Injeção Intratecal de Camundongos Recém-Nascidos para Edição do Genoma e Liberação de Fármacos

Resumo

O presente protocolo descreve instruções passo a passo para a realização de injeções intratecais em camundongos neonatais para edição gênica e liberação de drogas.

Resumo

A injeção intratecal é um procedimento comumente empregado em clínicas pediátricas e de adultos, servindo como um meio eficaz para administrar medicamentos e tratamentos. Ao administrar diretamente medicamentos e tratamentos no líquido cefalorraquidiano do sistema nervoso central, esse método alcança maiores concentrações localizadas de drogas enquanto reduz os efeitos colaterais sistêmicos em comparação com outras vias, como injeções intravenosas, subcutâneas ou intramusculares. Sua importância vai além dos cenários clínicos, já que a injeção intratecal desempenha um papel vital em estudos pré-clínicos focados no tratamento de distúrbios neurogenéticos em roedores e outros animais de grande porte, incluindo primatas não humanos. No entanto, apesar de sua ampla aplicação, a injeção intratecal em filhotes jovens, particularmente neonatais, apresenta desafios técnicos significativos devido ao seu pequeno tamanho e natureza frágil. A administração bem-sucedida e confiável de injeções intratecais em camundongos recém-nascidos requer atenção meticulosa aos detalhes e consideração cuidadosa de vários fatores. Assim, há uma necessidade crucial de um protocolo padronizado que não apenas forneça instruções, mas também destaque as principais considerações técnicas e boas práticas de laboratório para garantir a consistência do procedimento, bem como a segurança e o bem-estar dos animais.

Para atender a essa necessidade não atendida, apresentamos um protocolo detalhado e abrangente para a realização de injeções intratecais especificamente em filhotes recém-nascidos no dia 1 pós-natal (P1). Seguindo as instruções passo a passo, os pesquisadores podem realizar com confiança injeções intratecais em filhotes neonatais, permitindo a entrega precisa de drogas, oligos antisenso e vírus para substituição de genes ou tratamentos baseados em edição de genoma. Além disso, ressalta-se a importância da adesão às boas práticas laboratoriais para manter o bem-estar dos animais e garantir resultados experimentais confiáveis. Este protocolo visa abordar os desafios técnicos associados às injeções intratecais em camundongos neonatais, facilitando os avanços no campo da pesquisa neurogenética que visa desenvolver potenciais intervenções terapêuticas.

Introdução

A injeção intratecal (TI) é um procedimento clínico comum usado para administrar medicamentos, coletar líquido cefalorraquidiano e manter a pressão intracraniana em pacientes pediátricos e adultos em clínicas ^1,2. A administração de medicamentos por injeção intratecal é uma abordagem eficaz para aumentar as concentrações de medicamentos no sistema nervoso central (SNC), minimizando a exposição sistêmica. Consequentemente, esse método aumenta a eficácia terapêutica e reduz os efeitos colaterais, especialmente para fármacos sensíveis à temperatura e de meia-vida curta³.

Em estudos pré-clínicos testando novas drogas e tratamentos utilizando modelos de roedores, é imperativo empregar um método confiável de administração de medicamentos que ofereça maior precisão e reprodutibilidade dos resultados ^4,5. Para estudos pré-clínicos que avaliam novos tratamentos para transtornos neurogenéticos e do neurodesenvolvimento, o tratamento precoce é crucial para estudos iniciais de prova de conceito, pois intervenções mais precoces são tipicamente previstas para produzir resultados mais favoráveis ^6,7,8.

Em comparação com as injeções intracerebroventriculares (ICV) convencionais, as injeções de IT apresentam riscos significativamente menores, uma vez que evitam a necessidade de penetração direta através do córtex cerebral. Essa vantagem reduz substancialmente o dano potencial ao tecido cortical regional e nervos adjacentes. Além disso, as injeções de TI permitem um aumento de pelo menos cinco vezes no volume administrável de medicamentos por meio de uma única injeção, aumentando consideravelmente a viabilidade de administrações repetidas. No entanto, devido ao pequeno tamanho e à natureza frágil dos camundongos recém-nascidos, a realização de injeções intratecais em filhotes recém-nascidos é tecnicamente desafiadora e requer técnicas especializadas, equipamentos e manuseio meticuloso.

