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Resumen

En este trabajo se presenta un protocolo para la obtención de hongos entomopatógenos a partir de un barrenador forestal de la madera y una forma sustitutiva de evaluar sus actividades entomopatógenas utilizando un insecto modelo de coleóptero. Este método es eficiente y conveniente para explorar recursos fúngicos entomopatógenos de plagas de insectos perforadores de madera en bosques naturales.

Resumen

Los barrenadores forestales de la madera causan graves daños a los árboles y pérdidas económicas en todo el mundo. La liberación de hongos entomopatógenos (EPF) durante el período de emergencia de FWB se considera una alternativa aceptable al control químico. Sin embargo, los recursos de EPF se han explorado significativamente menos para los FWB, en contraste con las plagas de insectos agrícolas. Este artículo presenta un protocolo para explorar los recursos de EPF de los FWB utilizando como ejemplo las poblaciones silvestres de Monochamus alternatus . En este protocolo, la asignación de trampas cebadas con M. Los atrayentes alternados a diferentes poblaciones garantizaron la recolección de muestras adecuadas con síntomas de infección natural, durante los períodos de emergencia del escarabajo. Después de una disección fina de tegumentos y su colocación en un medio selectivo, se aislaron especies fúngicas de cada parte de los cuerpos de los escarabajos y se identificaron en función de los rasgos moleculares y morfológicos.

Varias especies de hongos fueron certificadas como EPF parásitas a través de la reinfección de M. alternatus sano con suspensiones de esporas. Sus fenotipos de comportamiento en M. alternatus se observaron mediante microscopía electrónica de barrido y se compararon con los del insecto modelo de coleóptero Tribolium castaneum. Para los EPFs que presentan fenotipos de parasitismo consistentes en ambas especies de escarabajos, la evaluación de sus actividades sobre T. castaneum proporcionó información valiosa sobre la letalidad para futuros estudios sobre M. alternatus. Este protocolo ayudó al descubrimiento de EPF recientemente reportado sobre poblaciones de M. alternatus en China, que podría aplicarse como un enfoque eficiente para explorar más recursos de EPF de otros FWB.

Introducción

La devastación causada por las plagas de insectos ha provocado grandes pérdidas ecológicas y económicas tanto en los ecosistemas forestales como en los agrícolas. La mayoría de las plagas agrícolas se exponen a enemigos naturales o agentes de control artificiales mientras dañan las plantas hospederas. En cambio, los barrenadores de la madera forestal (FWB, por sus siglas en inglés) casi completan todos sus ciclos de desarrollo dentro de los troncos de los árboles huéspedes1, lo que plantea grandes desafíos para explorar organismos de control biológico eficientes de FWB en el campo silvestre. Lo que es aún peor es que los FWB transportan un gran número de fitopatógenos2 o tienen una relación íntima con estos patógenos como sus vectores potenciales 3,4, lo que amplifica drásticamente los efectos negativos de los FWB en la salud de los bosques. El uso excesivo de insecticidas químicos puede aliviar la gravedad de la FWB, pero la aparición de resistencia a los insecticidas 5,6 limita su aplicación en el medio ambiente. En ciertos casos, insectos parasitoides, artrópodos depredadores y microbios entomopatógenos fueron liberados como agentes de biocontrol en las áreas de distribución de FWB7 y se demostró que eran alternativas eficientes y económicamente aceptables al control químico 8,9,10.

