N/A	N/A	Any cell line tested and evaluated for EV and cellular abundance of miRNAs on interest.
Cell-miRNA (miRIDIAN microRNA Mimic Red Transfection Control)	Horizon discovery	CP-004500-01-05	miRNAs predetermined to be retained by the cell-line of interest and not selectively exported out into EVs
EV-miRNA (Fluorophore conjugated miRNAs)	Integrated DNA Technologies (IDT)		miRNAs predetermined to be selectively sorted into EVs
Fluorescence microscope	N/A	N/A
Gibco Opti-MEM Reduced Serum Medium	Fisher Scientific	31-985-070
Hausser Scientific Hemocytometer	Fisher	02-671-54
Hyclone 1x PBS (for cell culture)	Fisher	SH30256FS
Lipofectamine RNAimax	Fisher Scientific	13-778-150
miRCURY LNA Reverse Transcriptase	Qiagen	339340
miRCURY LNA SYBR Green PCR	Qiagen	339347
mirVana RNA Isolation	Qiagen	AM1561
Nuclease free water	Fisher Scientific	4387936
Paraformaldehyde, 4% in PBS	Fisher	AAJ61899AK
Reagent reservoir nonsterile	VWR	89094-684
Thermo ABI QuantiStudio DX Real-Time PCR	ThermoFisher Scientific	N/A
Trypsin 0.25%	Fisher	SH3004201
Ultracentrifuge	N/A	N/A