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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

Qui presentiamo un protocollo per ottenere funghi entomopatogeni da una piralide forestale e un modo sostitutivo per valutare le loro attività entomopatogene utilizzando un insetto modello di Coleotteri. Questo metodo è efficiente e conveniente per esplorare le risorse fungine entomopatogene da insetti nocivi che perforano il legno nelle foreste naturali.

Abstract

I piralidi forestali causano gravi danni agli alberi e perdite economiche in tutto il mondo. Il rilascio di funghi entomopatogeni (EPF) durante il periodo di emergenza FWB è considerato un'alternativa accettabile al controllo chimico. Tuttavia, le risorse EPF sono state significativamente meno esplorate per i FWB, a differenza degli insetti nocivi agricoli. Questo articolo presenta un protocollo per esplorare le risorse EPF dai FWB utilizzando come esempio le popolazioni selvatiche di Monochamus alternatus . In questo protocollo, l'assegnazione delle trappole innescate con M. Attrattivi alternatus a diverse popolazioni hanno garantito la raccolta di campioni adeguati con sintomi naturali di infezione, durante i periodi di emergenza del coleottero. Dopo aver sezionato finemente i tegumenti e averli posizionati su un mezzo selettivo, le specie fungine sono state isolate da ogni parte dei corpi dei coleotteri e identificate in base ai tratti molecolari e morfologici.

Diverse specie fungine sono state certificate come EPF parassite attraverso la reinfezione di M. alternatus sano con sospensioni di spore. I loro fenotipi comportamentali su M. alternatus sono stati osservati utilizzando la microscopia elettronica a scansione e ulteriormente confrontati con quelli sull'insetto modello di coleotteri Tribolium castaneum. Per gli EPF che presentano fenotipi di parassitismo coerenti su entrambe le specie di coleotteri, valutazione delle loro attività su T. castaneum ha fornito preziose informazioni sulla letalità per futuri studi su M. alternatus. Questo protocollo ha aiutato la scoperta di EPF recentemente segnalati sulle popolazioni di M. alternatus in Cina, che potrebbe essere applicato come approccio efficiente per esplorare più risorse di EPF da altri FWB.

Introduzione

La devastazione causata dagli insetti nocivi ha portato a grandi perdite ecologiche ed economiche sia negli ecosistemi forestali che in quelli agricoli. La maggior parte dei parassiti agricoli si espone a nemici naturali o agenti di controllo artificiali danneggiando le piante ospiti. Invece, i piralidi del legno forestale (FWB) completano quasi completamente i loro cicli di sviluppo all'interno dei tronchi degli alberi ospiti1, il che solleva grandi sfide per esplorare organismi di biocontrollo efficienti da FWB in campo selvatico. Quel che è peggio è che i FWB trasportano un gran numero di fitopatogeni2 o hanno una relazione intima con questi patogeni come potenziali vettori 3,4, amplificando notevolmente gli effetti negativi dei FWB sulla salute delle foreste. L'uso eccessivo di insetticidi chimici può alleviare la gravità dei FWB, ma l'emergere di resistenza insetticida 5,6 ne limita l'applicazione ambientale. In alcuni casi, insetti parassitoidi, artropodi predatori e microbi entomopatogeni sono stati rilasciati come agenti di biocontrollo nelle aree di distribuzione di FWB7 e si sono dimostrati alternative efficienti ed economicamente accettabili al controllo chimico 8,9,10.

Si ritiene che i funghi entomopatogeni (EPF) abbiano il vantaggio di controllare la FWB rispetto alla maggior parte degli altri gruppi microbici. Le loro spore possono essere trasportate da insetti ospiti e fissate stabilmente sulle superfici del corpo attraverso la penetrazione nella cuticola o nel tegumento 8,11. L'EPF presenta anche un'eccellente adattabilità agli stress ambientali e alcune specie colonizzano bene il tessuto degli alberi come endofiti12,13, facilitandone la crescita, la sopravvivenza e la trasmissione. Tuttavia, rispetto a quello delle industrie agricole, la diversità delle specie di EPF utilizzate negli ecosistemi forestali naturali è notevolmente limitata 14,15,16. La Beauveria bassiana (ceppo PPRI 5339) si è dimostrata il ceppo più promettente per promuovere un programma IPM per i punteruoli di eucalipto in Sudafrica17 e la combinazione di due promettenti isolati di B. La bassiana ha fornito un'opportunità per il controllo microbico pratico del punteruolo rosso delle palme, Rhynchophorus ferrugineus, in diverse fasi di vita nei campi di palme18. Oltre a Beauveria e al ben noto Metarhizium, altri generi EPF dell'ordine Hypocreales, in particolare le specie di Lecanicillium (molte delle quali sono ora classificate nel genere Akanthomyces19,20), hanno mostrato una forte patogenicità e un alto potenziale nella gestione dei parassiti forestali, come l'afide del cipresso in Cile21.