Se considera que los hongos entomopatógenos (EPF) tienen la ventaja en el control de FWB sobre la mayoría de los otros grupos microbianos. Sus esporas pueden ser transportadas por insectos hospedadores y fijadas de manera estable en las superficies corporales a través de la penetración en la cutícula o el tegumento 8,11. Los EPF también presentan una excelente adaptabilidad a los estreses ambientales y algunas especies colonizan bien en el tejido de los árboles como endófitos12,13, facilitando su crecimiento, supervivencia y transmisión. Sin embargo, en comparación con la de las industrias agrícolas, la diversidad de especies de EPF utilizada en los ecosistemas forestales naturales es notablemente restringida 14,15,16. Beauveria bassiana (cepa PPRI 5339) se evidenció como la cepa más prometedora para promover un programa de MIP para gorgojos de Eucalyptus en Sudáfrica17 y la combinación de dos aislados prometedores de B. bassiana brindó una oportunidad para el control microbiano práctico del picudo rojo de las palmeras, Rhynchophorus ferrugineus, en diferentes etapas de vida en campos de palmeras18. Además de Beauveria y el conocido Metarhizium, otros géneros de EPF del orden Hypocreales, especialmente especies de Lecanicillium (muchas de las cuales ahora se clasifican en el género Akanthomyces19,20), mostraron una fuerte patogenicidad y un alto potencial en el manejo de plagas forestales, como el pulgón ciprés en Chile21.

El escarabajo aserrador del pino Monochamus alternatus es una plaga notoria de los bosques de pinos en China y los países vecinos, que se entierra en las ramas y troncos de los pinos para impedir el transporte de nutrientes y agua 22,23,24. Por otra parte, M. alternatus también promueve la invasión del nematodo fitoparásito de la madera del pino (Bursaphelenchus xylophilus, PWN) como su principal escarabajo vector. Otra especie congénere del escarabajo, M. galloprovincialis, se ha propagado en varios países de Europa en los últimos años25. Investigaciones previas informaron de varios géneros de EPFs naturales de Monochamus spp., como Beauveria, Metarhizium y Lecanicillium (Verticillium, un nombre aún más antiguo de Lecanicillium), en España, Japón y las provincias de Anhui/Zhejiang de China 26,27,28,29. Sin embargo, estas colecciones de EPF parecen estar comúnmente restringidas en un lugar determinado, en comparación con la amplia presencia de escarabajos Monochamus en campos naturales. Dado que el escarabajo M. alternatus tiene una amplia distribución geográfica en China, podría considerarse como un barrenador de la madera representativo para explorar más posibles EPF en diferentes poblaciones.

En el presente protocolo, introducimos un procedimiento específico que explora las EPFs de varias poblaciones geográficas de M. alternatus en el sur de China. Este protocolo utiliza un modelo de escarabajo coleóptero como sustituto para realizar ensayos de entomopatogenicidad, bajo la condición de que la especie fúngica analizada tenga un fenotipo de comportamiento consistente en ambas especies de escarabajos. Este protocolo también puede proporcionar información sobre la exploración de EPF en busca de otros barrenadores de la madera forestal, en los que la diversidad de sus especies fúngicas entomopatógenas está subestimada o menos investigada.

