הזרקה תוך-תטית של עכבר שזה עתה נולד לצורך עריכת גנום ואספקת תרופות

Summary

הפרוטוקול הנוכחי מתווה הוראות שלב אחר שלב לביצוע זריקות תוך-תיקליות בעכברים יילודים לצורך עריכת גנים והעברת תרופות.

Abstract

הזרקה תוך-תאית היא הליך נפוץ הן במרפאות ילדים והן במרפאות מבוגרים, ומשמשת כאמצעי יעיל למתן תרופות וטיפולים. על ידי העברה ישירה של תרופות וטיפולים לנוזל השדרה של מערכת העצבים המרכזית, שיטה זו משיגה ריכוזי תרופות מקומיים גבוהים יותר תוך הפחתת תופעות לוואי מערכתיות בהשוואה למסלולים אחרים כגון זריקות תוך ורידי, תת עוריות או תוך שריריות. חשיבותו משתרעת מעבר להגדרות קליניות, שכן הזרקה תוך-תאית ממלאת תפקיד חיוני במחקרים פרה-קליניים המתמקדים בטיפול בהפרעות נוירוגנטיות במכרסמים ובבעלי חיים גדולים אחרים, כולל פרימטים שאינם אנושיים. עם זאת, למרות היישום הנרחב שלה, הזרקה intrathecal בצעירים, במיוחד גורי יילודים, מציב אתגרים טכניים משמעותיים בשל גודלם הקטן ואופיים השברירי. מתן מוצלח ואמין של זריקות תוך-תיקליות בעכברים שזה עתה נולדו דורש תשומת לב קפדנית לפרטים והתחשבות זהירה בגורמים השונים. לפיכך, יש צורך חיוני בפרוטוקול סטנדרטי שלא רק מספק הוראות, אלא גם מדגיש שיקולים טכניים מרכזיים ונוהלי מעבדה טובים כדי להבטיח עקביות פרוצדורלית, כמו גם את בטיחותם ורווחתם של בעלי החיים.

כדי לענות על צורך זה שלא נענה, אנו מציגים פרוטוקול מפורט ומקיף לביצוע זריקות תוך תאיות במיוחד בגורים שזה עתה נולדו ביום 1 שלאחר הלידה (P1). על ידי ביצוע ההוראות שלב אחר שלב, חוקרים יכולים לבצע בביטחון זריקות intrathecal בגורים יילודים, המאפשר משלוח מדויק של תרופות, אוליגוס אנטיסנס, וירוסים עבור החלפת גנים או טיפולים מבוססי עריכת גנום. יתר על כן, מודגשת החשיבות של הקפדה על שיטות מעבדה טובות כדי לשמור על רווחתם של בעלי חיים ולהבטיח תוצאות ניסוי אמינות. פרוטוקול זה נועד להתמודד עם האתגרים הטכניים הקשורים לזריקות תוך-תיקליות בעכברים יילודים, ובסופו של דבר להקל על התקדמות בתחום המחקר הנוירוגנטי שמטרתו לפתח התערבויות טיפוליות פוטנציאליות.

Introduction

הזרקה תוך-תאית (IT) היא הליך קליני נפוץ המשמש למתן תרופות, איסוף נוזל מוחי שדרתי ושמירה על לחץ תוך גולגולתי הן בחולים ילדים והן במבוגרים במרפאות ^1,2. מתן תרופות באמצעות הזרקה תוך-תאית הוא גישה יעילה להעלאת ריכוזי התרופות במערכת העצבים המרכזית (CNS) תוך מזעור החשיפה המערכתית. כתוצאה מכך, שיטה זו משפרת את היעילות הטיפולית ומפחיתה תופעות לוואי, במיוחד עבור תרופות רגישות לטמפרטורה וקצרות זמן^{מחצית חיים 3}.

במחקרים פרה-קליניים הבודקים תרופות וטיפולים חדשים באמצעות מודלים של מכרסמים, הכרחי להשתמש בשיטה אמינה של מתן תרופות המציעה דיוק רב יותר ויכולת שחזור תוצאה ^4,5. עבור מחקרים פרה-קליניים המעריכים טיפולים חדשים להפרעות נוירוגנטיות ונוירו-התפתחותיות, טיפול מוקדם הוא חיוני למחקרי הוכחת היתכנות ראשוניים מכיוון שהתערבויות מוקדמות יותר צפויות בדרך כלל להניב תוצאות חיוביות יותר ^6,7,8.