Il coleottero segantino dei pini Monochamus alternatus è un famigerato parassita delle foreste di pini in Cina e nei paesi limitrofi, che si insinua nei rami e nei tronchi dei pini per impedire il trasporto di sostanze nutritive e acqua 22,23,24. Inoltre, M. alternatus promuove anche l'invasione del nematode del legno di pino (Bursaphelenchus xylophilus, PWN) come suo principale coleottero vettore. Un'altra specie congenere del coleottero, M. galloprovincialis, ha diffuso il PWN in diversi paesi europei negli ultimi anni25. Ricerche precedenti hanno riportato diversi generi di EPF naturali da Monochamus spp., come Beauveria, Metarhizium e Lecanicillium (Verticillium, un ex nome di Lecanicillium), in Spagna, Giappone e nelle province di Anhui/Zhejiang in Cina 26,27,28,29. Tuttavia, queste raccolte di EPF sembrano essere comunemente limitate in una certa località, rispetto all'ampia presenza di coleotteri Monochamus nei campi naturali. Poiché il coleottero M. alternatus ha un'ampia distribuzione geografica in Cina, potrebbe essere considerato un piralide rappresentativo per esplorare più potenziali EPF in diverse popolazioni.

Nel presente protocollo, introduciamo una procedura specifica per esplorare gli EPF provenienti da diverse popolazioni geografiche di M. alternatus nella Cina meridionale. Questo protocollo utilizza un modello di coleottero come sostituto per eseguire saggi di entomopatogenicità, a condizione che la specie fungina testata abbia un fenotipo comportamentale coerente su entrambe le specie di coleotteri. Questo protocollo può anche fornire informazioni sull'esplorazione dell'EPF per altri piralidi forestali, in cui la diversità delle loro specie fungine entomopatogene è sottostimata o meno studiata.

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Protocollo

1. Isolamento di funghi da M. alternatus (Figura 1)

  1. Raccogli il campione di scarabeo
    1. Raccogli i pini scarabei segantino M. alternatus utilizzando trappole commerciali (vedi Tabella dei materiali) innescati con attrattivi prima dei periodi di emergenza previsti delle popolazioni di coleotteri nelle foreste di pini naturalmente infette.
      NOTA: In questo studio, i coleotteri sono stati raccolti da cinque regioni geografiche della Cina meridionale (Huzhou/Zhejiang, Liangshan/Sichuan, Xiamen/Fujian, Shaoguan/Guangdong, Yulin/Guangxi). La regolazione della trappola dall'alto verso il basso è la seguente: un piano rotondo (50 cm di diametro), un pannello a forma di croce (35 cm di larghezza e 66 cm di lunghezza), un imbuto (35,5 cm di diametro rotondo superiore e 5,5 cm di diametro rotondo inferiore), una tazza di raccolta (10,5 cm di diametro e 26,5 cm di lunghezza). I volatili dell'ospite (ad esempio, etanolo e α-pinene) e il feromone di aggregazione (2-undecilossi-1-etanolo) sono usati come esca30.
    2. Etichettare il campione prima di trasferirlo in laboratorio. Metti ogni scarabeo in tubi sterilizzati individuali con ramoscelli freschi. Sostituisci i ramoscelli con quelli freschi ogni 2 giorni.
    3. Allevare i coleotteri vivi a 25 ± 1 °C in un'incubatrice non umidificata (cicli 16-8 L/D) e osservarli quotidianamente.
    4. Registrare campioni che mostrano una diminuzione dell'alimentazione e della mobilità. Trasferisci M morto. alternati che diventano induriti e rigidi alle camere umide per osservare la crescita di miceli fungini e conidi.
      NOTA: Una volta infettati da funghi entomopatogeni, i coleotteri hanno mostrato una diminuzione dell'alimentazione e della mobilità nella fase iniziale dell'infezione31,32. Dopo la morte, i loro corpi si indurirono e si irrigidirono, con miceli e conidi che comparvero diversi giorni dopo la conservazione in una camera umida33.
    5. Conservare i cadaveri di coleotteri con infezioni fungine a 4 °C per un uso futuro. Per seguire questo protocollo, elaborare i campioni immediatamente entro poche ore per evitare la contaminazione con funghi più saprotrofi.
  2. Preparazione del terreno di coltura
    1. Aggiungere 39 g di destrosio di patate in polvere di agar (PDA) in 1 L di acqua pura e sterilizzare in autoclave per 30 minuti a 121 °C.
    2. Raffreddare a una temperatura operativa (~50 °C), aggiungere 0,05 g di streptomicina, 0,05 g di penicillina G e 0,05 g di tetraciclina e agitare per distribuire il terreno.
    3. Impiattare il terreno in piastre di Petri sotto un banco pulito e utilizzare dopo la solidificazione.
      NOTA: Il terreno PDA con antibiotici viene utilizzato per l'isolamento dai coleotteri, che impedisce la crescita dei batteri senza influire sulla crescita dei funghi durante l'isolamento. Tuttavia, il terreno PDA senza antibiotici viene utilizzato per la coltivazione e la conservazione quotidiana.
    4. Mettere 35 g di brodo di destrosio di patate (PDB) in polvere in 1 L di ddH2O e sterilizzare in autoclave per 30 minuti a 121 °C. Raffreddarlo per l'uso.
  3. Dissezione del campione di coleottero con sintomi di infezione fungina
    1. Preparare forbici, bisturi e spille per insetti sterilizzati; Quindi, lavorare sotto un banco pulito con un bruciatore ad alcool.
      NOTA: L'uso degli strumenti di dissezione può essere regolato in base alle preferenze personali. I perni per insetti sono più affilati degli aghi da dissezione standard e diverse specifiche possono soddisfare la necessità di dissezione.
    2. Sezionare i tegumenti del corpo dello scarabeo con strumenti in piastre di Petri sterili e monouso. Fare attenzione a evitare possibili danni ai tessuti dell'intestino medio e posteriore che possono trasudare contenuto interno.
    3. Dividi i corpi degli scarafaggi nelle posizioni principali come segue: antenne, testa, torace, addome, ali (ogni paio) e zampe.
  4. Depurazione dei funghi
    1. Taglia i tegumenti di ogni posizione in piccoli pezzi con le forbici. Premere delicatamente la superficie esterna sulla superficie delle piastre PDA con antibiotici.
      NOTA: Assicurarsi che i miceli fungini sui tegumenti siano stati inoculati nella piastra.
    2. Sigillare accuratamente con parafilm e coltivare in un'incubatrice a 25 ± 1 °C fino a quando i tessuti non sono completamente coperti dal micelio.
    3. Trasferire singole colonie in base alle proprietà fenotipiche (colore, forma) su un nuovo PDA con antibiotici per coltura a 25 ± 1 °C.
    4. Ripetere il passaggio 1.4.3 due o tre volte sul PDA con antibiotici fino a quando le colonie pure non vengono isolate separatamente.
      NOTA: Se più ceppi fungini crescono nelle piastre originali, scegli il micelio con precisione per facilitare lo smistamento di più specie fungine.
  5. Conservazione degli isolati fungini
    1. Trasferimento di blocchi di agar (~5 mm di diametro) dalle colonie alle nuove piastre PDA.
    2. Coltura in incubatrice a 25 ± 1 °C per 1-2 settimane.
    3. Mettere in frigorifero a 4 °C per la conservazione quotidiana per un ulteriore utilizzo.
    4. Inoculare i ceppi fungini in 50 mL di PDB sterile in un pallone da 250 mL, agitando a 180 giri/min/min a 25 °C per 5-7 giorni.
    5. Raccogliere 1 ml di micelio fungino appena coltivato e sospenderlo in 1 ml di glicerolo sterilizzato al 20% in provette sterili per congelatore da 2 ml (la concentrazione finale di glicerolo è del 10%).
    6. Sigillare le provette con parafilm e preraffreddarle a -20 °C e -40 °C. Quindi, mantenere i tubi a -80 °C come scorte.