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Protocolo

1. Aislamiento de hongos de M. alternatus (Figura 1)

  1. Recoge la muestra del escarabajo
    1. Recoge los pinos escarabajos aserradores M. alternatus utilizando trampas comerciales (ver Tabla de Materiales) cebadas con atrayentes antes de los períodos de emergencia previstos de las poblaciones de escarabajos en bosques de pinos naturalmente infectados.
      NOTA: En este estudio, se recolectaron escarabajos de cinco regiones geográficas del sur de China (Huzhou / Zhejiang, Liangshan / Sichuan, Xiamen / Fujian, Shaogan / Guangdong, Yulin / Guangxi). La configuración de la trampa de arriba a abajo es la siguiente: una tapa redonda (50 cm de diámetro), un panel en forma de cruz (35 cm de ancho y 66 cm de largo), un embudo (35,5 cm de diámetro redondo superior y 5,5 cm de diámetro redondo inferior), una taza de recolección (10,5 cm de diámetro y 26,5 cm de largo). Los volátiles del huésped (por ejemplo, etanol y α-pineno) y la feromona de agregación (2-undeciloxi-1-etanol) se utilizan como cebo30.
    2. Etiquete el espécimen antes de transferirlo al laboratorio. Coloque cada escarabajo en tubos esterilizados individuales con ramitas frescas. Reemplace las ramitas por otras frescas cada 2 días.
    3. Cría los escarabajos vivos a 25 ± 1 °C en una incubadora no humidificada (ciclos de 16-8 L/D) y obsérvalos diariamente.
    4. Registre las muestras que muestren una disminución de la alimentación y la movilidad. Traslado muerto M. alternatus que se endurecen y endurecen a cámaras húmedas para observar el crecimiento de micelios y conidios fúngicos.
      NOTA: Una vez infectados por hongos entomopatógenos, los escarabajos mostraron una disminución en la alimentación y movilidad en la etapa inicial de la infección31,32. Después de la muerte, sus cuerpos se endurecieron y se volvieron rígidos, con micelios y conidios que aparecieron varios días después del almacenamiento en una cámara húmeda33.
    5. Almacene los cadáveres de escarabajos con infecciones fúngicas a 4 °C para su uso futuro. Para seguir este protocolo, procese las muestras inmediatamente en unas pocas horas para evitar la contaminación con hongos más saprótrofos.
  2. Preparación del medio de crecimiento
    1. Añadir 39 g de agar patata dextrosa (PDA) en polvo en 1 litro de agua pura y esterilizarlo en autoclave durante 30 min a 121 °C.
    2. Enfriar hasta una temperatura operable (~50 °C), añadir 0,05 g de estreptomicina, 0,05 g de penicilina G y 0,05 g de tetraciclina, y agitar para distribuir el medio.
    3. Coloque el medio en placas de Petri debajo de un banco limpio y úselo después de la solidificación.
      NOTA: El medio PDA con antibióticos se utiliza para el aislamiento de escarabajos, lo que evita el crecimiento de bacterias sin afectar el crecimiento de hongos durante el aislamiento. Sin embargo, el medio PDA sin antibióticos se utiliza para el cultivo diario y la conservación.
    4. Poner 35 g de caldo de patata dextrosa (PDB) en polvo en 1 L de ddH2O y esterilizarlo en autoclave durante 30 min a 121 °C. Enfríelo para usarlo.
  3. Disección de la muestra de escarabajo con síntomas de infección fúngica
    1. Prepare tijeras, bisturíes y alfileres de insectos esterilizados; Luego, trabaje debajo de un banco limpio con un quemador de alcohol.
      NOTA: El uso de las herramientas de disección se puede ajustar según las preferencias personales. Los alfileres de insectos son más afilados que las agujas de disección estándar, y diferentes especificaciones pueden satisfacer la necesidad de disección.
    2. Disecciona los tegumentos del cuerpo del escarabajo con herramientas en placas de Petri estériles y de un solo uso. Tenga cuidado de evitar posibles daños en los tejidos del intestino medio y posterior que puedan exudar contenidos internos.
    3. Divida los cuerpos de los escarabajos en las posiciones principales de la siguiente manera: antenas, cabeza, tórax, abdomen, alas (cada par) y patas.
  4. Purificación de hongos
    1. Corta los tegumentos de cada posición en trozos pequeños con unas tijeras. Presione suavemente la superficie exterior sobre la superficie de las placas de PDA con antibióticos.
      NOTA: Asegúrese de que los micelios fúngicos de los tegumentos se hayan inoculado a la placa.
    2. Sellar cuidadosamente con parafilm y cultivar en una incubadora a 25 ± 1 °C hasta que los tejidos estén completamente cubiertos por micelio.
    3. Transferir colonias individuales de acuerdo con las propiedades fenotípicas (color, forma) a un nuevo PDA con antibióticos para cultivo a 25 ± 1 °C.
    4. Repita el paso 1.4.3 dos o tres veces en PDA con antibióticos hasta que las colonias puras se aíslen por separado.
      NOTA: Si crecen varias cepas de hongos en las placas originales, elija el micelio con precisión para facilitar la clasificación de más especies de hongos.
  5. Almacenamiento de los aislados fúngicos
    1. Transfiera bloques de agar (~5 mm de diámetro) de las colonias a nuevas placas de PDA.
    2. Cultivo en incubadora a 25 ± 1 °C durante 1-2 semanas.
    3. Coloque en un refrigerador a 4 ° C para almacenamiento diario para uso posterior.
    4. Inocular cepas fúngicas en 50 mL de PDB estéril en un matraz de 250 mL, agitando a 180 rpm/min a 25 °C durante 5-7 días.
    5. Coseche 1 mL del micelio fúngico recién cultivado y suspenda en 1 mL de glicerol esterilizado al 20% en tubos de congelación estériles de 2 mL (la concentración final de glicerol es del 10%).
    6. Selle los tubos con parafilm y preenfríelos a -20 °C y -40 °C. A continuación, mantenga los tubos a -80 °C como culatas.