Este artigo fornece um protocolo detalhado com instruções passo a passo para a realização de injeções intratecais em filhotes recém-nascidos P1. As principais considerações e boas práticas de laboratório são enfatizadas aqui para garantir a consistência da administração e a segurança e bem-estar dos animais durante o procedimento. Ao seguir esse protocolo, os pesquisadores podem conduzir experimentos com confiança com precisão e reprodutibilidade, minimizando quaisquer riscos potenciais ou desconforto para os animais.

Protocolo

Os procedimentos e protocolos descritos estavam de acordo com as diretrizes descritas no National Institutes of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. Além disso, os procedimentos receberam aprovação do Comitê de Cuidados e Uso de Animais da Escola de Medicina da Universidade de Yale. Camundongos recém-nascidos selvagens (WT) C57BL/6J machos e fêmeas foram usados para o estudo apresentado. Os animais foram obtidos de fonte comercial (ver Tabela de Materiais).

1. Preparação do espaço de trabalho

1. Preparar primeiro os seguintes itens: gelo úmido para crioanestesia, gaiola vazia para separar os filhotes da mãe, microscópio dissecante, fonte de luz, superfície limpa para colocar o animal durante a injeção, cotonetes, almofada térmica, seringa de 25/10 μL e agulha de 34 G/0,375"/12 DEG (ver Tabela de Materiais).
   NOTA: A crioanestesia para filhotes de camundongos usando gelo úmido é uma etapa opcional destinada a facilitar o manuseio, reduzir o movimento do filhote e minimizar o potencial desconforto do animal. Essa etapa da crioanestesia também pode proporcionar o benefício da redução da pressão intracraniana e das complicações relacionadas ao volume ^9,10.
2. Mova os filhotes para uma gaiola separada longe da represa enquanto os manuseia.
3. Pese cada filhote e documente seu peso.
4. Limpe a parte de trás do mouse usando gaze e etanol. Confirme o espaço intervertebral ou, no mínimo, a linha média do canal vertebral (que deve aparecer vermelha nos filhotes P1) usando o microscópio dissecante (Vídeo Suplementar 1).

2. Procedimento de injeção

1. Para anestesiar um único filhote, coloque-o suavemente em uma barreira à prova d'água, como uma manga de látex ou papel alumínio em um banho de gelo por 3-5 min. É importante evitar deixar o animal no gelo por um período prolongado, pois isso pode representar riscos potenciais de complicações relacionadas à hipotermia, incluindo fibrilação ventricular, hipóxia tecidual e acidose metabólica.
   NOTA: A duração de 3-5 min pode variar caso a caso. Avalie os sinais da anestesia, como falta de resposta a uma pinça do dedo do pé, para determinar a duração apropriada.
2. Enquanto o animal estiver no gelo, carregue a seringa com 10 μL da formulação do medicamento, preparação do vírus, ou controle do líquido espinhal artificial, etc.
   NOTA: Durante a fase de aprendizagem, considere a opção de injetar o mesmo volume de corante Fast Green misturado a 1% com os materiais de entrega (consulte a Tabela de Materiais). Isso pode ajudar na visualização do processo de injeção e auxiliar no aprendizado e refinamento da técnica. Os filhotes injetados com Fast Green Dye ou materiais similares devem ser eutanasiados logo após a injeção, de acordo com o protocolo aprovado, pois esses materiais podem resultar em reações inflamatórias ou outros efeitos colaterais em animais.
3. Uma vez que o animal esteja totalmente anestesiado, como confirmado por movimentos corporais reduzidos ou ausentes, posicione suavemente os filhotes sob o microscópio.
4. Com o dedo indicador e polegar esquerdos, palpar cuidadosamente o espaço intervertebral ao longo da linha média, situado entre as cinturas pélvicas bilaterais (Vídeo Suplementar 1). Gire suavemente a base da cauda ligeiramente para ajudar a identificar a linha média da coluna vertebral.
5. Ajustar o bisel da agulha em direção à cabeça do animal antes da injeção.
6. Introduza cuidadosamente a agulha, inclinando-a ligeiramente para um ângulo de 70°-80° no ponto em que a indentação se cruza, garantindo que a seringa permaneça alinhada com o plano sagital central. À medida que a agulha entra em contato com o osso, diminua gradualmente o ângulo para aproximadamente 30° e, em seguida, avance a agulha cerca de 2 mm para o espaço intervertebral.
   NOTA: A capacidade da agulha de levantar ligeiramente todo o corpo é um sinal de entrada bem-sucedida no espaço intradural.
7. Injetar lentamente até 10 μL de volume dentro de 50-60 s. Mantenha a agulha no lugar por 10-20 s após a conclusão do parto. Retire a agulha com uma rotação suave para evitar fugas.
   NOTA: O cerebelo ficará verde antes de retirar a agulha. Além disso, o impulso lento é fundamental para prevenir o aumento da pressão intracraniana associada ao parto e minimizar possíveis complicações. Com base em nossa experiência com injeções em mais de 500 filhotes, entregar um volume de 10 μL acima de 50-60 s é o ideal.

