Iniezione intratecale di topo neonato per l'editing del genoma e la somministrazione di farmaci

Riepilogo

Il presente protocollo delinea le istruzioni passo-passo per l'esecuzione di iniezioni intratecali nei topi neonatali per l'editing genetico e la somministrazione di farmaci.

Abstract

L'iniezione intratecale è una procedura comunemente impiegata sia nelle cliniche pediatriche che in quelle per adulti, che funge da mezzo efficace per somministrare farmaci e trattamenti. Somministrando direttamente farmaci e trattamenti nel liquido cerebrospinale del sistema nervoso centrale, questo metodo consente di ottenere concentrazioni localizzate di farmaci più elevate, riducendo al contempo gli effetti collaterali sistemici rispetto ad altre vie come le iniezioni endovenose, sottocutanee o intramuscolari. La sua importanza va oltre le impostazioni cliniche, poiché l'iniezione intratecale svolge un ruolo fondamentale negli studi preclinici incentrati sul trattamento dei disturbi neurogenetici nei roditori e in altri animali di grandi dimensioni, compresi i primati non umani. Tuttavia, nonostante la sua ampia applicazione, l'iniezione intratecale nei cuccioli giovani, in particolare neonatali, pone sfide tecniche significative a causa delle loro piccole dimensioni e della loro natura fragile. Una somministrazione efficace e affidabile di iniezioni intratecali nei topi neonati richiede una meticolosa attenzione ai dettagli e un'attenta considerazione di vari fattori. Pertanto, c'è un bisogno cruciale di un protocollo standardizzato che non solo fornisca istruzioni, ma evidenzi anche le considerazioni tecniche chiave e le buone pratiche di laboratorio per garantire la coerenza procedurale, nonché la sicurezza e il benessere degli animali.

Per rispondere a questa esigenza insoddisfatta, presentiamo un protocollo dettagliato e completo per l'esecuzione di iniezioni intratecali specifiche nei cuccioli appena nati il giorno 1 postnatale (P1). Seguendo le istruzioni passo-passo, i ricercatori possono eseguire con sicurezza iniezioni intratecali nei cuccioli neonatali, consentendo la somministrazione accurata di farmaci, oligo antisenso e virus per la sostituzione genica o trattamenti basati sull'editing del genoma. Inoltre, viene sottolineata l'importanza di aderire alle buone pratiche di laboratorio per mantenere il benessere degli animali e garantire risultati sperimentali affidabili. Questo protocollo mira ad affrontare le sfide tecniche associate alle iniezioni intratecali nei topi neonatali, facilitando in ultima analisi i progressi nel campo della ricerca neurogenetica che mira a sviluppare potenziali interventi terapeutici.

Introduzione

L'iniezione intratecale (IT) è una procedura clinica comune utilizzata per somministrare farmaci, raccogliere liquido cerebrospinale e mantenere la pressione intracranica sia nei pazienti pediatrici che in quelli adulti nelle cliniche ^1,2. La somministrazione di farmaci tramite iniezione intratecale è un approccio efficace per aumentare le concentrazioni di farmaci nel sistema nervoso centrale (SNC) riducendo al minimo l'esposizione sistemica. Di conseguenza, questo metodo migliora l'efficacia terapeutica e riduce gli effetti collaterali, in particolare per i farmaci sensibili alla temperatura e a breve emivita³.

Negli studi preclinici che testano nuovi farmaci e trattamenti utilizzando modelli di roditori, è imperativo utilizzare un metodo affidabile di somministrazione dei farmaci che offra maggiore precisione e riproducibilità dei risultati ^4,5. Per gli studi preclinici che valutano nuovi trattamenti per i disturbi neurogenetici e del neurosviluppo, il trattamento precoce è fondamentale per gli studi iniziali proof-of-concept perché si prevede che gli interventi precoci producano risultati più favorevoli ^6,7,8.

Rispetto alle iniezioni intracerebroventricolari convenzionali (ICV), le iniezioni di IT comportano rischi significativamente inferiori poiché ovviano alla necessità di penetrazione diretta attraverso la corteccia cerebrale. Questo vantaggio riduce sostanzialmente il potenziale danno al tessuto corticale regionale e ai nervi circostanti. Inoltre, le iniezioni di IT consentono un aumento di almeno cinque volte del volume somministrabile di farmaci attraverso una singola iniezione, migliorando notevolmente la fattibilità di somministrazioni ripetute. Tuttavia, a causa delle piccole dimensioni e della natura fragile dei topi appena nati, l'esecuzione di iniezioni intratecali nei cuccioli appena nati è tecnicamente impegnativa e richiede tecniche specializzate, attrezzature e una manipolazione meticolosa.

