Inyección intratecal de ratón recién nacido para la edición del genoma y la administración de fármacos

Resumen

El presente protocolo describe las instrucciones paso a paso para realizar inyecciones intratecales en ratones neonatos para la edición de genes y la administración de fármacos.

Resumen

La inyección intratecal es un procedimiento comúnmente empleado tanto en clínicas pediátricas como para adultos, que sirve como un medio eficaz para administrar medicamentos y tratamientos. Al administrar directamente medicamentos y tratamientos en el líquido cefalorraquídeo del sistema nervioso central, este método logra concentraciones localizadas más altas del fármaco al tiempo que reduce los efectos secundarios sistémicos en comparación con otras vías, como las inyecciones intravenosas, subcutáneas o intramusculares. Su importancia se extiende más allá de los entornos clínicos, ya que la inyección intratecal desempeña un papel vital en los estudios preclínicos centrados en el tratamiento de trastornos neurogenéticos en roedores y otros animales grandes, incluidos los primates no humanos. Sin embargo, a pesar de su aplicación generalizada, la inyección intratecal en cachorros jóvenes, especialmente neonatos, plantea importantes desafíos técnicos debido a su pequeño tamaño y naturaleza frágil. La administración exitosa y confiable de inyecciones intratecales en ratones recién nacidos requiere una atención meticulosa a los detalles y una cuidadosa consideración de varios factores. Por lo tanto, existe una necesidad crucial de un protocolo estandarizado que no solo proporcione instrucciones, sino que también destaque las consideraciones técnicas clave y las buenas prácticas de laboratorio para garantizar la coherencia de los procedimientos, así como la seguridad y el bienestar de los animales.

Para abordar esta necesidad insatisfecha, presentamos un protocolo detallado y completo para realizar inyecciones intratecales específicamente en cachorros recién nacidos en el día postnatal 1 (P1). Siguiendo las instrucciones paso a paso, los investigadores pueden realizar inyecciones intratecales con confianza en cachorros neonatos, lo que permite la administración precisa de fármacos, oligonucleótidos antisentido y virus para tratamientos basados en el reemplazo de genes o la edición del genoma. Además, se enfatiza la importancia de adherirse a las buenas prácticas de laboratorio para mantener el bienestar de los animales y garantizar resultados experimentales confiables. Este protocolo tiene como objetivo abordar los desafíos técnicos asociados con las inyecciones intratecales en ratones neonatos, facilitando en última instancia los avances en el campo de la investigación neurogenética que tiene como objetivo desarrollar posibles intervenciones terapéuticas.

Introducción

La inyección intratecal (IT) es un procedimiento clínico común utilizado para administrar medicamentos, recolectar líquido cefalorraquídeo y mantener la presión intracraneal en pacientes pediátricos y adultos en clínicas ^1,2. La administración de medicamentos a través de una inyección intratecal es un enfoque eficaz para aumentar las concentraciones de medicamentos en el sistema nervioso central (SNC) y minimizar la exposición sistémica. En consecuencia, este método mejora la eficacia terapéutica y reduce los efectos secundarios, especialmente en el caso de los fármacos sensibles a la temperatura y de vida media corta³.

En los estudios preclínicos que prueban nuevos fármacos y tratamientos utilizando modelos de roedores, es imperativo emplear un método fiable de administración de fármacos que ofrezca mayor precisión y reproducibilidad de los resultados ^4,5. Para los estudios preclínicos que evalúan nuevos tratamientos para trastornos neurogenéticos y del neurodesarrollo, el tratamiento temprano es crucial para los estudios iniciales de prueba de concepto, ya que generalmente se predice que las intervenciones tempranas producirán resultados más favorables ^6,7,8.

En comparación con las inyecciones intracerebroventriculares (ICV) convencionales, las inyecciones IT conllevan riesgos significativamente menores, ya que evitan la necesidad de penetración directa a través de la corteza cerebral. Esta ventaja reduce sustancialmente el daño potencial al tejido cortical regional y a los nervios circundantes. Además, las inyecciones IT permiten al menos cinco veces más en el volumen administrable de medicamentos a través de una sola inyección, lo que mejora en gran medida la viabilidad de las administraciones repetidas. Sin embargo, debido al pequeño tamaño y la naturaleza frágil de los ratones recién nacidos, la realización de inyecciones intratecales en cachorros recién nacidos es técnicamente desafiante y requiere técnicas especializadas, equipos y un manejo meticuloso.