2. Identificazione molecolare e morfologica di isolati fungini

  1. Estrazione di DNA genomico fungino
    1. Coltura di funghi in PDB come descritto al punto 1.5.4.
    2. Raccogli il micelio e filtralo per separarlo dal PDB. Omogeneizzare in azoto liquido utilizzando un mortaio e un pestello preraffreddati.
    3. Estrarre il DNA genomico utilizzando il kit di isolamento del DNA genomico per funghi secondo le istruzioni del produttore (vedere la tabella dei materiali).
  2. Amplificazione PCR e sequenziamento del DNA
    1. Preparare la miscela di reazione PCR come segue: 25 μl di Taq DNA polimerasi, 1 μl di stampo, 2 μl di primer diretti e inversi e ddH2O per un volume totale di 50 μl.
    2. Amplificare la regione rDNA-ITS del campione di DNA utilizzando le coppie di primer ITS1 e ITS434 (cfr. tabella 1) con la seguente procedura: denaturazione iniziale a 95 °C per 4 min, seguita da 35 cicli di denaturazione a 94 °C per 60 s, ricottura a 58 °C per 60 s, allungamento a 72 °C per 2 min, e un allungamento finale a 72 °C per 10 min.
    3. Elettroforesi di prodotti amplificati utilizzando gel di agarosio all'1,5% a 100 V, 100 mA.
    4. Sequenziare la PCR.
    5. Allinea la sequenza utilizzando Clustal X2.0 e MEGA 6.0.
      NOTA: Durante l'allineamento della sequenza, i siti con allineamento ambiguo vengono esclusi e gli spazi vuoti vengono trattati come dati mancanti.
    6. Confrontare la sequenza ottenuta con quelle presenti nel database di sequenze ITS in GenBank utilizzando BLAST sul sito web del National Center for Biotechnology Information (NCBI). Identificare preliminarmente le informazioni sulle specie del ceppo fungino.
  3. Identificazione morfologica
    1. Usa una fotocamera per catturare la morfologia della colonia fungina pura matura sia sul lato anteriore che su quello posteriore delle piastre PDA.
    2. Prelevare i conidi dalle colonie fungine di coltura pura con un ago da inoculazione e trasferirli su un vetrino con una goccia di acqua sterile.
    3. Tenere il vetrino coprioggetti e appoggiarlo lentamente con un angolo di ~45°, in modo che il vetrino coprioggetti possa coprire il campione senza bolle.
    4. Tagliare un blocco di agar da 5 mm2 con un bisturi dalle colonie ai margini della colonia fungina e trasferirlo su un vetrino pulito con una goccia di acqua sterile. Separa con cura i funghi con un ago sottile per vedere strutture specifiche.
    5. Ripetere il passaggio 2.3.3.
    6. Osserva la forma asessuata dei funghi al microscopio ottico (OM), compresa la forma, la trasparenza e la postura delle ife, dei conidiofori, dei fialidi e dei conidi. Registra e misura la forma e le dimensioni delle caratteristiche asessuate per distinguere i diversi isolati fungini l'uno dall'altro.
      NOTA: Per massimizzare la capacità di osservare le strutture fungine, utilizzare coloranti e mezzo di montaggio35.