2. Identificación molecular y morfológica de aislados fúngicos

  1. Extracción de ADN genómico fúngico
    1. Cultivo de hongos en PDB como se describe en el paso 1.5.4.
    2. Recoja el micelio y fíltralo para separarlo de la PDB. Homogeneizar en nitrógeno líquido mediante un mortero preenfriado.
    3. Extraiga el ADN genómico utilizando el kit de aislamiento de ADN genómico de hongos de acuerdo con las instrucciones del fabricante (consulte la tabla de materiales).
  2. Amplificación por PCR y secuenciación de ADN
    1. Prepare la mezcla de reacción de PCR de la siguiente manera: 25 μL de ADN polimerasa Taq, 1 μL de plantilla, 2 μL de cebadores directos e inversos y ddH2O a un volumen total de 50 μL.
    2. Amplificar la región ADNr-ITS de la muestra de ADN utilizando los pares de cebadores ITS1 e ITS434 (véase el cuadro 1) con el siguiente procedimiento: desnaturalización inicial a 95 °C durante 4 min, seguida de 35 ciclos de desnaturalización a 94 °C durante 60 s, recocido a 58 °C durante 60 s, elongación a 72 °C durante 2 min, y una elongación final a 72 °C durante 10 min.
    3. Electroforesis de productos amplificados utilizando gel de agarosa al 1,5% a 100 V, 100 mA.
    4. Secuenciar la PCR.
    5. Alinee la secuencia con Clustal X2.0 y MEGA 6.0.
      NOTA: Durante la alineación de secuencia, se excluyen los sitios con alineación ambigua y los huecos se tratan como datos faltantes.
    6. Compare la secuencia obtenida con las de la base de datos de secuencias ITS en GenBank utilizando BLAST en el sitio web del Centro Nacional de Información Biotecnológica (NCBI). Identificar la información preliminar de la especie de cepa fúngica.
  3. Identificación morfológica
    1. Utilice una cámara para capturar la morfología pura de la colonia de hongos maduros tanto en el anverso como en el reverso de las placas PDA.
    2. Arrancar conidios de las colonias fúngicas de cultivo puro con una aguja de inoculación y transferirlos a un portaobjetos de vidrio con una gota de agua estéril.
    3. Sostenga el cubreobjetos y colóquelo lentamente en un ángulo de ~ 45 °, de modo que el cubreobjetos pueda cubrir el espécimen sin burbujas.
    4. Corte un bloque de agar de 5 mm2 con un bisturí de las colonias en el borde de la colonia de hongos y transfiéralo a un portaobjetos de vidrio limpio con una gota de agua estéril. Separe cuidadosamente los hongos con una aguja fina para ver estructuras específicas.
    5. Repita el paso 2.3.3.
    6. Observe el morfología asexual de los hongos bajo un microscopio óptico (OM), incluida la forma, la transparencia y la postura de las hifas, los conidióforos, los fiálidos y los conidios. Registre y mida la forma y el tamaño de las características asexuales para distinguir los diferentes aislados de hongos entre sí.
      NOTA: Para maximizar la capacidad de observar estructuras fúngicas, use tinciones y medio de montaje35.