Este artículo proporciona un protocolo detallado con instrucciones paso a paso para realizar inyecciones intratecales en cachorros recién nacidos P1. Aquí se hace hincapié en las consideraciones clave y las buenas prácticas de laboratorio para garantizar la coherencia de la administración y la seguridad y el bienestar de los animales durante el procedimiento. Al seguir este protocolo, los investigadores pueden realizar experimentos con confianza con precisión y reproducibilidad, al tiempo que minimizan cualquier riesgo potencial o incomodidad para los animales.

Protocolo

Los procedimientos y protocolos descritos cumplían con las pautas descritas en la Guía de los Institutos Nacionales de Salud para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio. Además, los procedimientos recibieron la aprobación del Comité de Cuidado y Uso de Animales de la Facultad de Medicina de la Universidad de Yale. Para el estudio presentado se utilizaron ratones machos y hembras recién nacidos de tipo salvaje (WT) C57BL/6J. Los animales se obtuvieron de una fuente comercial (ver Tabla de Materiales).

1. Preparación del espacio de trabajo

1. Prepare primero los siguientes elementos: hielo húmedo para crioanestesia, una jaula vacía para separar a las crías de la madre, un microscopio de disección, una fuente de luz, una superficie limpia para colocar al animal durante la inyección, hisopos de algodón, una almohadilla térmica, una jeringa de 25/10 μL y una aguja de 34 G/ 0,375"/ 12 DEG (ver Tabla de materiales).
   NOTA: La crioanestesia para cachorros de ratón con hielo húmedo es un paso opcional destinado a facilitar el manejo, reducir el movimiento de los cachorros y minimizar las posibles molestias de los animales. Este paso de crioanestesia también puede proporcionar el beneficio de disminuir la presión intracraneal y reducir las complicaciones relacionadas con el volumen ^9,10.
2. Mueva a los cachorros a una jaula separada lejos de la madre mientras los manipula.
3. Pesa a cada cachorro y documenta su peso.
4. Limpie la parte posterior del mouse con gasa y etanol. Confirme el espacio intervertebral o, como mínimo, la línea media del canal espinal (que debe aparecer roja en las crías P1) utilizando el microscopio de disección (Video complementario 1).

2. Procedimiento de inyección

1. Para anestesiar a un solo cachorro, colóquelo suavemente sobre una barrera a prueba de agua, como una funda de látex o papel de aluminio, en un baño de hielo durante 3 a 5 minutos. Es importante evitar dejar al animal en el hielo durante un período prolongado, ya que hacerlo podría presentar riesgos potenciales de complicaciones relacionadas con la hipotermia, como fibrilación ventricular, hipoxia tisular y acidosis metabólica.
   NOTA: La duración de 3-5 min puede variar según el caso. Evalúe los signos de la anestesia, como la falta de respuesta a un pellizco en el dedo del pie, para determinar la duración adecuada.
2. Mientras el animal está en el hielo, cargue la jeringa con 10 μL de la formulación del medicamento, preparación de virus o líquido cefalorraquídeo artificial de control, etc.
   NOTA: Durante la fase de aprendizaje, considere la opción de inyectar el mismo volumen de colorante Fast Green mezclado al 1% con los materiales de entrega (consulte la Tabla de materiales). Esto puede ayudar a visualizar el proceso de inyección y ayudar a aprender y refinar la técnica. Los cachorros inyectados con Fast Green Dye o materiales similares deben ser sacrificados poco después de la inyección según el protocolo aprobado, ya que estos materiales pueden provocar reacciones inflamatorias u otros efectos secundarios en los animales.
3. Una vez que el animal esté completamente anestesiado, confirmado por la reducción o ausencia de movimiento corporal, coloque suavemente a los cachorros bajo el microscopio.
4. Con los dedos índice y pulgar izquierdos, palpar cuidadosamente el espacio intervertebral a lo largo de la línea media, situado entre las cinturas pélvicas bilaterales (Video complementario 1). Gira suavemente la base de la cola ligeramente para ayudar a identificar la línea media de la columna vertebral.
5. Ajuste el bisel de la aguja hacia la cabeza del animal antes de la inyección.
6. Inserte con cuidado la aguja, inclinándola ligeramente en un ángulo de 70°-80° en el punto donde se cruza la hendidura, asegurándose de que la jeringa permanezca alineada con el plano sagital central. A medida que la aguja hace contacto con el hueso, disminuya gradualmente el ángulo hasta aproximadamente 30°, luego avance la aguja unos 2 mm en el espacio intervertebral.
   NOTA: La capacidad de la aguja para levantar ligeramente todo el cuerpo es un signo de entrada exitosa en el espacio intradural.
7. Inyecte lentamente hasta 10 μL de volumen en 50-60 s. Mantenga la aguja en su lugar durante 10-20 segundos después de completar el parto. Retire la aguja con una rotación suave para evitar fugas.
   NOTA: El cerebelo se volverá verde antes de retirar la aguja. Además, el empuje lento es fundamental para evitar un aumento de la presión intracraneal asociado con el parto y para minimizar las posibles complicaciones. Basándonos en nuestra experiencia con inyecciones en más de 500 cachorros, lo óptimo es administrar un volumen de 10 μL durante 50-60 s.

