Intrathekale Injektion von neugeborenen Mäusen zur Genomeditierung und Medikamentenverabreichung

Zusammenfassung

Das vorliegende Protokoll beschreibt Schritt-für-Schritt-Anweisungen für die Durchführung intrathekaler Injektionen bei neugeborenen Mäusen zur Geneditierung und Medikamentenabgabe.

Zusammenfassung

Die intrathekale Injektion ist ein häufig eingesetztes Verfahren sowohl in Kinder- als auch in Erwachsenenkliniken und dient als wirksames Mittel zur Verabreichung von Medikamenten und Behandlungen. Durch die direkte Abgabe von Medikamenten und Behandlungen in die Zerebrospinalflüssigkeit des Zentralnervensystems werden mit dieser Methode höhere lokalisierte Arzneimittelkonzentrationen erreicht und gleichzeitig systemische Nebenwirkungen im Vergleich zu anderen Wegen wie intravenösen, subkutanen oder intramuskulären Injektionen reduziert. Ihre Bedeutung geht über das klinische Umfeld hinaus, da die intrathekale Injektion eine wichtige Rolle in präklinischen Studien spielt, die sich auf die Behandlung neurogenetischer Störungen bei Nagetieren und anderen Großtieren, einschließlich nichtmenschlicher Primaten, konzentrieren. Trotz ihrer weit verbreiteten Anwendung stellt die intrathekale Injektion bei jungen, insbesondere neugeborenen Welpen, aufgrund ihrer geringen Größe und Zerbrechlichkeit erhebliche technische Herausforderungen dar. Die erfolgreiche und zuverlässige Verabreichung von intrathekalen Injektionen bei neugeborenen Mäusen erfordert akribische Liebe zum Detail und sorgfältige Berücksichtigung verschiedener Faktoren. Daher besteht ein entscheidender Bedarf an einem standardisierten Protokoll, das nicht nur Anweisungen enthält, sondern auch wichtige technische Überlegungen und gute Laborpraktiken hervorhebt, um die Verfahrenskonsistenz sowie die Sicherheit und das Wohlergehen der Tiere zu gewährleisten.

Um diesen ungedeckten Bedarf zu decken, präsentieren wir ein detailliertes und umfassendes Protokoll für die Durchführung intrathekaler Injektionen speziell bei neugeborenen Welpen am postnatalen Tag 1 (P1). Durch Befolgen der Schritt-für-Schritt-Anleitung können Forscher sicher intrathekale Injektionen bei neugeborenen Welpen durchführen, was die genaue Verabreichung von Medikamenten, Antisense-Oligos und Viren für Genersatz- oder Genom-Editing-basierte Behandlungen ermöglicht. Darüber hinaus wird die Bedeutung der Einhaltung guter Laborpraktiken betont, um das Wohlergehen der Tiere zu erhalten und zuverlässige Versuchsergebnisse zu gewährleisten. Dieses Protokoll zielt darauf ab, die technischen Herausforderungen im Zusammenhang mit intrathekalen Injektionen bei neugeborenen Mäusen anzugehen und letztendlich Fortschritte auf dem Gebiet der neurogenetischen Forschung zu ermöglichen, die darauf abzielt, potenzielle therapeutische Interventionen zu entwickeln.

Einleitung

Die intrathekale (IT) Injektion ist ein gängiges klinisches Verfahren zur Verabreichung von Medikamenten, zur Entnahme von Liquor cerebrospinalis und zur Aufrechterhaltung des intrakraniellen Drucks sowohl bei pädiatrischen als auch bei erwachsenen Patienten in Kliniken ^1,2. Die Verabreichung von Medikamenten durch intrathekale Injektion ist ein wirksamer Ansatz zur Erhöhung der Medikamentenkonzentrationen im Zentralnervensystem (ZNS) bei gleichzeitiger Minimierung der systemischen Exposition. Folglich erhöht diese Methode die therapeutische Wirksamkeit und reduziert Nebenwirkungen, insbesondere bei temperaturempfindlichen Medikamenten mit kurzer Halbwertszeit³.