3. Induzione dei sintomi dell'infezione fungina su M. alternatus per osservarne i fenotipi comportamentali

  1. Preparazione della sospensione conidiale
    1. Preparare 0,01% Tween-80 con acqua pura e sterilizzare in autoclave per 25 minuti a 121 °C. Utilizzare dopo il raffreddamento.
    2. Aggiungere una quantità appropriata di piccole perle di vetro sterili e una soluzione di Tween-80 allo 0,01% in una provetta da centrifuga da 2 mL.
    3. Raschiare le colonie fungine nel tubo e agitarlo a sufficienza con uno scuotitore a vortice fino a quando la colonia non si è disgregata. Filtrare attraverso due strati di garza per rimuovere il micelio.
      NOTA: L'agitazione viene eseguita per garantire la sospensione della conidiospora in una soluzione di Tween-80 allo 0,01%.
    4. Contare il numero di spore sotto l'OM con un emocitometro, regolare a 1 × 108 conidiale/mL con Tween-80 sterile allo 0,01% e mantenere a 4 °C per l'uso.
  2. Preparazione dei coleotteri
    1. Sterilizzare in autoclave i rametti di pino (all'incirca della stessa dimensione) e asciugarli in forno (~ 60 °C).
    2. Conserva i M. raccolti sul campo. alternatus adulti con ramoscelli di pino in incubatrice a 25 ± 1 °C.
    3. Far morire di fame i coleotteri per 24 ore e sterilizzare la superficie dei coleotteri con candeggina, etanolo e acqua distillata [10:10:80 (v:v)] prima dell'uso.
  3. Induzione dell'infezione fungina
    1. Lavorare sotto un banco pulito, immergere i ramoscelli di pino in sospensione coniidale per 10 s e asciugarli all'aria.
    2. Immergere i coleotteri in sospensione coniidale per 10 s, quindi trasferirli in provette sterili da 50 mL (uno scarabeo e un ramoscello per provetta). Sostituisci i ramoscelli con quelli nuovi ogni 2 giorni.
    3. Per il controllo negativo, sostituire la sospensione conidiale in una soluzione sterile di Tween-80 allo 0,01%. Fai cinque repliche per ogni ceppo fungino e gruppo di controllo.
    4. Valuta l'attività dei coleotteri in base alla quantità di escrementi prodotti sui ramoscelli di pino. Quando l'alimentazione cessa, considerali morti.
    5. Trasferire i coleotteri morti in nuove provette sterili da 50 ml e posizionare un pezzo di cotone umido sterile. Incubare a 25 ± 1 °C.
      NOTA: Il cotone bagnato viene utilizzato per mantenere l'umidità, poiché la crescita dei funghi richiede un'umidità adeguata, ma non troppa.
    6. Osserva e fotografa il cambiamento della superficie del coleottero alla stessa ora ogni giorno.
  4. Ri-isolamento e conferma delle specie fungine
    1. Fino a quando non compaiono fenotipi chiari di infezione fungina sulla superficie dei coleotteri, prelevare il micelio da diversi tessuti individualmente in nuove piastre PDA.
    2. Coltivare a 25 ± 1 °C e osservare per assicurarsi che la morfologia sia coerente con quella dei funghi inoculati.
  5. Trattamento del coleottero modello
    1. Ripetere i passaggi 3.2.1-3.3.6 sul modello di coleottero Tribolium castaneum, utilizzando la crusca di frumento come alimento, e sterilizzare la crusca di frumento con luce UV.
    2. Tocca leggermente i coleotteri con una pinzetta sterile. Supponi che siano morti se non c'è risposta.

