الحقن داخل القراب للفأر حديث الولادة لتحرير الجينوم وتوصيل الدواء

Summary

يحدد هذا البروتوكول تعليمات خطوة بخطوة لإجراء الحقن داخل القراب في الفئران الوليدية لتحرير الجينات وتوصيل الأدوية.

Abstract

الحقن داخل القراب هو إجراء شائع الاستخدام في كل من عيادات الأطفال والبالغين ، ويعمل كوسيلة فعالة لإدارة الأدوية والعلاجات. من خلال توصيل الأدوية والعلاجات مباشرة إلى السائل النخاعي للجهاز العصبي المركزي ، تحقق هذه الطريقة تركيزات أعلى من الأدوية الموضعية مع تقليل الآثار الجانبية الجهازية مقارنة بالطرق الأخرى مثل الحقن في الوريد أو تحت الجلد أو الحقن العضلي. تمتد أهميته إلى ما هو أبعد من الإعدادات السريرية ، حيث يلعب الحقن داخل القراب دورا حيويا في الدراسات قبل السريرية التي تركز على علاج الاضطرابات العصبية الوراثية في القوارض الكبيرة الأخرى ، بما في ذلك الرئيسيات غير البشرية. ومع ذلك ، على الرغم من تطبيقه على نطاق واسع ، فإن الحقن داخل القراب في الصغار ، وخاصة الجراء حديثي الولادة ، يشكل تحديات تقنية كبيرة بسبب صغر حجمها وطبيعتها الهشة. تتطلب الإدارة الناجحة والموثوقة للحقن داخل القراب في الفئران حديثي الولادة اهتماما دقيقا بالتفاصيل ودراسة متأنية للعوامل المختلفة. وبالتالي ، هناك حاجة ماسة إلى بروتوكول موحد لا يوفر التعليمات فحسب ، بل يسلط الضوء أيضا على الاعتبارات الفنية الرئيسية والممارسات المختبرية الجيدة لضمان الاتساق الإجرائي ، فضلا عن سلامة ورفاهها.

لتلبية هذه الحاجة غير الملباة ، نقدم بروتوكولا مفصلا وشاملا لإجراء الحقن داخل القراب على وجه التحديد في الجراء حديثي الولادة في اليوم الأول بعد الولادة (P1). باتباع التعليمات خطوة بخطوة ، يمكن للباحثين إجراء الحقن داخل القراب بثقة في الجراء حديثي الولادة ، مما يتيح التوصيل الدقيق للأدوية ، و oligos المضادة للحساسية ، والفيروسات لاستبدال الجينات أو العلاجات القائمة على تحرير الجينوم. علاوة على ذلك ، يتم التأكيد على أهمية الالتزام بالممارسات المختبرية الجيدة للحفاظ على رفاهية وضمان نتائج تجريبية موثوقة. يهدف هذا البروتوكول إلى معالجة التحديات التقنية المرتبطة بالحقن داخل القراب في الفئران حديثي الولادة ، مما يسهل في نهاية المطاف التقدم في مجال البحوث الوراثية العصبية التي تهدف إلى تطوير التدخلات العلاجية المحتملة.

Introduction

الحقن داخل القراب (IT) هو إجراء سريري شائع يستخدم لإدارة الأدوية ، وجمع السائل النخاعي ، والحفاظ على الضغط داخل الجمجمة في كل من المرضى الأطفال والبالغين في العيادات^1،2. يعد إعطاء الأدوية عن طريق الحقن داخل القراب طريقة فعالة لزيادة تركيزات الأدوية في الجهاز العصبي المركزي (CNS) مع تقليل التعرض الجهازي. وبالتالي ، فإن هذه الطريقة تعزز الفعالية العلاجية وتقلل من الآثار الجانبية ، خاصة بالنسبة للأدوية الحساسة للحرارة وقصيرة العمر³.

في الدراسات قبل السريرية التي تختبر عقاقير وعلاجات جديدة باستخدام نماذج القوارض ، من الضروري استخدام طريقة موثوقة لإدارة الأدوية توفر دقة أكبر وقابلية استنساخ^{النتائج 4,5}. بالنسبة للدراسات قبل السريرية التي تقيم العلاجات الجديدة للاضطرابات العصبية الوراثية واضطرابات النمو العصبي ، يعد العلاج المبكر أمرا بالغ الأهمية لدراسات إثبات المفهوم الأولية لأنه من المتوقع عادة أن تسفر التدخلات السابقة عن نتائج أكثر ملاءمة^6،7،8.