In präklinischen Studien, in denen neue Medikamente und Behandlungen mit Nagetiermodellen getestet werden, ist es unerlässlich, eine zuverlässige Methode der Arzneimittelverabreichung anzuwenden, die eine höhere Präzision und Reproduzierbarkeit der Ergebnisse bietet ^4,5. Für präklinische Studien, in denen neue Behandlungen für neurogenetische und neurologische Entwicklungsstörungen untersucht werden, ist eine frühzeitige Behandlung für erste Proof-of-Concept-Studien von entscheidender Bedeutung, da frühere Interventionen in der Regel zu günstigeren Ergebnissen führen ^6,7,8.

Im Vergleich zu herkömmlichen intrazerebroventrikulären (ICV) Injektionen bergen IT-Injektionen deutlich geringere Risiken, da sie eine direkte Penetration durch die Großhirnrinde überflüssig machen. Dieser Vorteil reduziert die potenzielle Schädigung des regionalen kortikalen Gewebes und der umgebenden Nerven erheblich. Darüber hinaus ermöglichen IT-Injektionen eine mindestens fünffache Erhöhung des verabreichbaren Medikamentenvolumens durch eine einzige Injektion, was die Durchführbarkeit wiederholter Verabreichungen erheblich verbessert. Aufgrund der geringen Größe und Zerbrechlichkeit neugeborener Mäuse ist die Durchführung intrathekaler Injektionen bei neugeborenen Welpen jedoch technisch anspruchsvoll und erfordert spezielle Techniken, Ausrüstung und sorgfältige Handhabung.

Dieser Artikel enthält ein detailliertes Protokoll mit Schritt-für-Schritt-Anweisungen zur Durchführung intrathekaler Injektionen bei P1-Neugeborenen. Die wichtigsten Überlegungen und guten Laborpraktiken werden hier betont, um die Konsistenz der Verabreichung sowie die Sicherheit und das Wohlbefinden der Tiere während des Eingriffs zu gewährleisten. Durch die Befolgung dieses Protokolls können Forscher Experimente mit Präzision und Reproduzierbarkeit durchführen und gleichzeitig potenzielle Risiken oder Beschwerden für die Tiere minimieren.

Protokoll

Die beschriebenen Verfahren und Protokolle entsprachen den Richtlinien des National Institutes of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. Darüber hinaus wurden die Verfahren vom Animal Care and Use Committee der Yale University School of Medicine genehmigt. Für die vorgestellte Studie wurden neugeborene männliche und weibliche Wildtyp-Mäuse (WT) C57BL/6J verwendet. Die Tiere wurden aus einer kommerziellen Quelle bezogen (siehe Materialtabelle).

1. Vorbereitung des Arbeitsbereichs

1. Bereiten Sie zuerst die folgenden Gegenstände vor: nasses Eis für die Kryoanästhesie, einen leeren Käfig, um die Jungtiere vom Muttertier zu trennen, ein Präpariermikroskop, eine Lichtquelle, eine saubere Oberfläche zum Platzieren des Tieres während der Injektion, Wattestäbchen, ein Heizkissen, eine 25/10 μl-Spritze und eine 34 G/ 0,375"/ 12 DEG-Nadel (siehe Materialtabelle).
   HINWEIS: Die Kryo-Anästhesie für Mäusewelpen mit Nasseis ist ein optionaler Schritt, der die Handhabung erleichtern, die Bewegung der Welpen reduzieren und mögliche Tierbeschwerden minimieren soll. Dieser Kryoanästhesieschritt kann auch den Vorteil haben, den intrakraniellen Druck zu senken und volumenbedingte Komplikationen zu reduzieren ^9,10.
2. Bringen Sie die Welpen in einen separaten Käfig weg vom Muttertier, während Sie sie anfassen.
3. Wiegen Sie jeden Welpen und dokumentieren Sie sein Gewicht.
4. Wischen Sie die Rückseite der Maus mit Gaze und Ethanol ab. Bestätigen Sie den Zwischenwirbelraum oder mindestens die Mittellinie des Wirbelkanals (die bei P1-Welpen rot erscheinen sollte) mit dem Präpariermikroskop (Ergänzendes Video 1).

