Genom Düzenleme ve İlaç Dağıtımı için Yenidoğan Farenin İntratekal Enjeksiyonu

Özet

Mevcut protokol, gen düzenleme ve ilaç dağıtımı için yenidoğan farelerde intratekal enjeksiyonların gerçekleştirilmesi için adım adım talimatları özetlemektedir.

Özet

İntratekal enjeksiyon, hem pediatrik hem de yetişkin kliniklerinde yaygın olarak kullanılan bir prosedürdür ve ilaç ve tedavileri uygulamak için etkili bir araç olarak hizmet eder. Bu yöntem, ilaçları ve tedavileri doğrudan merkezi sinir sisteminin beyin omurilik sıvısına vererek, intravenöz, deri altı veya kas içi enjeksiyonlar gibi diğer yollara kıyasla sistemik yan etkileri azaltırken daha yüksek lokalize ilaç konsantrasyonları sağlar. İntratekal enjeksiyon, kemirgenlerde ve insan olmayan primatlar da dahil olmak üzere diğer büyük hayvanlarda nörogenetik bozuklukların tedavisine odaklanan klinik öncesi çalışmalarda hayati bir rol oynadığından, önemi klinik ortamların ötesine uzanır. Bununla birlikte, yaygın olarak uygulanmasına rağmen, genç, özellikle yenidoğan yavrularda intratekal enjeksiyon, küçük boyutları ve kırılgan yapıları nedeniyle önemli teknik zorluklar doğurmaktadır. Yenidoğan farelerde intratekal enjeksiyonların başarılı ve güvenilir bir şekilde uygulanması, ayrıntılara titizlikle dikkat edilmesini ve çeşitli faktörlerin dikkatli bir şekilde değerlendirilmesini gerektirir. Bu nedenle, yalnızca talimatlar sağlamakla kalmayıp aynı zamanda prosedürel tutarlılığın yanı sıra hayvanların güvenliği ve refahını sağlamak için temel teknik hususları ve iyi laboratuvar uygulamalarını vurgulayan standart bir protokole çok önemli bir ihtiyaç vardır.

Bu karşılanmamış ihtiyacı karşılamak için, özellikle doğum sonrası 1. günde (P1) yenidoğan yavrularda intratekal enjeksiyonların gerçekleştirilmesi için ayrıntılı ve kapsamlı bir protokol sunuyoruz. Araştırmacılar, adım adım talimatları izleyerek, yenidoğan yavrularında intratekal enjeksiyonları güvenle gerçekleştirebilir ve gen replasmanı veya genom düzenlemeye dayalı tedaviler için ilaçların, antisens oligoların ve virüslerin doğru bir şekilde verilmesini sağlayabilir. Ayrıca, hayvanların refahını korumak ve güvenilir deney sonuçları sağlamak için iyi laboratuvar uygulamalarına bağlı kalmanın önemi vurgulanmaktadır. Bu protokol, yenidoğan farelerde intratekal enjeksiyonlarla ilgili teknik zorlukları ele almayı ve sonuçta potansiyel terapötik müdahaleler geliştirmeyi amaçlayan nörogenetik araştırma alanındaki ilerlemeleri kolaylaştırmayı amaçlamaktadır.

Giriş

İntratekal (IT) enjeksiyon, kliniklerde hem pediatrik hem de yetişkin hastalarda ilaç uygulamak, beyin omurilik sıvısı toplamak ve kafa içi basıncı korumak için kullanılan yaygın bir klinik prosedürdür ^1,2. İlaçların intratekal enjeksiyon yoluyla uygulanması, sistemik maruziyeti en aza indirirken merkezi sinir sistemindeki (MSS) ilaç konsantrasyonlarını artırmak için etkili bir yaklaşımdır. Sonuç olarak, bu yöntem terapötik etkinliği arttırır ve özellikle sıcaklığa duyarlı ve kısa yarı ömürlü ilaçlar için yan etkileri azaltır³.

Kemirgen modelleri kullanılarak yeni ilaçları ve tedavileri test eden klinik öncesi çalışmalarda, daha fazla hassasiyet ve sonuç tekrarlanabilirliği sunan güvenilir bir ilaç uygulama yönteminin kullanılması zorunludur ^4,5. Nörogenetik ve nörogelişimsel bozukluklar için yeni tedavileri değerlendiren klinik öncesi çalışmalar için, erken tedavi, ilk kavram kanıtlama çalışmaları için çok önemlidir, çünkü daha önceki müdahalelerin tipik olarak daha olumlu sonuçlar vereceği tahmin edilmektedir ^6,7,8.