بالمقارنة مع الحقن التقليدية داخل بطانة الرحم البطينية (ICV) ، فإن حقن تكنولوجيا المعلومات تحمل مخاطر أقل بكثير لأنها تتجنب الحاجة إلى الاختراق المباشر من خلال القشرة الدماغية. هذه الميزة تقلل بشكل كبير من الضرر المحتمل للأنسجة القشرية الإقليمية والأعصاب المحيطة. علاوة على ذلك ، تسمح حقن تكنولوجيا المعلومات بزيادة خمسة أضعاف على الأقل في الحجم القابل للإدارة من الأدوية من خلال حقنة واحدة ، مما يعزز بشكل كبير جدوى الإدارات المتكررة. ومع ذلك ، نظرا لصغر حجم الفئران حديثي الولادة وطبيعتها الهشة ، فإن إجراء الحقن داخل القراب في الجراء حديثي الولادة يمثل تحديا تقنيا ويتطلب تقنيات ومعدات متخصصة ومعالجة دقيقة.

توفر هذه المقالة بروتوكولا مفصلا مع إرشادات خطوة بخطوة لإجراء الحقن داخل القراب في الجراء حديثي الولادة P1. يتم التأكيد هنا على الاعتبارات الرئيسية والممارسات المختبرية الجيدة لضمان اتساق الإدارة وسلامة ورفاهية أثناء الإجراء. باتباع هذا البروتوكول ، يمكن للباحثين إجراء تجارب بثقة بدقة وقابلية للتكرار مع تقليل أي مخاطر محتملة أو إزعاج للحيوانات.

Protocol

كانت الإجراءات والبروتوكولات الموصوفة متوافقة مع المبادئ التوجيهية الموضحة في دليل المعاهد الوطنية للصحة لرعاية واستخدام المختبر. بالإضافة إلى ذلك ، حصلت الإجراءات على موافقة من لجنة رعاية واستخدام في كلية الطب بجامعة ييل. تم استخدام ذكور وإناث الفئران من النوع البري (WT) C57BL / 6J في الدراسة المقدمة. تم الحصول على من مصدر تجاري (انظر جدول المواد).

1. إعداد مساحة العمل

1. قم بإعداد العناصر التالية أولا: ثلج رطب للتخدير بالتبريد ، وقفص فارغ لفصل الجراء عن السد ، ومجهر تشريح ، ومصدر ضوء ، وسطح نظيف لوضع أثناء الحقن ، ومسحات قطنية ، ووسادة تدفئة ، وحقنة 25/10 ميكرولتر ، وإبرة 34 جم / 0.375 بوصة / 12 درجة (انظر جدول المواد).
   ملاحظة: يعد التخدير بالتبريد لجراء الفئران باستخدام الثلج الرطب خطوة اختيارية تهدف إلى تسهيل المناولة وتقليل حركة الجراء وتقليل الانزعاج المحتمل للحيوانات. قد توفر خطوة التخدير بالتبريد هذه أيضا فائدة خفض الضغط داخل الجمجمة وتقليل المضاعفات المرتبطة بالحجم ^9,10.
2. انقل الجراء إلى قفص منفصل بعيدا عن السد أثناء التعامل معهم.
3. وزن كل جرو وتوثيق وزنه.
4. امسح الجزء الخلفي من الماوس باستخدام الشاش والإيثانول. تأكد من المساحة الفقرية أو ، على الأقل ، خط الوسط للقناة الشوكية (التي يجب أن تظهر حمراء في الجراء P1) باستخدام المجهر التشريحي (الفيديو التكميلي 1).

