Aislamiento, identificación conductual y evaluación de la patogenicidad de hongos entomopatógenos de un barrenador forestal

Resumen

En este trabajo se presenta un protocolo para la obtención de hongos entomopatógenos a partir de un barrenador forestal de la madera y una forma sustitutiva de evaluar sus actividades entomopatógenas utilizando un insecto modelo de coleóptero. Este método es eficiente y conveniente para explorar recursos fúngicos entomopatógenos de plagas de insectos perforadores de madera en bosques naturales.

Resumen

Los barrenadores forestales de la madera causan graves daños a los árboles y pérdidas económicas en todo el mundo. La liberación de hongos entomopatógenos (EPF) durante el período de emergencia de FWB se considera una alternativa aceptable al control químico. Sin embargo, los recursos de EPF se han explorado significativamente menos para los FWB, en contraste con las plagas de insectos agrícolas. Este artículo presenta un protocolo para explorar los recursos de EPF de los FWB utilizando como ejemplo las poblaciones silvestres de Monochamus alternatus . En este protocolo, la asignación de trampas cebadas con M. Los atrayentes alternados a diferentes poblaciones garantizaron la recolección de muestras adecuadas con síntomas de infección natural, durante los períodos de emergencia del escarabajo. Después de una disección fina de tegumentos y su colocación en un medio selectivo, se aislaron especies fúngicas de cada parte de los cuerpos de los escarabajos y se identificaron en función de los rasgos moleculares y morfológicos.

Varias especies de hongos fueron certificadas como EPF parásitas a través de la reinfección de M. alternatus sano con suspensiones de esporas. Sus fenotipos de comportamiento en M. alternatus se observaron mediante microscopía electrónica de barrido y se compararon con los del insecto modelo de coleóptero Tribolium castaneum. Para los EPFs que presentan fenotipos de parasitismo consistentes en ambas especies de escarabajos, la evaluación de sus actividades sobre T. castaneum proporcionó información valiosa sobre la letalidad para futuros estudios sobre M. alternatus. Este protocolo ayudó al descubrimiento de EPF recientemente reportado sobre poblaciones de M. alternatus en China, que podría aplicarse como un enfoque eficiente para explorar más recursos de EPF de otros FWB.

Introducción

La devastación causada por las plagas de insectos ha provocado grandes pérdidas ecológicas y económicas tanto en los ecosistemas forestales como en los agrícolas. La mayoría de las plagas agrícolas se exponen a enemigos naturales o agentes de control artificiales mientras dañan las plantas hospederas. En cambio, los barrenadores de la madera forestal (FWB, por sus siglas en inglés) casi completan todos sus ciclos de desarrollo dentro de los troncos de los árboles huéspedes¹, lo que plantea grandes desafíos para explorar organismos de control biológico eficientes de FWB en el campo silvestre. Lo que es aún peor ....

Protocolo

1. Aislamiento de hongos de M. alternatus (Figura 1)

1. Recoge la muestra del escarabajo
   1. Recoge los pinos escarabajos aserradores M. alternatus utilizando trampas comerciales (ver Tabla de Materiales) cebadas con atrayentes antes de los períodos de emergencia previstos de las poblaciones de escarabajos en bosques de pinos naturalmente infectados.
      NOTA: En este estudio, se recolectaron escarabajos de cinco regiones geográficas del sur de China (Huzhou / Zhejiang, Liangshan / Sichuan, Xiamen / Fujian, Shaogan / G....

Discusión

Diferentes poblaciones geográficas de FWB pueden desarrollar interacciones variadas con los hongos entomopatógenos naturales, debido a la adaptación ambiental a largo plazo de las especies de EPF a los factores climáticos locales y a la población genotípica específica del insecto huésped^44,45. La expansión de los sitios de muestreo a múltiples regiones de presencia de insectos ayuda a aumentar la posibilidad de adquirir.......

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL, 2 mL centrifuge tubes	Biosharp	BS-15-M
10 µL pipet tips	Sangon Biotech	F601216
10 µL, 20 µL, 100 µL, 200 µL, 1,000 µL pipettes	Rainin
1,000 µL pipet tips	Sangon Biotech	F630102
2 mL cryogenic vials	Corning	430659
20x PBS buffer	Sangon Biotech	B548117-0500
200 µL pipet tips	Sangon Biotech	F601227
2,000 bp maker	TaKaRar	SD0531
50 mL tubes	Nest	602052
50% glutaraldehyde solution	Sangon Biotech	G916054
50x TAE buffer	Sangon Biotech	B548101
6x loading buffer	TaKaRar	SD0503
Agarose	Sangon Biotech	A610013
Anhydrous ethanol	Jkchemical	LB10V37
Biochemistry Cultivation Cabinet	Shanghaiyiheng	LRH-250F
Chloroform	Juhua	61553
Commercial beetle traps	FEIMENGDI	BF-8	www.yinyouji.com
Gel imager	Bio-Rad	GelDoc XR+
Glycerol	Sangon Biotech	A600232
High speed refrigerated centrifuge	Sigma	D-37520
High-Pressure Steam Sterilization Pot	Mettler Toledo	JA5003
Isopropyl alcohol	General-reagent	G75885B
Nucleic acid dye	Sangon Biotech	A616696
Optical Microscope, OM	Leica	DM2000
Parafilm	Parafilm	PM996
PCR meter	Heal Force	Trident960
Penicillin G	Marklin	GB15743
Potato dextrose agar, PDA	Oxoid	CM0139
Potato dextrose broth, PDB	Solarbio	P9240
Primers	Sangon Biotech	/
Primers Taq	TaKaRar	RR902A
Rapid Fungi Genomic DNA Isolation Kit	Sangon Biotech	B518229
Scanning Electron Microscope, SEM	Hitachi	S-3400N
Streptomycin	Marklin	S6153
Tetracycline	Marklin	T829835
Tween-80	Marklin	T6336
Vacuum freeze dryer	Yamato	DC801
Vortex Shaker	HLD	WH-861
β-Mercaptoethanol	Marklin	M6230