3. Después de la inyección

1. Aplique un hisopo de algodón en el lugar de la inyección si hay alguna fuga o sangre.
   NOTA: No debería haber ninguno en la mayoría de los casos. Según nuestra experiencia, los cachorros tratados con rastros de fugas o sangre siguen siendo utilizables, pero puede ser necesario considerar una dosis reducida de medicamentos o tratamientos durante el análisis de datos.
2. Coloque al cachorro en una almohadilla térmica y espere de 10 a 15 minutos para que los cachorros se recuperen por completo y se vuelvan a calentar. Observe cuidadosamente a los cachorros para asegurarse de que estén alerta y se muevan activamente antes de devolverlos a su jaula de origen. La recuperación adecuada de un ratón está indicada por la restauración del color rosado de la piel, el aumento del movimiento corporal espontáneo y las reacciones de respuesta al tacto.
3. Vuelva a colocar al cachorro en la jaula de la casa y asegúrese de que el cachorro esté bien cubierto con ropa de cama, un nido o ambos. Esto asegura que el cachorro reciba los cuidados maternos necesarios por parte de la madre.
4. Evalúe el aspecto general y la actividad diaria durante al menos 3 días después de la inyección. Una apariencia enferma y una actividad reducida pueden aumentar la posibilidad de infección, efectos secundarios asociados al tratamiento u otras complicaciones, etc. Si es necesario, consulte con atención veterinaria.

Resultados

El éxito de la inyección intratecal dio lugar inmediatamente a la distribución generalizada de la solución administrada, aunque la penetración celular real dependía de la naturaleza de los fármacos y materiales administrados. En este estudio, utilizamos Fast Green para visualizar los resultados inmediatos después de la inyección intratecal (IT) en neonatos de tipo salvaje (Figura 1A-K) y lo comparamos con la inyección intracerebroventricular (ICV) ...

Discusión

Se describe un procedimiento paso a paso para la inyección intratecal en ratones neonatos (P1), lo que resulta en una distribución generalizada del fármaco en sus cerebros. En comparación con el método común de inyección intracerebroventricular para administrar medicamentos a ratones neonatos, que implica perforar la corteza cerebral¹¹, la inyección intratecal evita lesiones directas en el cerebro del ratón neonatal debido a la penetración de la aguja. Debido a su mínima invasividad, la...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Balance	Ohaus Corporation	30253017
C57BL/6J mice	The Jackson Laboratory	000664
Digital Microscope	RWD	DOM-1001
DPBS	ThermoFisher	14190144
Fast Green	Sigma	F7252-5G
Heating pad	RWD	69020
Needles	Hamilton	6PK (34/0.375”/4/12DEG)S
Syringe	Hamilton	1702RN
Syringe Filters	Sigma	SLGVM33RS