4. Confermare i fenotipi di infezione dei funghi su M. alternatus e coleottero modello

  1. Preparazione del campione per l'osservazione
    1. Sezionare il M infetto. cadaveri alternatus con cura come al punto 1.3.
    2. Scegli T. corpi castani con evidenti sintomi di infezione fungina.
    3. Tagliare i tappi del disco da 5 mm di quattro colonie fungine mature che crescono su PDA.
  2. Pretrattamento del campione
    1. Immergere i tappi, i tessuti di coleottero infetti e i corpi in glutaraldeide preraffreddata al 2,5% a 4 °C per 2 giorni.
    2. Lavare i campioni tre volte in tampone fosfato allo 0,1% (pH 7,2-7,4) per 5 minuti e disidratarli in etanolo al 30%, 50%, 70%, 80%, 90%, 95%, 100% per 10 minuti.
    3. Asciugare i campioni in un liofilizzatore sottovuoto.
      NOTA: L'intero processo di pretrattamento deve essere accurato, compreso il taglio, l'ammollo, la disidratazione, il lavaggio e l'asciugatura, per evitare danni al campione.
  3. Osservazione al microscopio elettronico a scansione (SEM)
    1. Rivestire i campioni pretrattati con platino utilizzando un rivestimento sputter e osservare al microscopio elettronico a scansione36.
    2. Registrare le caratteristiche morfologiche delle ife e dei conidi che crescono su PDA, M. alternatus e corpi modello di coleottero.
    3. Confrontare se i risultati sono coerenti con quelli dell'OM nel passaggio 2.3.

5. Valutazione dell'attività entomopatogena

  1. Preparazione della sospensione conidiale
    1. La preparazione della sospensione conidiale è la stessa dei passaggi 3.1.1-3.1.4.
  2. Pretrattamento del modello di coleottero
    1. Coltiva, nutri, sterilizza e affama T. castaneo come nel passaggio 3.5.1.
    2. Sterilizzare la crusca di frumento mediante UV e posizionare lo stesso peso su piastre di Petri sterili.
  3. Test di attività entomopatogena
    1. Trattare la crusca di frumento con la sospensione conidiale e asciugarla all'aria sotto un banco pulito a temperatura ambiente.
    2. Immergere T. coleotteri castaneum in sospensione coniidale per 10 s e trasferirli in una piastra di Petri (n = 20 in ciascuna piastra di Petri). Sostituire la crusca di frumento nuova con lo stesso trattamento conidiali ogni 4 giorni.
    3. Per il controllo negativo, applicare solo una soluzione sterile di Tween-80 allo 0,01%.
      NOTA: Mettere da parte almeno tre repliche per ogni gruppo di trattamento e per il controllo.
    4. Conta i coleotteri morti ogni giorno.
      NOTA: Toccare leggermente i coleotteri con una pinzetta sterile. Supponi che siano morti se c'è una mancanza di risposta.
  4. Analisi filogenetica multigenica
    1. Estrarre il DNA genomico fungino entomopatogeno come descritto al punto 2.1.
      NOTA: L'identificazione multigenica viene condotta per gli EPF parassiti che mostrano fenotipi di infezione significativi e forti attività entomopatogene contro il coleottero modello.
    2. Amplificare i seguenti geni, tra cui una regione che abbraccia il gene nucleare ribosomiale SSU34, un segmento del gene della subunità grande rRNA (LSU37,38), parte del gene del fattore di allungamento 1-alfa (tef-1α39), la seconda più grande sequenza di subunità della RNA polimerasi ІІ (rpb240) e parte della β-tubulina41 utilizzando le coppie di primer NS1/NS4, LR7/LROR, EF-983F/EF-2218R, RPB2-5'F/RPB2-5'R e TUB1/TUB22 (vedi Tabella 1), rispettivamente.
      1. Preparare la miscela di reazione PCR come al punto 2.2.1.
      2. Effettuare l'amplificazione come segue: denaturazione iniziale a 95 °C per 4 min, seguita da 35 cicli (tef-1α, rpb2, SSU), 38 cicli (LSU) o 39 cicli (β-tubulina) di denaturazione a 94 °C per 60 s, ricottura a 47 °C per 60 s (LSU), 55 °C per 60 s (tef-1α), 54 °C per 40 s (β-tubulina) e 50 °C per 30 s (rpb2, SSU), allungamento a 72 °C per 1 min e allungamento finale a 72 °C per 10 min.
    3. Sequenziare e allineare seguendo gli stessi passaggi mostrati nei passaggi 2.2.4-2.2.5.
    4. Eseguire l'analisi filogenetica mediante MEGA 6.0 sulla base del metodo di massima verosimiglianza (ML)42.

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Risultati

Isolamento e identificazione di isolati fungini da M. alternatus
Con l'aiuto di trappole attrattive, un gran numero (circa 500 coleotteri in totale) di M. Gli alternati sono stati raccolti da cinque regioni geografiche. Sono stati raccolti cadaveri di coleotteri con sintomi tipici di infezione da funghi entomopatogeni; Quindi, i tegumenti corporei di ogni coleottero sono stati sezionati in diverse posizioni come descritto nella fas...