בהשוואה לזריקות תוך-מוחיות קונבנציונליות (ICV), זריקות IT נושאות סיכונים נמוכים משמעותית מכיוון שהן מייתרות את הצורך בחדירה ישירה דרך קליפת המוח. יתרון זה מפחית באופן משמעותי את הנזק הפוטנציאלי לרקמת קליפת המוח האזורית ולעצבים הסובבים אותה. יתר על כן, הזרקות IT מאפשרות להגדיל לפחות פי חמישה את נפח התרופות באמצעות זריקה אחת, מה שמשפר מאוד את ההיתכנות של מתן חוזר. עם זאת, בשל גודלם הקטן ואופיים השברירי של עכברים שזה עתה נולדו, ביצוע זריקות תוך-תיקליות בגורים שזה עתה נולדו הוא מאתגר מבחינה טכנית ודורש טכניקות מיוחדות, ציוד וטיפול קפדני.

מאמר זה מספק פרוטוקול מפורט עם הוראות שלב אחר שלב לביצוע זריקות intrathecal בגורי P1 שזה עתה נולדו. השיקולים המרכזיים ונוהלי מעבדה טובים מודגשים כאן כדי להבטיח את עקביות הניהול ואת הבטיחות והרווחה של בעלי החיים במהלך ההליך. על ידי ביצוע פרוטוקול זה, החוקרים יכולים לבצע ניסויים בביטחון בדיוק וביכולת שחזור תוך מזעור סיכונים פוטנציאליים או אי נוחות לבעלי החיים.

Protocol

הנהלים והפרוטוקולים המתוארים היו בהתאם להנחיות המפורטות במדריך המכונים הלאומיים לבריאות לטיפול ושימוש בחיות מעבדה. בנוסף, ההליכים קיבלו אישור מהוועדה לטיפול ושימוש בבעלי חיים בבית הספר לרפואה של אוניברסיטת ייל. עכברים ונקבות מסוג בר שזה עתה נולדו (WT) C57BL/6J שימשו למחקר שהוצג. בעלי החיים התקבלו ממקור מסחרי (ראו טבלת חומרים).

1. הכנת סביבת העבודה

1. הכינו תחילה את הפריטים הבאים: קרח רטוב להרדמה בהקפאה, כלוב ריק להפרדת הגורים מהסכר, מיקרוסקופ נתיחה, מקור אור, משטח נקי להנחת בעל החיים בזמן ההזרקה, צמר גפן, כרית חימום, מזרק 25/10 מיקרוליטר ומחט 34 גרם / 0.375 אינץ' / 12 DEG (ראה טבלת חומרים).
   הערה: הרדמה Cryo-רדמה עבור גורי עכברים באמצעות קרח רטוב היא צעד אופציונלי שנועד להקל על הטיפול, להפחית את תנועת הגורים ולמזער אי נוחות פוטנציאלית לבעלי חיים. שלב זה של הרדמה בהקפאה עשוי גם לספק את היתרון של הורדת לחץ תוך גולגולתי והפחתת סיבוכים הקשורים לנפח ^9,10.
2. העבירו את הגורים לכלוב נפרד הרחק מהסכר בזמן הטיפול בהם.
3. שקלו כל גור ותעדו את משקלו.
4. נגב את גב העכבר באמצעות גזה ואתנול. אשר את החלל הבין חולייתי או, לכל הפחות, את קו האמצע של תעלת עמוד השדרה (שאמור להופיע אדום בגורי P1) באמצעות המיקרוסקופ המנתח (וידאו משלים 1).