3. Inducción de los síntomas de infección fúngica en M. alternatus para observar sus fenotipos de comportamiento

  1. Preparación de la suspensión de conidios
    1. Preparar 0,01% Tween-80 con agua pura y esterilizarlo en autoclave durante 25 min a 121 °C. Úselo después de enfriar.
    2. Agregue una cantidad adecuada de perlas de vidrio pequeñas estériles y una solución de Tween-80 al 0,01% en un tubo de centrífuga de 2 ml.
    3. Raspe las colonias de hongos en el tubo y agítelo lo suficiente con un agitador de vórtice hasta que la colonia se rompa. Filtrar a través de dos capas de gasa para eliminar el micelio.
      NOTA: La agitación se realiza para asegurar la suspensión de la conidiospora en la solución de Tween-80 al 0,01%.
    4. Cuente el número de esporas bajo la MO con un hemocitómetro, ajuste a 1 × 108 conidial/mL con Tween-80 estéril al 0,01% y manténgalo a 4 °C para su uso.
  2. Preparación de escarabajos
    1. Esterilizar las ramitas de pino en autoclave (aproximadamente del mismo tamaño) y secarlas en el horno (~ 60 °C).
    2. Mantener la M. recolectada en el campo. alternatus adultos con ramitas de pino en incubadora a 25 ± 1 °C.
    3. Prive a los escarabajos de su presencia durante 24 horas y esterilice la superficie de los escarabajos con lejía, etanol y agua destilada [10:10:80 (v:v)] antes de usarlos.
  3. Inducción de la infección fúngica
    1. Trabaje debajo de un banco limpio, sumerja las ramitas de pino en la suspensión conidial durante 10 s y séquelas al aire.
    2. Sumerja los escarabajos en suspensión conidial durante 10 s, luego transfiéralos a tubos estériles de 50 ml (un escarabajo y una ramita por tubo). Reemplace las ramitas por otras nuevas cada 2 días.
    3. Para el control negativo, cambie la suspensión conidial por una solución estéril de Tween-80 al 0,01%. Haga cinco réplicas para cada cepa de hongo y grupo de control.
    4. Evalúe la actividad de los escarabajos en función de la cantidad de excremento producido en las ramitas de pino. Cuando deje de alimentarse, considérelos muertos.
    5. Transfiera los escarabajos muertos a nuevos tubos estériles de 50 ml y coloque un trozo de algodón húmedo estéril. Incubar a 25 ± 1 °C.
      NOTA: El algodón húmedo se utiliza para mantener la humedad, ya que el crecimiento de hongos requiere una humedad adecuada, pero no demasiada.
    6. Observe y fotografíe el cambio de la superficie del escarabajo a la misma hora todos los días.
  4. Reaislamiento y confirmación de especies fúngicas
    1. Hasta que aparezcan fenotipos claros de infección fúngica en la superficie de los escarabajos, recoja el micelio de diferentes tejidos individualmente en nuevas placas de PDA.
    2. Cultivar a 25 ± 1 °C y observar para asegurar que la morfología es consistente con la de los hongos inoculados.
  5. Tratamiento del escarabajo modelo
    1. Repita los pasos 3.2.1-3.3.6 en el escarabajo modelo Tribolium castaneum, utilizando salvado de trigo como alimento, y esterilice el salvado de trigo con luz ultravioleta.
    2. Toque ligeramente los escarabajos con pinzas estériles. Asume que están muertos si no hay respuesta.