Questo articolo fornisce un protocollo dettagliato con istruzioni dettagliate per l'esecuzione di iniezioni intratecali nei cuccioli neonati P1. Le considerazioni chiave e le buone pratiche di laboratorio sono qui enfatizzate per garantire la coerenza della somministrazione e la sicurezza e il benessere degli animali durante la procedura. Seguendo questo protocollo, i ricercatori possono condurre esperimenti con sicurezza con precisione e riproducibilità, riducendo al minimo qualsiasi potenziale rischio o disagio per gli animali.

Protocollo

Le procedure e i protocolli descritti erano conformi alle linee guida delineate nella Guida del National Institutes of Health per la cura e l'uso degli animali da laboratorio. Inoltre, le procedure hanno ricevuto l'approvazione del Comitato per la cura e l'uso degli animali presso la Yale University School of Medicine. Per lo studio presentato sono stati utilizzati topi maschi e femmine neonati wild-type (WT) C57BL/6J. Gli animali sono stati ottenuti da una fonte commerciale (vedi Tabella dei materiali).

1. Preparazione dello spazio di lavoro

1. Preparare prima i seguenti elementi: ghiaccio umido per crioanestesia, una gabbia vuota per separare i cuccioli dalla madre, un microscopio da dissezione, una fonte di luce, una superficie pulita per posizionare l'animale durante l'iniezione, cotton fioc, un termoforo, una siringa da 25/10 μL e un ago da 34 G/ 0,375"/ 12 DEG (vedi Tabella dei materiali).
   NOTA: La crioanestesia per i cuccioli di topo che utilizza ghiaccio umido è un passaggio facoltativo destinato a facilitare la manipolazione, ridurre il movimento del cucciolo e ridurre al minimo il potenziale disagio dell'animale. Questa fase di crioanestesia può anche fornire il vantaggio di abbassare la pressione intracranica e ridurre le complicanze legate al volume ^9,10.
2. Sposta i cuccioli in una gabbia separata lontano dalla diga mentre li maneggi.
3. Pesa ogni cucciolo e documenta il suo peso.
4. Pulisci la parte posteriore del mouse usando una garza ed etanolo. Confermare lo spazio intervertebrale o, come minimo, la linea mediana del canale spinale (che dovrebbe apparire rossa nei cuccioli P1) utilizzando il microscopio da dissezione (Video supplementare 1).

2. Procedura di iniezione

1. Per anestetizzare un singolo cucciolo, posizionalo delicatamente su una barriera impermeabile come un manicotto di lattice o un foglio di alluminio su un bagno di ghiaccio per 3-5 minuti. È importante evitare di lasciare l'animale sul ghiaccio per un periodo prolungato, poiché ciò potrebbe comportare potenziali rischi di complicanze legate all'ipotermia, tra cui fibrillazione ventricolare, ipossia tissutale e acidosi metabolica.
   NOTA: La durata di 3-5 minuti può variare caso per caso. Valutare i segni dell'anestesia, come la mancata risposta a un pizzicotto del dito del piede, per determinare la durata appropriata.
2. Mentre l'animale è sul ghiaccio, caricare la siringa con 10 μL di formulazione del farmaco, preparazione del virus o liquido spinale artificiale di controllo, ecc.
   NOTA: Durante la fase di apprendimento, considerare l'opzione di iniettare lo stesso volume di colorante Fast Green miscelato all'1% con i materiali di consegna (vedi Tabella dei materiali). Questo può aiutare a visualizzare il processo di iniezione e aiutare ad apprendere e perfezionare la tecnica. I cuccioli a cui è stato iniettato Fast Green Dye o materiali simili devono essere soppressi poco dopo l'iniezione secondo il protocollo approvato, poiché questi materiali possono provocare reazioni infiammatorie o altri effetti collaterali negli animali.
3. Una volta che l'animale è completamente anestetizzato, come confermato da movimenti del corpo ridotti o assenti, posizionare delicatamente i cuccioli sotto il microscopio.
4. Con l'indice e il pollice sinistri, palpare con cautela lo spazio intervertebrale lungo la linea mediana, situato tra i cingoli pelvici bilaterali (Video supplementare 1). Ruota leggermente la base della coda per aiutare a identificare la linea mediana della colonna vertebrale.
5. Regolare lo smusso dell'ago verso la testa dell'animale prima dell'iniezione.
6. Inserire con cautela l'ago, inclinandolo leggermente ad un angolo di 70°-80° nel punto in cui la rientranza si interseca, assicurandosi che la siringa rimanga allineata con il piano sagittale centrale. Quando l'ago entra in contatto con l'osso, diminuire gradualmente l'angolo a circa 30°, quindi far avanzare l'ago di circa 2 mm nello spazio intervertebrale.
   NOTA: La capacità dell'ago di sollevare leggermente l'intero corpo è un segno di successo dell'ingresso nello spazio intradurale.
7. Iniettare lentamente fino a 10 μL di volume entro 50-60 s. Tenere l'ago in posizione per 10-20 secondi dopo il completamento della consegna. Estrarre l'ago con una leggera rotazione per evitare perdite.
   NOTA: Il cervelletto diventerà verde prima di estrarre l'ago. Inoltre, la spinta lenta è fondamentale per prevenire un aumento della pressione intracranica associata al parto e per ridurre al minimo le potenziali complicanze. Sulla base della nostra esperienza con le iniezioni in più di 500 cuccioli, la somministrazione di un volume di 10 μL in 50-60 secondi è ottimale.