3. Pós-injeção

1. Aplique um cotonete no local da injeção se houver vazamento ou sangue.
   NOTA: Não deve haver nenhum na maioria dos casos. Pela nossa experiência, filhotes tratados com vestígios de vazamento ou sangue ainda são utilizáveis, mas a consideração de uma dose reduzida de medicamentos ou tratamentos pode ser necessária durante a análise dos dados.
2. Coloque o filhote em uma almofada de aquecimento e aguarde 10-15 minutos para que os filhotes se recuperem totalmente e se aqueçam. Observe cuidadosamente os filhotes para garantir que eles estejam alertas e se movendo ativamente antes de devolvê-los à gaiola de casa. A recuperação adequada de um camundongo é indicada pela restauração da cor rosa da pele, aumento do movimento espontâneo do corpo e reações responsivas ao toque.
3. Coloque o filhote de volta na gaiola de casa e certifique-se de que o filhote esteja devidamente coberto com roupa de cama, ninho ou ambos. Isso garante que o filhote receba os cuidados maternos necessários da represa.
4. Avaliar a aparência geral e atividade diariamente por pelo menos 3 dias após a injeção. Uma aparência doente e atividade reduzida podem aumentar a possibilidade de infecção, efeitos colaterais associados ao tratamento, ou outras complicações, etc. Se necessário, consulte o atendimento veterinário.

Resultados

A injeção intratecal bem-sucedida resultou imediatamente na distribuição generalizada da solução administrada, embora a penetração celular real dependesse da natureza dos medicamentos e materiais administrados. Neste estudo, utilizamos o Fast Green para visualizar os resultados imediatos após a injeção intratecal (TI) em neonatos selvagens (Figura 1A-K) e comparamos com a injeção intracerebroventricular (VCI) convencional (F...

Discussão

Descrito é um procedimento passo-a-passo para injeção intratecal em camundongos neonatais (P1), resultando em ampla distribuição de drogas em seus cérebros. Em comparação com o método comum de injeção intracerebroventricular para administração de medicamentos em camundongos neonatais, que envolve perfuração do córtex cerebral¹¹, a injeção intratecal evita lesão direta no cérebro neonatal de camundongos devido à penetração da agulha. Devido à mínima invasividade, a injeçã...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Balance	Ohaus Corporation	30253017
C57BL/6J mice	The Jackson Laboratory	000664
Digital Microscope	RWD	DOM-1001
DPBS	ThermoFisher	14190144
Fast Green	Sigma	F7252-5G
Heating pad	RWD	69020
Needles	Hamilton	6PK (34/0.375”/4/12DEG)S
Syringe	Hamilton	1702RN
Syringe Filters	Sigma	SLGVM33RS