4. Confirmar los fenotipos de infección de hongos en M. alternatus y escarabajo modelo

  1. Preparación de la muestra para la observación
    1. Diseccionar el M infectado. alterna los cadáveres cuidadosamente como en el paso 1.3.
    2. Escoge T. Cuerpos de castaneum con síntomas evidentes de infección fúngica.
    3. Corte tapones de disco de 5 mm de cuatro colonias de hongos maduros que crecen en PDA.
  2. Pretratamiento de la muestra
    1. Coloque los tapones, los tejidos de escarabajos infectados y los cuerpos en glutaraldehído preenfriado al 2,5% a 4 °C durante 2 días.
    2. Lave las muestras tres veces en tampón de fosfato al 0,1% (pH 7,2-7,4) durante 5 minutos y deshidrate en etanol al 30%, 50%, 70%, 80%, 90%, 95%, 100% durante 10 minutos.
    3. Seque las muestras en un liofilizador al vacío.
      NOTA: Todo el proceso de pretratamiento debe ser cuidadoso, incluido el corte, el remojo, la deshidratación, el lavado y el secado, para evitar daños en la muestra.
  3. Observación con microscopía electrónica de barrido (SEM)
    1. Cubra las muestras pretratadas con platino utilizando un recubridor de pulverización catódica y observe bajo un microscopio electrónico de barrido36.
    2. Registrar las características morfológicas de las hifas y conidios que crecen en PDA, M. tejidos alternatus y cuerpos de escarabajos modelo.
    3. Compare si los resultados son coherentes con los de OM en el paso 2.3.

5. Evaluación de la actividad entomopatogénica

  1. Preparación de la suspensión de conidios
    1. La preparación de la suspensión conidial es la misma que en los pasos 3.1.1-3.1.4.
  2. Pretratamiento del escarabajo modelo
    1. Cultiva, alimenta, esteriliza y mata de hambre a T. castaneum como en el paso 3.5.1.
    2. Esterilice el salvado de trigo por UV y coloque el mismo peso en las placas de Petri estériles.
  3. Prueba de actividad entomopatogénica
    1. Trate el salvado de trigo con la suspensión de conidiales y séquelo al aire bajo un banco limpio a temperatura ambiente.
    2. Sumergir T. Escarabajos castaneum en la suspensión conidial durante 10 s y transfiéralos a una placa de Petri (n = 20 en cada placa de Petri). Reemplace el salvado de trigo nuevo con el mismo tratamiento conidial cada 4 días.
    3. Para el control negativo, aplique solo una solución estéril de Tween-80 al 0,01%.
      NOTA: Reserve al menos tres réplicas para cada grupo de tratamiento y el grupo de control.
    4. Cuenta los escarabajos muertos a diario.
      NOTA: Toque ligeramente los escarabajos con pinzas estériles. Asuma que están muertos si hay una falta de respuesta.
  4. Análisis filogenético multigénico
    1. Extraiga el ADN genómico de hongos entomopatógenos como se describe en el paso 2.1.
      NOTA: Se lleva a cabo la identificación multigénica de los EPF parásitos que muestran fenotipos de infección significativos y fuertes actividades entomopatogénicas contra el escarabajo modelo.
    2. Amplificar los siguientes genes, incluida una región que abarca el gen SSU34 ribosómico nuclear, un segmento del gen de ARNr de subunidad grande (LSU37,38), parte del gen del factor de elongación 1-alfa (tef-1α39), las secuencias de la segunda subunidad más grande de la ARN polimerasa ІІ (rpb240) y parte de la β-tubulina41 utilizando los pares de cebadores NS1/NS4, LR7/LROR, EF-983F/EF-2218R, RPB2-5'F/RPB2-5'R y TUB1/TUB22 (ver Tabla 1), respectivamente.
      1. Prepare la mezcla de reacción PCR como en el paso 2.2.1.
      2. Llevar a cabo la amplificación de la siguiente manera: desnaturalización inicial a 95 °C durante 4 min, seguida de 35 ciclos (tef-1α, rpb2, SSU), 38 ciclos (LSU) o 39 ciclos (β-tubulina) de desnaturalización a 94 °C durante 60 s, recocido a 47 °C durante 60 s (LSU), 55 °C durante 60 s (tef-1α), 54 °C durante 40 s (β-tubulina) y 50 °C durante 30 s (rpb2, SSU), elongación a 72 °C durante 1 min, y una elongación final a 72 °C durante 10 min.
    3. Secuenciar y alinear siguiendo los mismos pasos que se muestran en los pasos 2.2.4-2.2.5.
    4. Realizar el análisis filogenético por MEGA 6.0 basado en el método de Máxima Verosimilitud (ML)42.

