العزلة والتحديد السلوكي وتقييم الإمراضية للفطريات المسببة للأمراض الحشرية من حفار خشب الغابة

Summary

نقدم هنا بروتوكولا للحصول على الفطريات المسببة للأمراض الحشرية من حفار خشب الغابات وطريقة بديلة لتقييم أنشطتها المسببة للأمراض الحشرية باستخدام حشرة نموذج غمدية الأجنحة. هذه الطريقة فعالة ومريحة لاستكشاف الموارد الفطرية المسببة للأمراض الحشرية من الآفات الحشرية المملة للخشب في الغابات الطبيعية.

Abstract

يتسبب حفار خشب الغابات (FWB) في أضرار جسيمة للأشجار وخسائر اقتصادية في جميع أنحاء العالم. يعتبر إطلاق الفطريات المسببة للأمراض الحشرية (EPF) خلال فترة ظهور FWB بديلا مقبولا للمكافحة الكيميائية. ومع ذلك ، فقد تم استكشاف موارد EPF بشكل أقل بكثير بالنسبة ل FWBs ، على عكس الآفات الحشرية الزراعية. تقدم هذه الورقة بروتوكولا لاستكشاف موارد EPF من FWBs باستخدام مجموعات Monochamus alternatus البرية كمثال. في هذا البروتوكول ، فإن تعيين الفخاخ الطعم مع M. تضمن جاذبات Alternatus لمختلف السكان جمع عينات كافية مع أعراض العدوى الطبيعية ، خلال فترات ظهور الخنفساء. بعد تشريح التكامل بدقة ووضعها على وسط انتقائي ، تم عزل الأنواع الفطرية من كل جزء من أجسام الخنافس وتحديدها بناء على كل من السمات الجزيئية والمورفولوجية.

تم اعتماد العديد من الأنواع الفطرية على أنها EPFs طفيلية عن طريق إعادة إصابة M. alternatus السليم بمعلقات البوغ. لوحظت أنماطهم الظاهرية السلوكية على M. alternatus باستخدام المجهر الإلكتروني الماسح ومقارنتها كذلك مع تلك الموجودة في حشرة نموذج غمدية الأجنحة Tribolium castaneum. بالنسبة ل EPFs التي تقدم أنماطا ظاهرية متسقة للتطفل على كلا النوعين من الخنافس ، قم بتقييم أنشطتها على T. قدم Castaneum معلومات قيمة عن الفتك للدراسة المستقبلية على M. alternatus. ساعد هذا البروتوكول في اكتشاف EPF المبلغ عنه حديثا عن مجموعات M. alternatus في الصين ، والتي يمكن تطبيقها كنهج فعال لاستكشاف المزيد من موارد EPF من FWBs الأخرى.

Introduction

وقد أدى الدمار الذي تسببه الآفات الحشرية إلى خسائر إيكولوجية واقتصادية كبيرة في كل من النظم الإيكولوجية للغابات والزراعة. تعرض معظم الآفات الزراعية نفسها للأعداء الطبيعيين أو عوامل المكافحة الاصطناعية بينما تلحق الضرر بالنباتات المضيفة. بدلا من ذلك ، يكمل حفار خشب الغابات (FWB) تقريبا دوراتهم التنموية الكاملة داخل جذوع الأشجار المضيفة¹ ، مما يثير تحديات كبيرة لاستكشاف كائنات المكافحة الحيوية الفعالة من FWB في الحقل البري. والأسوأ من ذلك هو أن FWBs تحمل عددا كبيرا من مسببات الأمراض^{النباتية 2} أو لها علاقة حميمة مع مسببات الأمراض هذه كناقلات محتملة^{لها 3,4}<....

Protocol

1. عزل الفطريات من M. alternatus (الشكل 1)

1. اجمع عينة الخنفساء
   1. جمع الصنوبر مناشير الخنافس M. البديل باستخدام الفخاخ التجارية (انظر جدول المواد) الطعم مع الجاذبات قبل فترات الظهور المتوقعة لمجموعات الخنافس في غابات الصنوبر المصابة بشكل طبيعي.
      ملاحظة: في هذه الدراسة ، تم جمع الخنافس من خمس مناطق جغرافية في جنوب الصين (هوتشو / تشجيانغ ، ليانغشان / سيتشوان ، شيامن / فوجيان ، شاوقوان / قوانغدونغ ، يولين / قوانغشي). إعداد المصيدة من أعلى إلى أسفل هو كما يلي: قمة مستديرة (قطرها 50 سم) ، لوحة متقاطعة الشكل (عرضها 35 ....

النتائج

عزل وتحديد العزلات الفطرية من M. البديل
بمساعدة الفخاخ الجاذبة ، هناك عدد كبير (حوالي 500 خنفساء في المجموع) من M. تم جمع البديل من خمس مناطق جغرافية. تم اختيار جثث الخنفساء ذات الأعراض النموذجية للعدوى بالفطريات المسببة للأمراض الحشرية. بعد ذ?.......

Discussion

قد تطور المجموعات الجغرافية المختلفة من FWB تفاعلات متنوعة مع الفطريات الطبيعية المسببة للأمراض الحشرية ، بسبب التكيف البيئي طويل الأجل لأنواع EPF مع عوامل المناخ المحلية والسكان الوراثيين المحددين للحشرة المضيفة^44,45. يساعد توسيع مواقع أخذ.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL, 2 mL centrifuge tubes	Biosharp	BS-15-M
10 µL pipet tips	Sangon Biotech	F601216
10 µL, 20 µL, 100 µL, 200 µL, 1,000 µL pipettes	Rainin
1,000 µL pipet tips	Sangon Biotech	F630102
2 mL cryogenic vials	Corning	430659
20x PBS buffer	Sangon Biotech	B548117-0500
200 µL pipet tips	Sangon Biotech	F601227
2,000 bp maker	TaKaRar	SD0531
50 mL tubes	Nest	602052
50% glutaraldehyde solution	Sangon Biotech	G916054
50x TAE buffer	Sangon Biotech	B548101
6x loading buffer	TaKaRar	SD0503
Agarose	Sangon Biotech	A610013
Anhydrous ethanol	Jkchemical	LB10V37
Biochemistry Cultivation Cabinet	Shanghaiyiheng	LRH-250F
Chloroform	Juhua	61553
Commercial beetle traps	FEIMENGDI	BF-8	www.yinyouji.com
Gel imager	Bio-Rad	GelDoc XR+
Glycerol	Sangon Biotech	A600232
High speed refrigerated centrifuge	Sigma	D-37520
High-Pressure Steam Sterilization Pot	Mettler Toledo	JA5003
Isopropyl alcohol	General-reagent	G75885B
Nucleic acid dye	Sangon Biotech	A616696
Optical Microscope, OM	Leica	DM2000
Parafilm	Parafilm	PM996
PCR meter	Heal Force	Trident960
Penicillin G	Marklin	GB15743
Potato dextrose agar, PDA	Oxoid	CM0139
Potato dextrose broth, PDB	Solarbio	P9240
Primers	Sangon Biotech	/
Primers Taq	TaKaRar	RR902A
Rapid Fungi Genomic DNA Isolation Kit	Sangon Biotech	B518229
Scanning Electron Microscope, SEM	Hitachi	S-3400N
Streptomycin	Marklin	S6153
Tetracycline	Marklin	T829835
Tween-80	Marklin	T6336
Vacuum freeze dryer	Yamato	DC801
Vortex Shaker	HLD	WH-861
β-Mercaptoethanol	Marklin	M6230