2. הליך הזרקה

1. כדי להרדים גור בודד, הניחו אותו בעדינות על מחסום עמיד למים כגון שרוול לטקס או רדיד אלומיניום על אמבט קרח למשך 3-5 דקות. חשוב להימנע מלהשאיר את בעל החיים על הקרח לתקופה ממושכת, שכן הדבר עלול להוות סיכונים פוטנציאליים לסיבוכים הקשורים להיפותרמיה, כולל פרפור חדרים, היפוקסיה של רקמות וחמצת מטבולית.
   הערה: משך הזמן של 3-5 דקות עשוי להשתנות בכל מקרה לגופו. להעריך את סימני ההרדמה, כגון חוסר תגובה צביטת בוהן, כדי לקבוע את משך הזמן המתאים.
2. בזמן שהחיה נמצאת על הקרח, טען את המזרק עם 10 μL של נוסחת התרופה, הכנת וירוסים, או לשלוט בנוזל עמוד השדרה המלאכותי וכו '.
   הערה: במהלך שלב הלמידה, שקול את האפשרות להזריק את אותו נפח של צבע ירוק מהיר 1% מעורב עם חומרי המשלוח (ראה טבלת חומרים). זה יכול לסייע בהדמיה של תהליך ההזרקה ולסייע בלמידה ושכלול של הטכניקה. גורים המוזרקים להם צבע ירוק מהיר או חומרים דומים צריכים לעבור המתת חסד זמן קצר לאחר ההזרקה בהתאם לפרוטוקול המאושר, שכן חומרים אלה עלולים לגרום לתגובות דלקתיות או לתופעות לוואי אחרות בבעלי חיים.
3. לאחר שהחיה מורדמת במלואה, כפי שאושר על ידי תנועת גוף מופחתת או נעדרת, מקמו בעדינות את הגורים מתחת למיקרוסקופ.
4. בעזרת האצבע המורה והאגודל השמאליים, יש למשש בזהירות את החלל הבין חולייתי לאורך קו האמצע, הממוקם בין חגורות האגן הדו-צדדיות (סרטון משלים 1). סובב מעט בעדינות את בסיס הזנב כדי לסייע בזיהוי קו האמצע של עמוד השדרה.
5. כוונן את שיפוע המחט לכיוון ראש החיה לפני ההזרקה.
6. הכנס בזהירות את המחט, הטה אותה מעט לזווית של 70°-80° בנקודה שבה השקע מצטלב, תוך הקפדה על כך שהמזרק נשאר מיושר עם מישור הקשת המרכזי. כאשר המחט יוצרת מגע עם העצם, להקטין בהדרגה את הזווית עד כ 30°, ולאחר מכן לקדם את המחט על 2 מ"מ לתוך החלל הבין חולייתי.
   הערה: היכולת של המחט להרים מעט את כל הגוף היא סימן לכניסה מוצלחת לחלל התוך-דוראלי.
7. להזריק באיטיות עד 10 μL נפח בתוך 50-60 שניות. שמור את המחט במקום במשך 10-20 שניות לאחר השלמת הלידה. משכו את המחט בסיבוב עדין כדי למנוע דליפה.
   הערה: המוח הקטן יהפוך לירוק לפני משיכת המחט. כמו כן, הדחיפה האיטית היא קריטית כדי למנוע עלייה בלחץ תוך גולגולתי הקשור ללידה ולמזער סיבוכים פוטנציאליים. בהתבסס על הניסיון שלנו עם זריקות ביותר מ-500 גורים, אספקת נפח של 10 μL במשך 50-60 שניות היא אופטימלית.

3. לאחר הזרקה

1. יש למרוח צמר גפן על אתר ההזרקה אם יש דליפה או דם.
   הערה: לא אמור להיות כזה ברוב המקרים. מניסיוננו, גורים שטופלו עם עקבות של דליפה או דם עדיין שמישים, אך ייתכן שיהיה צורך לשקול מינון מופחת של תרופות או טיפולים במהלך ניתוח הנתונים.
2. הניחו את הגור על כרית חימום והמתינו 10-15 דקות עד שהגורים יתאוששו לחלוטין ויתחממו מחדש. התבוננו היטב בגורים כדי לוודא שהם ערניים ונעים באופן פעיל לפני החזרתם לכלוב הביתי שלהם. התאוששות נאותה של עכבר מסומנת על ידי שחזור צבע העור הוורוד, תנועת גוף ספונטנית מוגברת ותגובות תגובה למגע.
3. החזירו את הגור לכלוב הביתי וודאו שהגור מכוסה כראוי במצעים, בקן או בשניהם. זה מבטיח שהגור יקבל את הטיפול האימהי הדרוש מהסכר.
4. להעריך את המראה הכללי ואת הפעילות מדי יום לפחות 3 ימים לאחר ההזרקה. הופעה חולנית ופעילות מופחתת עלולים להעלות את האפשרות לזיהום, תופעות לוואי הקשורות לטיפול או סיבוכים אחרים וכו'. במידת הצורך, יש להתייעץ עם רופא וטרינרי.

תוצאות

הזרקה אינטרתאית מוצלחת הביאה מיד להפצה נרחבת של התמיסה המנוהלת, אם כי החדירה התאית בפועל הייתה תלויה באופי התרופות והחומרים המועברים. במחקר הזה השתמשנו בירוק מהיר כדי להמחיש את התוצאות המיידיות לאחר הזרקה תוך-תאית (IT) בילודים מסוג בר (איור 1A-K) והשווינו זא...

Discussion

מתואר הליך שלב אחר שלב להזרקה תוך-תאית בעכברים יילודים (P1), וכתוצאה מכך הפצה נרחבת של תרופות במוחם. בהשוואה לשיטת ההזרקה התוך-מוחית הנפוצה למתן תרופות לעכברי יילודים, הכוללת פירסינג בקליפת המוח¹¹, הזרקה תוך-תאית מונעת פגיעה ישירה במוח העכבר של היילוד עקב חדירת מחט. בשל פולשניות ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Balance	Ohaus Corporation	30253017
C57BL/6J mice	The Jackson Laboratory	000664
Digital Microscope	RWD	DOM-1001
DPBS	ThermoFisher	14190144
Fast Green	Sigma	F7252-5G
Heating pad	RWD	69020
Needles	Hamilton	6PK (34/0.375”/4/12DEG)S
Syringe	Hamilton	1702RN
Syringe Filters	Sigma	SLGVM33RS