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Resultados

Aislamiento e identificación de aislados fúngicos de M. Alternatus
Con la ayuda de trampas atrayentes, un gran número (aproximadamente 500 escarabajos en total) de M. Se recolectaron alternatus en cinco regiones geográficas. Se recogieron cadáveres de escarabajos con síntomas típicos de infección por hongos entomopatógenos; Luego, los tegumentos corporales de cada escarabajo se diseccionaron en varias posiciones, como se d...

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Discusión

Diferentes poblaciones geográficas de FWB pueden desarrollar interacciones variadas con los hongos entomopatógenos naturales, debido a la adaptación ambiental a largo plazo de las especies de EPF a los factores climáticos locales y a la población genotípica específica del insecto huésped44,45. La expansión de los sitios de muestreo a múltiples regiones de presencia de insectos ayuda a aumentar la posibilidad de adquirir...

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Divulgaciones

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Agradecimientos

Esta investigación contó con el apoyo del Programa Nacional de Investigación y Desarrollo Clave de China (2021YFC2600100) y la Fundación de Ciencias Naturales de la Provincia de Zhejiang (LY21C040001).

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Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
1.5 mL, 2 mL centrifuge tubesBiosharpBS-15-M
10 µL pipet tipsSangon BiotechF601216
10 µL, 20 µL, 100 µL, 200 µL, 1,000 µL pipettesRainin
1,000 µL pipet tipsSangon BiotechF630102
2 mL cryogenic vialsCorning430659
20x PBS bufferSangon BiotechB548117-0500
200 µL pipet tipsSangon BiotechF601227
2,000 bp makerTaKaRarSD0531
50 mL tubesNest602052
50% glutaraldehyde solutionSangon BiotechG916054
50x TAE bufferSangon BiotechB548101
6x loading bufferTaKaRarSD0503
AgaroseSangon BiotechA610013
Anhydrous ethanolJkchemicalLB10V37
Biochemistry Cultivation CabinetShanghaiyihengLRH-250F
ChloroformJuhua61553
Commercial beetle trapsFEIMENGDIBF-8www.yinyouji.com
Gel imagerBio-RadGelDoc XR+
GlycerolSangon BiotechA600232
High speed refrigerated centrifugeSigmaD-37520
High-Pressure Steam Sterilization PotMettler ToledoJA5003
Isopropyl alcoholGeneral-reagentG75885B
Nucleic acid dyeSangon BiotechA616696
Optical Microscope, OMLeicaDM2000
ParafilmParafilmPM996
PCR meterHeal ForceTrident960
Penicillin GMarklinGB15743
Potato dextrose agar, PDAOxoidCM0139
Potato dextrose broth, PDBSolarbioP9240
PrimersSangon Biotech/
Primers TaqTaKaRarRR902A
Rapid Fungi Genomic DNA Isolation KitSangon BiotechB518229
Scanning Electron Microscope, SEMHitachiS-3400N
StreptomycinMarklinS6153
TetracyclineMarklinT829835
Tween-80MarklinT6336
Vacuum freeze dryerYamatoDC801
Vortex ShakerHLDWH-861
β-MercaptoethanolMarklinM6230