2. Ablauf der Injektion

1. Um einen einzelnen Welpen zu betäuben, legen Sie ihn vorsichtig für 3-5 Minuten auf eine wasserdichte Barriere wie eine Latexhülle oder Aluminiumfolie auf ein Eisbad. Es ist wichtig, das Tier nicht über einen längeren Zeitraum auf dem Eis zu lassen, da dies potenzielle Risiken für hypothermiebedingte Komplikationen wie Kammerflimmern, Gewebehypoxie und metabolische Azidose bergen könnte.
   HINWEIS: Die Dauer von 3-5 Minuten kann von Fall zu Fall variieren. Beurteilen Sie die Anzeichen einer Anästhesie, wie z. B. die Unempfindlichkeit auf ein Zehenklemmen, um die angemessene Dauer zu bestimmen.
2. Während sich das Tier auf dem Eis befindet, laden Sie die Spritze mit 10 μl der Arzneimittelformulierung, des Viruspräparats oder der künstlichen Rückenmarksflüssigkeit usw.
   HINWEIS: Ziehen Sie während der Lernphase die Möglichkeit in Betracht, die gleiche Menge gemischten 1% Fast Green-Farbstoffs mit den Liefermaterialien zu injizieren (siehe Materialtabelle). Dies kann bei der Visualisierung des Injektionsprozesses helfen und beim Erlernen und Verfeinern der Technik helfen. Welpen, denen Fast Green Dye oder ähnliche Materialien injiziert wurden, sollten kurz nach der Injektion gemäß dem genehmigten Protokoll eingeschläfert werden, da diese Materialien bei Tieren zu Entzündungsreaktionen oder anderen Nebenwirkungen führen können.
3. Sobald das Tier vollständig betäubt ist, was durch reduzierte oder fehlende Körperbewegungen bestätigt wird, positionieren Sie die Welpen vorsichtig unter dem Mikroskop.
4. Mit dem linken Zeigefinger und Daumen tasten Sie vorsichtig den Zwischenwirbelraum entlang der Mittellinie ab, der sich zwischen den beidseitigen Beckengürteln befindet (Ergänzungsvideo 1). Drehen Sie die Basis des Schwanzes vorsichtig leicht, um die Mittellinie der Wirbelsäule zu identifizieren.
5. Stellen Sie die Nadelfase vor der Injektion auf den Kopf des Tieres ein.
6. Führen Sie die Nadel vorsichtig ein und kippen Sie sie an der Stelle, an der sich die Vertiefung schneidet, leicht in einem Winkel von 70°-80°, wobei Sie sicherstellen, dass die Spritze mit der zentralen Sagittalebene ausgerichtet bleibt. Wenn die Nadel den Knochen berührt, verringern Sie den Winkel allmählich auf ca. 30° und schieben Sie die Nadel dann etwa 2 mm in den Zwischenwirbelraum vor.
   HINWEIS: Die Fähigkeit der Nadel, den gesamten Körper leicht anzuheben, ist ein Zeichen für einen erfolgreichen Eintritt in den intraduralen Raum.
7. Injizieren Sie langsam bis zu 10 μl Volumen innerhalb von 50-60 s. Lassen Sie die Nadel nach Abschluss der Lieferung 10-20 s lang an Ort und Stelle. Ziehen Sie die Nadel mit einer sanften Drehung zurück, um ein Auslaufen zu vermeiden.
   HINWEIS: Das Kleinhirn wird grün, bevor die Nadel zurückgezogen wird. Außerdem ist der langsame Druck entscheidend, um einen Anstieg des intrakraniellen Drucks im Zusammenhang mit der Entbindung zu verhindern und mögliche Komplikationen zu minimieren. Basierend auf unserer Erfahrung mit Injektionen bei mehr als 500 Welpen ist die Abgabe eines Volumens von 10 μl über 50-60 s optimal.