Konvansiyonel intraserebrovataküler (ICV) enjeksiyonlarla karşılaştırıldığında, BT enjeksiyonları serebral korteksten doğrudan penetrasyon ihtiyacını ortadan kaldırdığı için önemli ölçüde daha düşük riskler taşır. Bu avantaj, bölgesel kortikal dokuya ve çevresindeki sinirlere olası hasarı önemli ölçüde azaltır. Ayrıca, BT enjeksiyonları, tek bir enjeksiyonla uygulanabilir ilaç hacminde en az beş kat artışa izin vererek, tekrarlanan uygulamaların fizibilitesini büyük ölçüde artırır. Bununla birlikte, yenidoğan farelerin küçük boyutu ve kırılgan doğası nedeniyle, yenidoğan yavrularda intratekal enjeksiyonların yapılması teknik olarak zordur ve özel teknikler, ekipman ve titiz kullanım gerektirir.

Bu makale, P1 yenidoğan yavrularında intratekal enjeksiyonların gerçekleştirilmesi için adım adım talimatlar içeren ayrıntılı bir protokol sunmaktadır. Uygulamanın tutarlılığını ve prosedür sırasında hayvanların güvenliğini ve refahını sağlamak için burada temel hususlar ve iyi laboratuvar uygulamaları vurgulanmaktadır. Araştırmacılar, bu protokolü izleyerek, hayvanlar için olası riskleri veya rahatsızlıkları en aza indirirken, hassasiyet ve tekrarlanabilirlik ile deneyleri güvenle yürütebilirler.

Protokol

Açıklanan prosedürler ve protokoller, Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı için Ulusal Sağlık Enstitüleri Kılavuzu'nda belirtilen yönergelere uygundur. Ek olarak, prosedürler Yale Üniversitesi Tıp Fakültesi'ndeki Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi'nden onay aldı. Sunulan çalışma için yenidoğan vahşi tip (WT) C57BL / 6J erkek ve dişi fareler kullanıldı. Hayvanlar ticari bir kaynaktan elde edilmiştir (bkz.

1. Çalışma alanının hazırlanması

1. Önce aşağıdaki öğeleri hazırlayın: kriyo-anestezi için ıslak buz, yavruları barajdan ayırmak için boş bir kafes, bir diseksiyon mikroskobu, bir ışık kaynağı, enjeksiyon sırasında hayvanı yerleştirmek için temiz bir yüzey, pamuklu çubuklar, bir ısıtma yastığı, 25/10 μL şırınga ve 34 G / 0.375 "/ 12 ° İğne (Malzeme Tablosuna bakınız).
   NOT: Islak buz kullanan fare yavruları için kriyo-anestezi, kullanımı kolaylaştırmayı, yavru hareketini azaltmayı ve olası hayvan rahatsızlığını en aza indirmeyi amaçlayan isteğe bağlı bir adımdır. Bu kriyo-anestezi aşaması aynı zamanda kafa içi basıncın düşürülmesi ve hacimle ilgili komplikasyonların azaltılması yararını da sağlayabilir ^9,10.
2. Yavruları tutarken barajdan uzakta ayrı bir kafese taşıyın.
3. Her yavruyu tartın ve ağırlıklarını belgeleyin.
4. Gazlı bez ve etanol kullanarak farenin arkasını silin. Diseksiyon mikroskobu kullanarak intervertebral boşluğu veya en azından omurilik kanalının orta hattını (P1 yavrularında kırmızı görünmelidir) onaylayın (Ek Video 1).

2. Enjeksiyon prosedürü

1. Tek bir yavruyu uyuşturmak için, 3-5 dakika boyunca bir buz banyosu üzerinde lateks kılıf veya alüminyum folyo gibi su geçirmez bir bariyer üzerine nazikçe yerleştirin. Hayvanı uzun süre buz üzerinde bırakmaktan kaçınmak önemlidir, çünkü bunu yapmak ventriküler fibrilasyon, doku hipoksisi ve metabolik asidoz dahil olmak üzere hipotermi ile ilgili komplikasyonlar için potansiyel riskler oluşturabilir.
   NOT: 3-5 dakikalık süre duruma göre değişebilir. Uygun süreyi belirlemek için ayak parmağı sıkışmasına yanıt vermeme gibi anestezi belirtilerini değerlendirin.
2. Hayvan buzun üzerindeyken, şırıngaya 10 μL ilaç formülasyonu, virüs hazırlığı veya yapay omurilik sıvısını kontrol etme vb.
   NOT: Öğrenme aşamasında, dağıtım malzemeleriyle aynı hacimde karışık %1 Hızlı Yeşil boya enjekte etme seçeneğini göz önünde bulundurun (Malzeme Tablosuna bakın). Bu, enjeksiyon sürecini görselleştirmeye yardımcı olabilir ve tekniğin öğrenilmesine ve iyileştirilmesine yardımcı olabilir. Hızlı Yeşil Boya veya benzeri malzemeler enjekte edilen yavrular, bu malzemeler hayvanlarda enflamatuar reaksiyonlara veya diğer yan etkilere neden olabileceğinden, onaylanmış protokole göre enjeksiyondan kısa bir süre sonra ötenazi yapılmalıdır.
3. Hayvan tamamen uyuşturulduktan sonra, vücut hareketinin azalması veya olmaması ile onaylandığı gibi, yavruları mikroskop altında nazikçe konumlandırın.
4. Sol işaret parmağı ve başparmak ile, bilateral pelvik kuşaklar arasında yer alan orta hat boyunca intervertebral boşluğu dikkatlice palpe edin (Ek Video 1). Omurganın orta hattını tanımlamaya yardımcı olmak için kuyruğun tabanını hafifçe döndürün.
5. Enjeksiyondan önce iğne eğimini hayvanın kafasına doğru ayarlayın.
6. Şırınganın merkezi sagital düzlemle aynı hizada kalmasını sağlarken, girintinin kesiştiği noktada 70°-80°'lik bir açıyla hafifçe eğerek iğneyi dikkatlice yerleştirin. İğne kemikle temas ettiğinde, açıyı kademeli olarak yaklaşık 30°'ye düşürün, ardından iğneyi intervertebral boşluğa yaklaşık 2 mm ilerletin.
   NOT: İğnenin tüm vücudu hafifçe kaldırma yeteneği, intradural boşluğa başarılı bir şekilde girildiğinin bir işaretidir.
7. 50-60 s içinde 10 μL hacme kadar yavaşça enjekte edin. Teslimat tamamlandıktan sonra iğneyi 10-20 saniye yerinde tutun. Sızıntıyı önlemek için iğneyi hafif bir dönüşle geri çekin.
   NOT: İğneyi çekmeden önce beyincik yeşile dönecektir. Ayrıca, yavaş itme, doğumla ilişkili kafa içi basıncında bir artışı önlemek ve olası komplikasyonları en aza indirmek için kritik öneme sahiptir. 500'den fazla yavru köpekte enjeksiyon konusundaki deneyimimize dayanarak, 50-60 sn boyunca 10 μL'lik bir hacim sağlamak en uygunudur.