3. Post iniezione

1. Applicare un batuffolo di cotone sul sito di iniezione in caso di perdite o sangue.
   NOTA: Nella maggior parte dei casi non dovrebbe essercene alcuno. In base alla nostra esperienza, i cuccioli trattati con tracce di perdite o sangue sono ancora utilizzabili, ma durante l'analisi dei dati può essere necessario prendere in considerazione una dose ridotta di farmaci o trattamenti.
2. Metti il cucciolo su un termoforo e attendi 10-15 minuti affinché i cuccioli si riprendano completamente e si riscaldino. Osserva attentamente i cuccioli per assicurarti che siano vigili e si muovano attivamente prima di riportarli nella loro gabbia di casa. Un adeguato recupero di un topo è indicato dal ripristino del colore rosa della pelle, dall'aumento del movimento spontaneo del corpo e dalle reazioni reattive al tocco.
3. Rimetti il cucciolo nella gabbia di casa e assicurati che sia adeguatamente coperto con lettiera, nido o entrambi. Ciò garantisce che il cucciolo riceva le cure materne necessarie dalla madre.
4. Valutare l'aspetto generale e l'attività quotidiana per almeno 3 giorni dopo l'iniezione. Un aspetto malato e un'attività ridotta possono aumentare la possibilità di infezioni, effetti collaterali associati al trattamento o altre complicazioni, ecc. Se necessario, consultare il veterinario.

Risultati

Il successo dell'iniezione intratecale ha portato immediatamente alla distribuzione capillare della soluzione somministrata, sebbene l'effettiva penetrazione cellulare dipendesse dalla natura dei farmaci e dei materiali somministrati. In questo studio, abbiamo utilizzato Fast Green per visualizzare i risultati immediati dopo l'iniezione intratecale (IT) nei neonati wild-type (Figura 1A-K) e li abbiamo confrontati con l'iniezione intracerebroventricolare conv...

Discussione

Viene descritta una procedura passo-passo per l'iniezione intratecale nei topi neonatali (P1), con conseguente distribuzione diffusa del farmaco nel loro cervello. Rispetto al comune metodo di iniezione intracerebroventricolare per la somministrazione di farmaci ai topi neonatali, che prevede la perforazione della corteccia cerebrale¹¹, l'iniezione intratecale evita lesioni dirette al cervello del topo neonatale a causa della penetrazione dell'ago. A causa della minima invasività, l'iniezione int...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Balance	Ohaus Corporation	30253017
C57BL/6J mice	The Jackson Laboratory	000664
Digital Microscope	RWD	DOM-1001
DPBS	ThermoFisher	14190144
Fast Green	Sigma	F7252-5G
Heating pad	RWD	69020
Needles	Hamilton	6PK (34/0.375”/4/12DEG)S
Syringe	Hamilton	1702RN
Syringe Filters	Sigma	SLGVM33RS