Isolamento, identificazione comportamentale e valutazione della patogenicità di funghi entomopatogeni da una piralide forestale

Riepilogo

Qui presentiamo un protocollo per ottenere funghi entomopatogeni da una piralide forestale e un modo sostitutivo per valutare le loro attività entomopatogene utilizzando un insetto modello di Coleotteri. Questo metodo è efficiente e conveniente per esplorare le risorse fungine entomopatogene da insetti nocivi che perforano il legno nelle foreste naturali.

Abstract

I piralidi forestali causano gravi danni agli alberi e perdite economiche in tutto il mondo. Il rilascio di funghi entomopatogeni (EPF) durante il periodo di emergenza FWB è considerato un'alternativa accettabile al controllo chimico. Tuttavia, le risorse EPF sono state significativamente meno esplorate per i FWB, a differenza degli insetti nocivi agricoli. Questo articolo presenta un protocollo per esplorare le risorse EPF dai FWB utilizzando come esempio le popolazioni selvatiche di Monochamus alternatus . In questo protocollo, l'assegnazione delle trappole innescate con M. Attrattivi alternatus a diverse popolazioni hanno garantito la raccolta di campioni adeguati con sintomi naturali di infezione, durante i periodi di emergenza del coleottero. Dopo aver sezionato finemente i tegumenti e averli posizionati su un mezzo selettivo, le specie fungine sono state isolate da ogni parte dei corpi dei coleotteri e identificate in base ai tratti molecolari e morfologici.

Diverse specie fungine sono state certificate come EPF parassite attraverso la reinfezione di M. alternatus sano con sospensioni di spore. I loro fenotipi comportamentali su M. alternatus sono stati osservati utilizzando la microscopia elettronica a scansione e ulteriormente confrontati con quelli sull'insetto modello di coleotteri Tribolium castaneum. Per gli EPF che presentano fenotipi di parassitismo coerenti su entrambe le specie di coleotteri, valutazione delle loro attività su T. castaneum ha fornito preziose informazioni sulla letalità per futuri studi su M. alternatus. Questo protocollo ha aiutato la scoperta di EPF recentemente segnalati sulle popolazioni di M. alternatus in Cina, che potrebbe essere applicato come approccio efficiente per esplorare più risorse di EPF da altri FWB.

Introduzione

La devastazione causata dagli insetti nocivi ha portato a grandi perdite ecologiche ed economiche sia negli ecosistemi forestali che in quelli agricoli. La maggior parte dei parassiti agricoli si espone a nemici naturali o agenti di controllo artificiali danneggiando le piante ospiti. Invece, i piralidi del legno forestale (FWB) completano quasi completamente i loro cicli di sviluppo all'interno dei tronchi degli alberi ospiti¹, il che solleva grandi sfide per esplorare organismi di biocontrollo efficienti da FWB in campo selvatico. Quel che è peggio è che i FWB trasportano un gran numero di fitopatogeni

Protocollo

1. Isolamento di funghi da M. alternatus (Figura 1)

1. Raccogli il campione di scarabeo
   1. Raccogli i pini scarabei segantino M. alternatus utilizzando trappole commerciali (vedi Tabella dei materiali) innescati con attrattivi prima dei periodi di emergenza previsti delle popolazioni di coleotteri nelle foreste di pini naturalmente infette.
      NOTA: In questo studio, i coleotteri sono stati raccolti da cinque regioni geografiche della Cina meridionale (Huzhou/Zhejiang, Liangshan/Sichuan, Xiamen/Fujian, Shaoguan/Guang....

Discussione

Diverse popolazioni geografiche di FWB possono sviluppare varie interazioni con i funghi entomopatogeni naturali, a causa dell'adattamento ambientale a lungo termine delle specie di EPF ai fattori climatici locali e alla specifica popolazione genotipica dell'insetto ospite^44,45. L'espansione dei siti di campionamento a più regioni di presenza di insetti aiuta ad aumentare la possibilità di acquisire diversi ceppi o specie di EP.......

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL, 2 mL centrifuge tubes	Biosharp	BS-15-M
10 µL pipet tips	Sangon Biotech	F601216
10 µL, 20 µL, 100 µL, 200 µL, 1,000 µL pipettes	Rainin
1,000 µL pipet tips	Sangon Biotech	F630102
2 mL cryogenic vials	Corning	430659
20x PBS buffer	Sangon Biotech	B548117-0500
200 µL pipet tips	Sangon Biotech	F601227
2,000 bp maker	TaKaRar	SD0531
50 mL tubes	Nest	602052
50% glutaraldehyde solution	Sangon Biotech	G916054
50x TAE buffer	Sangon Biotech	B548101
6x loading buffer	TaKaRar	SD0503
Agarose	Sangon Biotech	A610013
Anhydrous ethanol	Jkchemical	LB10V37
Biochemistry Cultivation Cabinet	Shanghaiyiheng	LRH-250F
Chloroform	Juhua	61553
Commercial beetle traps	FEIMENGDI	BF-8	www.yinyouji.com
Gel imager	Bio-Rad	GelDoc XR+
Glycerol	Sangon Biotech	A600232
High speed refrigerated centrifuge	Sigma	D-37520
High-Pressure Steam Sterilization Pot	Mettler Toledo	JA5003
Isopropyl alcohol	General-reagent	G75885B
Nucleic acid dye	Sangon Biotech	A616696
Optical Microscope, OM	Leica	DM2000
Parafilm	Parafilm	PM996
PCR meter	Heal Force	Trident960
Penicillin G	Marklin	GB15743
Potato dextrose agar, PDA	Oxoid	CM0139
Potato dextrose broth, PDB	Solarbio	P9240
Primers	Sangon Biotech	/
Primers Taq	TaKaRar	RR902A
Rapid Fungi Genomic DNA Isolation Kit	Sangon Biotech	B518229
Scanning Electron Microscope, SEM	Hitachi	S-3400N
Streptomycin	Marklin	S6153
Tetracycline	Marklin	T829835
Tween-80	Marklin	T6336
Vacuum freeze dryer	Yamato	DC801
Vortex Shaker	HLD	WH-861
β-Mercaptoethanol	Marklin	M6230