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Discussione

Diverse popolazioni geografiche di FWB possono sviluppare varie interazioni con i funghi entomopatogeni naturali, a causa dell'adattamento ambientale a lungo termine delle specie di EPF ai fattori climatici locali e alla specifica popolazione genotipica dell'insetto ospite44,45. L'espansione dei siti di campionamento a più regioni di presenza di insetti aiuta ad aumentare la possibilità di acquisire diversi ceppi o specie di EP...

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Divulgazioni

Gli autori dichiarano di non avere conflitti di interesse.

Riconoscimenti

Questa ricerca è stata supportata dal National Key Research and Development Program of China (2021YFC2600100) e dalla Natural Science Foundation della provincia di Zhejiang (LY21C040001).

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Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
1.5 mL, 2 mL centrifuge tubesBiosharpBS-15-M
10 µL pipet tipsSangon BiotechF601216
10 µL, 20 µL, 100 µL, 200 µL, 1,000 µL pipettesRainin
1,000 µL pipet tipsSangon BiotechF630102
2 mL cryogenic vialsCorning430659
20x PBS bufferSangon BiotechB548117-0500
200 µL pipet tipsSangon BiotechF601227
2,000 bp makerTaKaRarSD0531
50 mL tubesNest602052
50% glutaraldehyde solutionSangon BiotechG916054
50x TAE bufferSangon BiotechB548101
6x loading bufferTaKaRarSD0503
AgaroseSangon BiotechA610013
Anhydrous ethanolJkchemicalLB10V37
Biochemistry Cultivation CabinetShanghaiyihengLRH-250F
ChloroformJuhua61553
Commercial beetle trapsFEIMENGDIBF-8www.yinyouji.com
Gel imagerBio-RadGelDoc XR+
GlycerolSangon BiotechA600232
High speed refrigerated centrifugeSigmaD-37520
High-Pressure Steam Sterilization PotMettler ToledoJA5003
Isopropyl alcoholGeneral-reagentG75885B
Nucleic acid dyeSangon BiotechA616696
Optical Microscope, OMLeicaDM2000
ParafilmParafilmPM996
PCR meterHeal ForceTrident960
Penicillin GMarklinGB15743
Potato dextrose agar, PDAOxoidCM0139
Potato dextrose broth, PDBSolarbioP9240
PrimersSangon Biotech/
Primers TaqTaKaRarRR902A
Rapid Fungi Genomic DNA Isolation KitSangon BiotechB518229
Scanning Electron Microscope, SEMHitachiS-3400N
StreptomycinMarklinS6153
TetracyclineMarklinT829835
Tween-80MarklinT6336
Vacuum freeze dryerYamatoDC801
Vortex ShakerHLDWH-861
β-MercaptoethanolMarklinM6230