3. Enjeksiyon sonrası

1. Herhangi bir sızıntı veya kan varsa enjeksiyon bölgesine pamuklu çubuk uygulayın.
   NOT: Çoğu durumda hiç olmamalıdır. Deneyimlerimize göre, sızıntı izleri veya kan izleri ile tedavi edilen yavrular hala kullanılabilir, ancak veri analizi sırasında azaltılmış dozda ilaç veya tedavilerin dikkate alınması gerekebilir.
2. Yavruyu bir ısıtma yastığına yerleştirin ve yavruların tamamen iyileşmesi ve yeniden ısınması için 10-15 dakika bekleyin. Yavruları ev kafeslerine geri döndürmeden önce uyanık olduklarından ve aktif olarak hareket ettiklerinden emin olmak için dikkatlice gözlemleyin. Bir farenin yeterli iyileşmesi, pembe ten renginin restorasyonu, artan spontan vücut hareketi ve dokunmaya duyarlı reaksiyonlar ile gösterilir.
3. Yavruyu ev kafesine geri yerleştirin ve yavrunun yatak takımı, yuva veya her ikisiyle de düzgün bir şekilde örtüldüğünden emin olun. Bu, yavrunun barajdan gerekli anne bakımını almasını sağlar.
4. Enjeksiyondan sonra en az 3 gün boyunca genel görünümü ve aktiviteyi günlük olarak değerlendirin. Hasta bir görünüm ve azalmış aktivite, enfeksiyon, tedaviye bağlı yan etkiler veya diğer komplikasyonlar vb. olasılığını artırabilir. Gerekirse, veteriner bakımına danışın.

Sonuçlar

Başarılı intratekal enjeksiyon, uygulanan çözeltinin yaygın dağılımına neden oldu, ancak gerçek hücresel penetrasyon, verilen ilaçların ve materyallerin doğasına bağlıydı. Bu çalışmada, vahşi tip yenidoğanlarda intratekal enjeksiyon (IT) sonrası hemen sonuçları görselleştirmek için Fast Green kullandık (Şekil 1A-K) ve geleneksel intraserebroventriküler (ICV) enjeksiyonla karşılaştırdık (Şekil 1L-N

Tartışmalar

Yenidoğan farelerde (P1) intratekal enjeksiyon için adım adım bir prosedür tarif edilmiştir ve beyinlerinde yaygın ilaç dağılımı ile sonuçlanır. Serebral korteks^11'in delinmesini içeren yenidoğan farelere ilaç vermek için yaygın intraserebroventriküler enjeksiyon yöntemiyle karşılaştırıldığında, intratekal enjeksiyon, iğne penetrasyonu nedeniyle yenidoğan fare beyninin doğrudan yaralanmasını önler. Minimal invazivlik nedeniyle, intratekal enjeksiyon gerektiğinde...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Balance	Ohaus Corporation	30253017
C57BL/6J mice	The Jackson Laboratory	000664
Digital Microscope	RWD	DOM-1001
DPBS	ThermoFisher	14190144
Fast Green	Sigma	F7252-5G
Heating pad	RWD	69020
Needles	Hamilton	6PK (34/0.375”/4/12DEG)S
Syringe	Hamilton	1702RN
Syringe Filters	Sigma	SLGVM33RS