Интратекальная инъекция новорожденной мыши для редактирования генома и доставки лекарств

Резюме

В настоящем протоколе изложены пошаговые инструкции по выполнению интратекальных инъекций новорожденным мышам для редактирования генов и доставки лекарств.

Аннотация

Интратекальная инъекция является широко используемой процедурой как в педиатрических, так и во взрослых клиниках, служащей эффективным средством для введения лекарств и лечения. Путем непосредственной доставки лекарств и методов лечения в спинномозговую жидкость центральной нервной системы, этот метод позволяет достичь более высоких локализованных концентраций лекарств при одновременном снижении системных побочных эффектов по сравнению с другими путями, такими как внутривенные, подкожные или внутримышечные инъекции. Его значение выходит за рамки клинических условий, поскольку интратекальная инъекция играет жизненно важную роль в доклинических исследованиях, направленных на лечение нейрогенетических расстройств у грызунов и других крупных животных, включая нечеловекообразных приматов. Однако, несмотря на широкое применение, интратекальные инъекции у молодых, особенно новорожденных детенышей, представляют собой значительные технические проблемы из-за их небольшого размера и хрупкой природы. Успешное и надежное введение интратекальных инъекций новорожденным мышам требует тщательного внимания к деталям и тщательного учета различных факторов. Таким образом, существует острая необходимость в стандартизированном протоколе, который не только содержит инструкции, но и освещает ключевые технические соображения и надлежащую лабораторную практику для обеспечения согласованности процедур, а также безопасности и благополучия животных.

Чтобы удовлетворить эту неудовлетворенную потребность, мы представляем подробный и всеобъемлющий протокол выполнения интратекальных инъекций, в частности, новорожденным щенкам на 1-й день после рождения (P1). Следуя пошаговым инструкциям, исследователи могут уверенно выполнять интратекальные инъекции новорожденным щенкам, обеспечивая точную доставку лекарств, антисмысловых олиго и вирусов для замены генов или лечения на основе редактирования генома. Кроме того, подчеркивается важность соблюдения надлежащей лабораторной практики для поддержания благополучия животных и обеспечения надежных результатов экспериментов. Этот протокол направлен на решение технических проблем, связанных с интратекальными инъекциями у новорожденных мышей, что в конечном итоге способствует прогрессу в области нейрогенетических исследований, направленных на разработку потенциальных терапевтических вмешательств.

Введение

Интратекальная (ИТ) инъекция является распространенной клинической процедурой, используемой для введения лекарств, сбора спинномозговой жидкости и поддержания внутричерепного давления как у детей, так и у взрослых пациентов в клиниках ^1,2. Введение лекарственных препаратов путем интратекальной инъекции является эффективным подходом для повышения концентрации лекарств в центральной нервной системе (ЦНС) при минимизации системного воздействия. Следовательно, этот метод повышает терапевтическую эффективность и уменьшает побочные эффекты, особенно для термочувствительных препаратов и препаратов с коротким периодом полувыведения³.

В доклинических исследованиях по испытанию новых лекарственных средств и методов лечения с использованием моделей грызунов необходимо использовать надежный метод введения лекарственных средств, обеспечивающий большую точность и воспроизводимость результатов ^4,5. Для доклинических исследований, оценивающих новые методы лечения нейрогенетических расстройств и нарушений развития нервной системы, раннее лечение имеет решающее значение для первоначальных исследований, подтверждающих концепцию, поскольку более ранние вмешательства, как правило, дают более благоприятные исходы ^6,7,8.

По сравнению с обычными внутримозговыми инъекциями (ИКВ), ИТ-инъекции сопряжены со значительно меньшими рисками, поскольку они устраняют необходимость прямого проникновения через кору головного мозга. Это преимущество существенно снижает потенциальное повреждение регионарной корковой ткани и окружающих нервов. Кроме того, ИТ-инъекции позволяют, по крайней мере, в пять раз увеличить объем вводимых лекарств за одну инъекцию, что значительно повышает возможность повторного введения. Однако из-за небольшого размера и хрупкой природы новорожденных мышей выполнение интратекальных инъекций новорожденным щенкам технически сложно и требует специализированных методов, оборудования и тщательного обращения.

В данной статье представлен подробный протокол с пошаговой инструкцией по выполнению интратекальных инъекций новорожденным щенкам P1. Здесь особое внимание уделяется ключевым соображениям и надлежащей лабораторной практике для обеспечения последовательности введения, а также безопасности и благополучия животных во время процедуры. Следуя этому протоколу, исследователи могут уверенно проводить эксперименты с точностью и воспроизводимостью, сводя к минимуму любые потенциальные риски или дискомфорт для животных.

протокол

Описанные процедуры и протоколы соответствовали рекомендациям, изложенным в Руководстве Национальных институтов здравоохранения по уходу за лабораторными животными и их использованию. Кроме того, процедуры получили одобрение Комитета по уходу за животными и их использованию в Медицинской школе Йельского университета. Для исследования были использованы новорожденные мыши дикого типа (WT) C57BL/6J самца и самки. Животные были получены из коммерческого источника (см. Таблицу материалов).

1. Подготовка рабочего пространства

1. Сначала подготовьте следующие предметы: влажный лед для криоанестезии, пустую клетку для отделения детенышей от матери, препарирующий микроскоп, источник света, чистую поверхность для размещения животного во время инъекции, ватные палочки, грелку, шприц 25/10 мкл и иглу 34 G/ 0,375"/12 DEG (см. таблицу материалов).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Криоанестезия для детенышей мышей с использованием влажного льда является необязательным шагом, предназначенным для облегчения обращения, уменьшения движений щенка и минимизации потенциального дискомфорта животного. Этот этап криоанестезии также может способствовать снижению внутричерепного давления и уменьшению осложнений, связанных с объемом ^9,10.
2. Переместите щенков в отдельную клетку подальше от плотины, пока вы берете их на руки.
3. Взвесьте каждого щенка и задокументируйте его вес.
4. Протрите заднюю часть мыши с помощью марли и этилового спирта. Подтвердите межпозвонковое пространство или, как минимум, среднюю линию спинномозгового канала (которая должна быть красной у щенков P1) с помощью препарирующего микроскопа (дополнительное видео 1).