Riferimenti

  1. Hajek, A. E., Bauer, L. S. Microbial control of wood-boring insects attacking forest and shade trees. Field Manual of Techniques in Invertebrate Pathology. 10, 505-525 (2007).
  2. Linnakoski, R., Forbes, K. M. Pathogens-the hidden face of forest invasions by wood-boring insect pests. Frontiers in Plant Science. 10, 90(2019).
  3. Hulcr, J., Dunn, R. R. The sudden emergence of pathogenicity in insect-fungus symbioses threatens naive forest ecosystems. Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences. 278 (1720), 2866-2873 (2011).
  4. Humble, L. M., Allen, E. A. Forest biosecurity: alien invasive species and vectored organisms. Canadian Journal of Plant Pathology. 10, 90(2006).
  5. Ahmed, R., Freed, S. Biochemical resistance mechanisms against chlorpyrifos, imidacloprid and lambda-cyhalothrin in Rhynchophorus ferrugineus (Olivier) (Coleoptera: Curculionidae). Crop Protection. 143, 105568(2021).
  6. Al-Ayedh, H., Hussain, A., Rizwan-Ul-Haq, M., Al-Jabr, A. M. Status of insecticide resistance in field-collected populations of Rhynchophorus ferrugineus (Olivier) (Coleoptera: Curculionidae). International Journal of Agriculture and Biology. 18 (01), 103-110 (2015).
  7. Garcia, F. R. M., Ovruski, S. M., Suarez, L., Cancino, J., Liburd, O. E. Biological control of Tephritid fruit flies in the Americas and Hawaii: a review of the use of parasitoids and predators. Insects. 11 (10), 662(2020).
  8. Lacey, L. A., Shapiro-Ilan, D. I. Microbial control of insect pests in temperate orchard systems: potential for incorporation into IPM. Annual Review of Entomology. 53, 121-144 (2008).
  9. Wang, Z. Z., Liu, Y. Q., Shi, M., Huang, J. H., Chen, X. X. Parasitoid wasps as effective biological control agents. Journal of Integrative Agriculture. 18 (4), 705-715 (2019).
  10. Islam, W., et al. Insect-fungal-interactions: a detailed review on entomopathogenic fungi pathogenicity to combat insect pests. Microbial Pathogenesis. 159, 105122(2021).
  11. Ali, S., Huang, Z., Ren, S. Production of cuticle degrading enzymes by Isaria fumosorosea and their evaluation as a biocontrol agent against diamondback moth. Journal of Pest Science. 83 (4), 361-370 (2010).
  12. Vidal, S., Jaber, L. R. Entomopathogenic fungi as endophytes: plant-endophyte-herbivore interactions and prospects for use in biological control. Current Science. 109 (1), 46-54 (2015).
  13. Rasool, S., et al. Seed inoculations with entomopathogenic fungi affect aphid populations coinciding with modulation of plant secondary metabolite profiles across plant families. New Phytololgist. 229 (3), 1715-1727 (2021).
  14. Dara, S. K., Montalva, C., Barta, M. Microbial control of invasive forest pests with entomopathogenic fungi: a review of the current situation. Insects. 10 (10), 341(2019).
  15. Rajula, J., Rahman, A., Krutmuang, P. Entomopathogenic fungi in Southeast Asia and Africa and their possible adoption in biological control. Biological Control. 151, 104399(2020).
  16. Sharma, L., et al. Advances in entomopathogen isolation: a case of bacteria and fungi. Microorganisms. 9 (1), 16(2020).
  17. Echeverri-Molina, D., Santolamazza-Carbone, S. Toxicity of synthetic and biological insecticides against adults of the Eucalyptus snout-beetle Gonipterus scutellatus Gyllenhal (Coleoptera: Curculionidae). Journal of Pest Science. 83 (3), 297-305 (2010).
  18. Yang, T. H., et al. Entomopathogenic fungi-mediated biological control of the red palm weevil Rhynchophorus ferrugineus. Journal of Asia-Pacific Entomology. 26 (1), 102037(2023).
  19. Kepler, R. M., et al. A phylogenetically-based nomenclature for Cordycipitaceae (Hypocreales). IMA Fungus. 8 (2), 335-353 (2017).
  20. Zhou, Y. M., Zhi, J. R., Qu, J. J., Zou, X. Estimated divergence times of Lecanicillium in the family Cordycipitaceae provide insights into the attribution of Lecanicillium. Frontiers in Microbiology. 13, 859886(2022).
  21. Montalva, C., et al. Lecanicillium attenuatum isolates affecting the invasive cypress aphid (Cinara cupressi) in Chile. BioControl. 62 (5), 625-637 (2017).
  22. Futai, K. Pine wood nematode, Bursaphelenchus xylophilus. Annual Review of Phytopathology. 51 (1), 61-83 (2013).
  23. Kobayashi, F., Yamane, A., Ikeda, T. The Japanese pine sawyer beetle as the vector of pine wilt disease. Annual Review of Entomology. 29 (1), 115-135 (1984).
  24. Zhao, L., Sun, J. Pinewood nematode Bursaphelenchus xylophilus. (Steiner and Buhrer) Nickle. Biological invasions and its management in China. 13, 3-21 (2017).
  25. Akbulut, S., Stamps, W. T. Insect vectors of the pinewood nematode: a review of the biology and ecology of Monochamus species. Forest Pathology. 42 (2), 89-99 (2012).
  26. Shimazu, M. Effects of temperature on growth of Beauveria bassiana F-263, a strain highly virulent to the Japanese pine sawyer, Monochamus alternatus, especially tolerance to high temperatures. Applied Entomology and Zoology. 39 (3), 469-475 (2004).
  27. Han, B., Piao, C. G., Wang, L. F., Li, Y., Zheng, R. Z. Survey, identification and virulence test of pathogens of the pine sawyer beetle, Monochamus alternatus, at forest farm of maanshan, anhui province. Forest Research. 20 (20), 204-208 (2007).