2. إجراء الحقن

1. لتخدير جرو واحد ، ضعه برفق على حاجز مقاوم للماء مثل غلاف اللاتكس أو ورق الألمنيوم في حمام جليدي لمدة 3-5 دقائق. من المهم تجنب ترك على الجليد لفترة طويلة ، لأن القيام بذلك قد يشكل مخاطر محتملة للمضاعفات المرتبطة بانخفاض حرارة الجسم ، بما في ذلك الرجفان البطيني ونقص الأكسجة في الأنسجة والحماض الأيضي.
   ملاحظة: قد تختلف مدة 3-5 دقائق على أساس كل حالة على حدة. قم بتقييم علامات التخدير، مثل عدم الاستجابة لقرصة إصبع القدم، لتحديد المدة المناسبة.
2. أثناء وجود على الجليد ، قم بتحميل المحقنة ب 10 ميكرولتر من تركيبة الدواء ، أو تحضير الفيروس ، أو التحكم في السائل الشوكي الاصطناعي ، إلخ.
   ملاحظة: أثناء مرحلة التعلم ، ضع في اعتبارك خيار حقن نفس الحجم من صبغة Fast Green المختلطة بنسبة 1٪ مع مواد التوصيل (انظر جدول المواد). يمكن أن يساعد ذلك في تصور عملية الحقن والمساعدة في تعلم التقنية وتحسينها. يجب القتل الرحيم للجراء المحقونة بالصبغة الخضراء السريعة أو مواد مماثلة بعد فترة وجيزة من الحقن وفقا للبروتوكول المعتمد ، لأن هذه المواد قد تؤدي إلى تفاعلات التهابية أو آثار جانبية أخرى في.
3. بمجرد تخدير بالكامل ، كما يتضح من انخفاض حركة الجسم أو غيابها ، ضع الجراء برفق تحت المجهر.
4. باستخدام السبابة والإبهام الأيسر، قم بتحسس المساحة الفقرية بعناية على طول خط الوسط، وتقع بين أحزمة الحوض الثنائية (الفيديو التكميلي 1). قم بتدوير قاعدة الذيل برفق قليلا للمساعدة في تحديد خط الوسط للعمود الفقري.
5. ضبط شطبة الإبرة نحو رأس قبل الحقن.
6. أدخل الإبرة بعناية ، وقم بإمالتها قليلا إلى زاوية 70 درجة -80 درجة عند النقطة التي تتقاطع فيها المسافة البادئة ، مع التأكد من بقاء المحقنة محاذاة مع المستوى السهمي المركزي. عندما تتلامس الإبرة مع العظم ، قم بتقليل الزاوية تدريجيا إلى حوالي 30 درجة ، ثم ادفع الإبرة حوالي 2 مم في الفضاء الفقري.
   ملاحظة: قدرة الإبرة على رفع الجسم بالكامل قليلا هي علامة على الدخول الناجح إلى الفضاء داخل الجافية.
7. حقن ببطء ما يصل إلى 10 ميكرولتر حجم في غضون 50-60 ثانية. حافظ على الإبرة في مكانها لمدة 10-20 ثانية بعد اكتمال الولادة. اسحب الإبرة بتدوير لطيف لتجنب التسرب.
   ملاحظة: سيتحول المخيخ إلى اللون الأخضر قبل سحب الإبرة. أيضا ، يعد الدفع البطيء أمرا بالغ الأهمية لمنع زيادة الضغط داخل الجمجمة المرتبط بالولادة وتقليل المضاعفات المحتملة. بناء على خبرتنا مع الحقن في أكثر من 500 جرو ، فإن تقديم حجم 10 ميكرولتر يزيد عن 50-60 ثانية هو الأمثل.

3. بعد الحقن

1. ضع قطعة قطن على موقع الحقن إذا كان هناك أي تسرب أو دم.
   ملاحظة: لا ينبغي أن يكون هناك أي في معظم الحالات. من تجربتنا ، لا تزال الجراء المعالجة بآثار تسرب أو دم قابلة للاستخدام ، ولكن قد يكون من الضروري النظر في جرعة مخفضة من الأدوية أو العلاجات أثناء تحليل البيانات.
2. ضع الجرو على وسادة تدفئة واترك 10-15 دقيقة حتى تتعافى الجراء تماما وتعيد التدفئة. راقب الجراء بعناية للتأكد من أنهم في حالة تأهب ويتحركون بنشاط قبل إعادتهم إلى قفصهم المنزلي. يشار إلى الانتعاش الكافي للماوس من خلال استعادة لون البشرة الوردي ، وزيادة حركة الجسم التلقائية ، وردود الفعل المستجيبة للمس.
3. ضع الجرو مرة أخرى في قفص المنزل وتأكد من تغطية الجرو بشكل صحيح بالفراش أو نستله أو كليهما. هذا يضمن أن الجرو يتلقى رعاية الأم اللازمة من السد.
4. تقييم المظهر العام والنشاط يوميا لمدة 3 أيام على الأقل بعد الحقن. قد يؤدي ظهور المرض وانخفاض النشاط إلى زيادة احتمال الإصابة بالعدوى أو الآثار الجانبية المرتبطة بالعلاج أو المضاعفات الأخرى ، إلخ. إذا لزم الأمر ، استشر الرعاية البيطرية.

النتائج

أدى الحقن الناجح داخل القراب على الفور إلى توزيع واسع النطاق للمحلول الذي يتم إعطاؤه ، على الرغم من أن الاختراق الخلوي الفعلي يعتمد على طبيعة الأدوية والمواد التي يتم تسليمها. في هذه الدراسة ، استخدمنا Fast Green لتصور النتائج الفورية بعد الحقن داخل القراب (IT) في حديثي الولادة من النوع البري (

Discussion

الموصوف هو إجراء خطوة بخطوة للحقن داخل القراب في الفئران حديثي الولادة (P1) ، مما يؤدي إلى توزيع الأدوية على نطاق واسع في أدمغتهم. بالمقارنة مع طريقة الحقن داخل المخ البطيني الشائعة لتوصيل الدواء إلى الفئران حديثي الولادة ، والتي تتضمن ثقب القشرة الدماغية¹¹ ، فإن الحقن داخل الق?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Balance	Ohaus Corporation	30253017
C57BL/6J mice	The Jackson Laboratory	000664
Digital Microscope	RWD	DOM-1001
DPBS	ThermoFisher	14190144
Fast Green	Sigma	F7252-5G
Heating pad	RWD	69020
Needles	Hamilton	6PK (34/0.375”/4/12DEG)S
Syringe	Hamilton	1702RN
Syringe Filters	Sigma	SLGVM33RS