הזרקה תוך-תטית של עכבר שזה עתה נולד לצורך עריכת גנום ואספקת תרופות

Summary

הפרוטוקול הנוכחי מתווה הוראות שלב אחר שלב לביצוע זריקות תוך-תיקליות בעכברים יילודים לצורך עריכת גנים והעברת תרופות.

Abstract

הזרקה תוך-תאית היא הליך נפוץ הן במרפאות ילדים והן במרפאות מבוגרים, ומשמשת כאמצעי יעיל למתן תרופות וטיפולים. על ידי העברה ישירה של תרופות וטיפולים לנוזל השדרה של מערכת העצבים המרכזית, שיטה זו משיגה ריכוזי תרופות מקומיים גבוהים יותר תוך הפחתת תופעות לוואי מערכתיות בהשוואה למסלולים אחרים כגון זריקות תוך ורידי, תת עוריות או תוך שריריות. חשיבותו משתרעת מעבר להגדרות קליניות, שכן הזרקה תוך-תאית ממלאת תפקיד חיוני במחקרים פרה-קליניים המתמקדים בטיפול בהפרעות נוירוגנטיות במכרסמים ובבעלי חיים גדולים אחרים, כולל פרימטים שאינם אנושיים. עם זאת, למרות היישום הנרחב שלה, הזרקה intrathecal בצעירים, במיוחד גורי יילודים, מציב אתגרים טכניים משמעותיים בשל גודלם הקטן ואופיים השברירי. מתן מוצלח ואמין של זריקות תוך-תיקליות בעכברים שזה עתה נולדו דורש תשומת לב קפדנית לפרטים והתחשבות זהירה בגורמים השונים. לפיכך, יש צורך חיוני בפרוטוקול סטנדרטי שלא רק מספק הוראות, אלא גם מדגיש שיקולים טכניים מרכזיים ונוהלי מעבדה טובים כדי להבטיח עקביות פרוצדורלית, כמו גם את בטיחותם ורווחתם של בעלי החיים.

כדי לענות על צורך זה שלא נענה, אנו מציגים פרוטוקול מפורט ומקיף לביצוע זריקות תוך תאיות במיוחד בגורים שזה עתה נולדו ביום 1 שלאחר הלידה (P1). על ידי ביצוע ההוראות שלב אחר שלב, חוקרים יכולים לבצע בביטחון זריקות intrathecal בגורים יילודים, המאפשר משלוח מדויק של תרופות, אוליגוס אנטיסנס, וירוסים עבור החלפת גנים או טיפולים מבוססי עריכת גנום. יתר על כן, מודגשת החשיבות של הקפדה על שיטות מעבדה טובות כדי לשמור על רווחתם של בעלי חיים ולהבטיח תוצאות ניסוי אמינות. פרוטוקול זה נועד להתמודד עם האתגרים הטכניים הקשורים לזריקות תוך-תיקליות בעכברים יילודים, ובסופו של דבר להקל על התקדמות בתחום המחקר הנוירוגנטי שמטרתו לפתח התערבויות טיפוליות פוטנציאליות.

Introduction

הזרקה תוך-תאית (IT) היא הליך קליני נפוץ המשמש למתן תרופות, איסוף נוזל מוחי שדרתי ושמירה על לחץ תוך גולגולתי הן בחולים ילדים והן במבוגרים במרפאות ^1,2. מתן תרופות באמצעות הזרקה תוך-תאית הוא גישה יעילה להעלאת ריכוזי התרופות במערכת העצבים המרכזית (CNS) תוך מזעור החשיפה המערכתית. כתוצאה מכך, שיטה זו משפרת את היעילות הטיפולית ומפחיתה תופעות לוואי, במיוחד עבור תרופות רגישות לטמפרטורה וקצרות זמן^{מחצית חיים 3}.

במחקרים פרה-קליניים הבודקים תרופות וטיפולים חדשים באמצעות מודלים של מכרסמים, הכרחי להשתמש בשיטה אמינה של מתן תרופות המציעה דיוק רב יותר ויכולת שחזור תוצ....

Protocol

הנהלים והפרוטוקולים המתוארים היו בהתאם להנחיות המפורטות במדריך המכונים הלאומיים לבריאות לטיפול ושימוש בחיות מעבדה. בנוסף, ההליכים קיבלו אישור מהוועדה לטיפול ושימוש בבעלי חיים בבית הספר לרפואה של אוניברסיטת ייל. עכברים ונקבות מסוג בר שזה עתה נולדו (WT) C57BL/6J שימשו למחקר שהוצג. בעלי החיים התקבלו ממקור מסחרי (ראו טבלת חומרים).

1. הכנת סביבת העבודה

1. הכינו תחילה את הפריטים הבאים: קרח רטוב להרדמה בהקפאה, כלוב ריק להפרדת הגורים מהסכר, מיקרוסקופ נתיחה, מקור אור, משטח נקי להנחת בעל החיים בזמן ההזרקה, צמר גפן, כרית חימום, מזרק 25/10 מיקרוליטר ומחט 34 גרם / 0.375 אינץ' / 12 DEG (ראה טבלת חומרים

תוצאות

הזרקה אינטרתאית מוצלחת הביאה מיד להפצה נרחבת של התמיסה המנוהלת, אם כי החדירה התאית בפועל הייתה תלויה באופי התרופות והחומרים המועברים. במחקר הזה השתמשנו בירוק מהיר כדי להמחיש את התוצאות המיידיות לאחר הזרקה תוך-תאית (IT) בילודים מסוג בר (איור 1A-K) והשווינו זא.......

Discussion

מתואר הליך שלב אחר שלב להזרקה תוך-תאית בעכברים יילודים (P1), וכתוצאה מכך הפצה נרחבת של תרופות במוחם. בהשוואה לשיטת ההזרקה התוך-מוחית הנפוצה למתן תרופות לעכברי יילודים, הכוללת פירסינג בקליפת המוח¹¹, הזרקה תוך-תאית מונעת פגיעה ישירה במוח העכבר של היילוד עקב חדירת מחט. בשל פולשניות .......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Balance	Ohaus Corporation	30253017
C57BL/6J mice	The Jackson Laboratory	000664
Digital Microscope	RWD	DOM-1001
DPBS	ThermoFisher	14190144
Fast Green	Sigma	F7252-5G
Heating pad	RWD	69020
Needles	Hamilton	6PK (34/0.375”/4/12DEG)S
Syringe	Hamilton	1702RN
Syringe Filters	Sigma	SLGVM33RS