  28. Ma, L., Zhang, L., Lin, H., Mao, S. Investigation of pathogens of Monochamus alternatus in east China and virulence. Chinese Journal of Biological Control. 25 (3), 220-224 (2009).
  29. Alvarez-Baz, G., Fernandez-Bravo, M., Pajares, J., Quesada-Moraga, E. Potential of native Beauveria pseudobassiana strain for biological control of pine wood nematode vector Monochamus galloprovincialis. Journal of Invertebrate Pathology. 132, 48-56 (2015).
  30. Dong, Y., Xie, P., Zheng, K., Gu, Y., Fan, J. Teflon coating and anti-escape ring improve trapping efficiency of the longhorn beetle, Monochamus alternatus. Applied Sciences. 13 (3), 1664(2023).
  31. Gul, H. T., Saeed, S., Khan, F. Z. A. Entomopathogenic fungi as effective insect pest management tactic: a review. Applied Sciences and Business Economics. 1 (1), 10-18 (2014).
  32. Takuji Noma Strickler, K. Effects of Beauveria bassiana on Lygus hesperus (Hemiptera: Miridae) feeding and oviposition. Environmental Entomology. 29 (2), 394-402 (2000).
  33. Thakur, R., Sandhu, S. S. Distribution, occurrence and natural invertebrate hosts of indigenous entomopathogenic fungi of Central India. Indian Journal of Microbiology. 50 (1), 89-96 (2010).
  34. White, T. J., Bruns, T., Lee, S., Taylor, J. Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics. PCR Protocols. 18 (1), 315-322 (1990).
  35. Zaman, G., Chayen, J. An aqueous mounting medium. Journal of Clinical Pathology. 34 (5), 567-568 (1981).
  36. Koon, M. A., et al. Preparation of prokaryotic and eukaryotic organisms using chemical drying for morphological analysis in scanning electron microscopy (SEM). Journal of Visualized Experiments. (143), e58761(2019).
  37. Vilgalys, R., Hester, M. Rapid genetic identification and mapping of enzymatically amplified ribosomal DNA from several Cryptococcus species. Journal of Bacteriology. 172 (8), 4238-4246 (1990).
  38. Rehner, S. A., Samuels, G. J. Taxonomy and phylogeny of Gliocladium analysed from nuclear large subunit ribosomal DNA sequences. Mycological Reasearch. 98 (6), 625-634 (1994).
  39. Aphidech, S., Kusavadee, S. Isolation, identification, culture and production of adenosine and cordycepin from cicada larva infected with entomopathogenic fungi in Thailand. African Journal of Microbiology Research. 7 (2), 137-146 (2013).
  40. Wang, Y., et al. Polycephalomyces yunnanensis (Hypocreales), a new species of Polycephalomyces parasitizing Ophiocordyceps nutans and stink bugs (hemipteran adults). Phytotaxa. 208 (1), (2015).
  41. Qi, M., Xie, C. X., Chen, Q. W., Yu, Z. D. Pestalotiopsis trachicarpicola, a novel pathogen causes twig blight of Pinus bungeana (Pinaceae) in China. Antonie Van Leeuwenhoek. 114 (1), 1-9 (2021).
  42. Tamura, K., Stecher, G., Peterson, D., Filipski, A., Kumar, S. MEGA6: molecular evolutionary genetics analysis version 6.0. Molecular Biology and Evolution. 30 (12), 2725-2729 (2013).
  43. Wu, S., et al. Discovery of entomopathogenic fungi across geographical regions in southern China on pine sawyer beetle Monochamus alternatus and implication for multi-pathogen vectoring potential of this beetle. Frontiers in Plant Science. 13, 1061520(2022).
  44. Brodeur, J. Host specificity in biological control: insights from opportunistic pathogens. Evolutionary Applications. 5 (5), 470-480 (2012).
  45. Croll, D., Mcdonald, B. A. The genetic basis of local adaptation for pathogenic fungi in agricultural ecosystems. Molecular Ecology Resources. 26 (7), 2027-2040 (2017).
  46. Perez-Gonzalez, V. H., et al. Specific diversity of the entomopathogenic fungi Beauveria and Metarhizium in Mexican agricultural soils. Journal of Invertebrate Pathology. 119, 54-61 (2014).
  47. Debono, M., Gordee, R. S. Antibiotics that inhibit fungal cell wall development. Reviews of Microbiol. 48, 471-497 (1994).
  48. Li, S., et al. Exploring the accuracy of amplicon-based internal transcribed spacer markers for a fungal community. Molecular Ecology Resources. 20 (1), 170-184 (2019).
  49. Wan, J., Dai, Z., Zhang, K., Li, G., Zhao, P. Pathogenicity and metabolites of endoparasitic nematophagous fungus Drechmeria coniospora YMF 1.01759 against nematodes. Microorganisms. 9 (8), 1735(2021).
  50. Ammon, V., Wyllie, T. D., Brown, M. F. Investigation of the infection process of macrophomina phaseolina on the surface of soybean roots using scanning electron microscopy. Mycopathologia. 55 (2), 77-81 (1975).
  51. Throne, J. E., Hallman, G. J., Johnson, J. A., Follett, P. A. Post-harvest entomology research in the United States department of agriculture-agricultural research service. Pest Management Science. 59 (6-7), 619-628 (2003).
  52. Silver, K., et al. The Tribolium castaneum cell line TcA: a new tool kit for cell biology. Scientific Reports. 4 (1), 6840(2014).
  53. Fatehi, S., et al. Characterization of iflavirus in the red flour beetle, Tribolium castaneum (Coleoptera; Tenebrionidae). Insects. 14 (3), 220(2023).
  54. Li, C., et al. Identification and characterization of development-related microRNAs in the red flour beetle, Tribolium castaneum. International Journal of Molecular Sciences. 24 (7), 6685(2023).
  55. Li, J., et al. The TGF-β receptor gene saxophone influences larval-pupal-adult development in Tribolium castaneum. Molecules. 27 (18), 6017(2022).

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