2. Процедура инъекции

1. Чтобы обезболить одного щенка, осторожно поместите его на водонепроницаемый барьер, такой как латексный рукав или алюминиевая фольга, на ледяную баню на 3-5 минут. Важно не оставлять животное на льду в течение длительного периода времени, так как это может создать потенциальный риск осложнений, связанных с гипотермией, включая фибрилляцию желудочков, гипоксию тканей и метаболический ацидоз.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Продолжительность 3-5 минут может варьироваться в каждом конкретном случае. Оцените признаки анестезии, такие как отсутствие реакции на защемление пальца ноги, чтобы определить соответствующую продолжительность.
2. Пока животное находится на льду, загрузите в шприц 10 мкл лекарственной формы, препарата вируса или контролирующей искусственной спинномозговой жидкости и т.д.
   ПРИМЕЧАНИЕ: На этапе обучения рассмотрите возможность введения того же объема смешанного 1% красителя Fast Green с материалами для доставки (см. Таблицу материалов). Это может помочь визуализировать процесс инъекции, а также помочь в изучении и совершенствовании техники. Щенков, которым вводят краситель Fast Green или аналогичные материалы, следует усыпить вскоре после инъекции в соответствии с утвержденным протоколом, так как эти материалы могут вызвать воспалительные реакции или другие побочные эффекты у животных.
3. После того, как животное будет полностью обезболино, что подтверждается уменьшением или отсутствием движений тела, осторожно поместите детенышей под микроскоп.
4. Указательным и большим пальцами левой руки осторожно пальпируют межпозвонковое пространство по средней линии, расположенное между двусторонними тазовыми поясами (Дополнительное видео 1). Осторожно слегка поверните основание хвоста, чтобы определить среднюю линию позвоночника.
5. Перед инъекцией отрегулируйте скос иглы по направлению к голове животного.
6. Осторожно введите иглу, слегка наклонив ее под углом 70°-80° в месте пересечения углубления, при этом следя за тем, чтобы шприц оставался выровненным по центральной сагиттальной плоскости. По мере того, как игла соприкасается с костью, постепенно уменьшайте угол примерно до 30°, затем продвигайте иглу примерно на 2 мм в межпозвонковое пространство.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Способность иглы слегка приподнимать все тело является признаком успешного вхождения в интрадуральное пространство.
7. Медленно вводите объем до 10 мкл в течение 50-60 с. Держите иглу на месте в течение 10-20 секунд после завершения родов. Извлеките иглу плавным вращением, чтобы избежать протекания.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Мозжечок позеленеет перед извлечением иглы. Кроме того, медленные потуги имеют решающее значение для предотвращения повышения внутричерепного давления, связанного с родами, и для минимизации потенциальных осложнений. Основываясь на нашем опыте инъекций более чем 500 щенкам, оптимальным является предоставление объема 10 мкл в течение 50-60 с.

3. Пост-инъекция

1. Приложите ватный тампон к месту инъекции, если есть подтекание или кровь.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В большинстве случаев их не должно быть. По нашему опыту, щенки, у которых были обнаружены следы подтекания или крови, все еще пригодны к использованию, но при анализе данных может потребоваться рассмотрение уменьшенной дозы лекарств или лечения.
2. Положите щенка на грелку и подождите 10-15 минут, чтобы щенки полностью восстановились и согрелись. Внимательно наблюдайте за щенками, чтобы убедиться, что они бдительны и активно двигаются, прежде чем возвращать их в домашнюю клетку. Адекватное выздоровление мыши обозначается восстановлением розового цвета кожи, усилением спонтанных движений тела, отзывчивыми реакциями на прикосновения.
3. Поместите щенка обратно в домашнюю клетку и убедитесь, что он должным образом накрыт подстилкой, гнездом или и тем, и другим. Это гарантирует, что детеныш получит необходимую материнскую заботу от матери.
4. Оценивайте общий вид и активность ежедневно в течение не менее 3 дней после инъекции. Болезненный внешний вид и снижение активности могут повысить вероятность инфекции, побочных эффектов, связанных с лечением, или других осложнений и т. д. При необходимости проконсультируйтесь с ветеринарной службой.

Результаты

Успешная интратекальная инъекция немедленно приводила к широкому распространению введенного раствора, хотя фактическое проникновение в клетки зависело от характера доставляемых лекарств и материалов. В этом исследовании мы использовали Fast Green для визуализации немедленных результа?...

Обсуждение

Описана пошаговая процедура интратекальной инъекции новорожденным мышам (Р1), приводящая к широкому распространению препарата в их головном мозге. По сравнению с распространенным методом внутримозговой инъекции для введения лекарства новорожденным мышам, который включает в себя про?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Balance	Ohaus Corporation	30253017
C57BL/6J mice	The Jackson Laboratory	000664
Digital Microscope	RWD	DOM-1001
DPBS	ThermoFisher	14190144
Fast Green	Sigma	F7252-5G
Heating pad	RWD	69020
Needles	Hamilton	6PK (34/0.375”/4/12DEG)S
Syringe	Hamilton	1702RN
Syringe Filters	Sigma	SLGVM33RS