3. Nach der Injektion

1. Tragen Sie ein Wattestäbchen auf die Injektionsstelle auf, wenn Blut ausläuft oder Blut vorhanden ist.
   HINWEIS: In den meisten Fällen sollte es keine geben. Aus unserer Erfahrung sind Welpen, die mit Spuren von Leckagen oder Blut behandelt wurden, immer noch verwendbar, aber bei der Datenanalyse kann die Berücksichtigung einer reduzierten Dosis von Medikamenten oder Behandlungen erforderlich sein.
2. Legen Sie den Welpen auf ein Heizkissen und warten Sie 10-15 Minuten, bis sich die Welpen vollständig erholt und wieder aufgewärmt haben. Beobachten Sie die Welpen sorgfältig, um sicherzustellen, dass sie wachsam sind und sich aktiv bewegen, bevor Sie sie in ihren Heimatkäfig zurückbringen. Eine angemessene Erholung einer Maus wird durch die Wiederherstellung der rosa Hautfarbe, erhöhte spontane Körperbewegungen und reaktionsschnelle Reaktionen auf Berührungen angezeigt.
3. Setzen Sie den Welpen zurück in den Heimkäfig und stellen Sie sicher, dass der Welpe richtig mit Einstreu, Nestchen oder beidem bedeckt ist. Dadurch wird sichergestellt, dass der Welpe die notwendige mütterliche Fürsorge von der Mutter erhält.
4. Beurteilen Sie das allgemeine Erscheinungsbild und die Aktivität täglich für mindestens 3 Tage nach der Injektion. Ein krankes Auftreten und eine verminderte Aktivität können die Möglichkeit einer Infektion, behandlungsbedingter Nebenwirkungen oder anderer Komplikationen usw. erhöhen. Wenden Sie sich bei Bedarf an einen Tierarzt.

Ergebnisse

Eine erfolgreiche intrathekale Injektion führte sofort zu einer weit verbreiteten Verteilung der verabreichten Lösung, obwohl die tatsächliche Zellpenetration von der Art der verabreichten Medikamente und Materialien abhing. In dieser Studie verwendeten wir Fast Green, um die unmittelbaren Ergebnisse nach intrathekaler Injektion (IT) bei Wildtyp-Neugeborenen zu visualisieren (Abbildung 1A-K) und verglichen sie mit der konventionellen intrazerebroventrikulären (ICV) Injek...

Diskussion

Beschrieben wird ein schrittweises Verfahren zur intrathekalen Injektion bei neugeborenen Mäusen (P1), das zu einer weit verbreiteten Medikamentenverteilung in ihren Gehirnen führt. Im Vergleich zur üblichen intrazerebroventrikulären Injektionsmethode zur Verabreichung von Medikamenten an neugeborene Mäuse, bei der die Großhirnrinde^{durchstochen wird 11}, vermeidet die intrathekale Injektion eine direkte Verletzung des neonatalen Mäusegehirns durch Nadelpenetration. Aufgrund der minimalen Inv...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Balance	Ohaus Corporation	30253017
C57BL/6J mice	The Jackson Laboratory	000664
Digital Microscope	RWD	DOM-1001
DPBS	ThermoFisher	14190144
Fast Green	Sigma	F7252-5G
Heating pad	RWD	69020
Needles	Hamilton	6PK (34/0.375”/4/12DEG)S
Syringe	Hamilton	1702RN
Syringe Filters	Sigma	SLGVM33RS