Referencias

  1. Hajek, A. E., Bauer, L. S. Microbial control of wood-boring insects attacking forest and shade trees. Field Manual of Techniques in Invertebrate Pathology. 10, 505-525 (2007).
  2. Linnakoski, R., Forbes, K. M. Pathogens-the hidden face of forest invasions by wood-boring insect pests. Frontiers in Plant Science. 10, 90(2019).
  3. Hulcr, J., Dunn, R. R. The sudden emergence of pathogenicity in insect-fungus symbioses threatens naive forest ecosystems. Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences. 278 (1720), 2866-2873 (2011).
  4. Humble, L. M., Allen, E. A. Forest biosecurity: alien invasive species and vectored organisms. Canadian Journal of Plant Pathology. 10, 90(2006).
  5. Ahmed, R., Freed, S. Biochemical resistance mechanisms against chlorpyrifos, imidacloprid and lambda-cyhalothrin in Rhynchophorus ferrugineus (Olivier) (Coleoptera: Curculionidae). Crop Protection. 143, 105568(2021).
  6. Al-Ayedh, H., Hussain, A., Rizwan-Ul-Haq, M., Al-Jabr, A. M. Status of insecticide resistance in field-collected populations of Rhynchophorus ferrugineus (Olivier) (Coleoptera: Curculionidae). International Journal of Agriculture and Biology. 18 (01), 103-110 (2015).
  7. Garcia, F. R. M., Ovruski, S. M., Suarez, L., Cancino, J., Liburd, O. E. Biological control of Tephritid fruit flies in the Americas and Hawaii: a review of the use of parasitoids and predators. Insects. 11 (10), 662(2020).
  8. Lacey, L. A., Shapiro-Ilan, D. I. Microbial control of insect pests in temperate orchard systems: potential for incorporation into IPM. Annual Review of Entomology. 53, 121-144 (2008).
  9. Wang, Z. Z., Liu, Y. Q., Shi, M., Huang, J. H., Chen, X. X. Parasitoid wasps as effective biological control agents. Journal of Integrative Agriculture. 18 (4), 705-715 (2019).
  10. Islam, W., et al. Insect-fungal-interactions: a detailed review on entomopathogenic fungi pathogenicity to combat insect pests. Microbial Pathogenesis. 159, 105122(2021).
  11. Ali, S., Huang, Z., Ren, S. Production of cuticle degrading enzymes by Isaria fumosorosea and their evaluation as a biocontrol agent against diamondback moth. Journal of Pest Science. 83 (4), 361-370 (2010).
  12. Vidal, S., Jaber, L. R. Entomopathogenic fungi as endophytes: plant-endophyte-herbivore interactions and prospects for use in biological control. Current Science. 109 (1), 46-54 (2015).
  13. Rasool, S., et al. Seed inoculations with entomopathogenic fungi affect aphid populations coinciding with modulation of plant secondary metabolite profiles across plant families. New Phytololgist. 229 (3), 1715-1727 (2021).
  14. Dara, S. K., Montalva, C., Barta, M. Microbial control of invasive forest pests with entomopathogenic fungi: a review of the current situation. Insects. 10 (10), 341(2019).
  15. Rajula, J., Rahman, A., Krutmuang, P. Entomopathogenic fungi in Southeast Asia and Africa and their possible adoption in biological control. Biological Control. 151, 104399(2020).
  16. Sharma, L., et al. Advances in entomopathogen isolation: a case of bacteria and fungi. Microorganisms. 9 (1), 16(2020).
  17. Echeverri-Molina, D., Santolamazza-Carbone, S. Toxicity of synthetic and biological insecticides against adults of the Eucalyptus snout-beetle Gonipterus scutellatus Gyllenhal (Coleoptera: Curculionidae). Journal of Pest Science. 83 (3), 297-305 (2010).
  18. Yang, T. H., et al. Entomopathogenic fungi-mediated biological control of the red palm weevil Rhynchophorus ferrugineus. Journal of Asia-Pacific Entomology. 26 (1), 102037(2023).
  19. Kepler, R. M., et al. A phylogenetically-based nomenclature for Cordycipitaceae (Hypocreales). IMA Fungus. 8 (2), 335-353 (2017).
  20. Zhou, Y. M., Zhi, J. R., Qu, J. J., Zou, X. Estimated divergence times of Lecanicillium in the family Cordycipitaceae provide insights into the attribution of Lecanicillium. Frontiers in Microbiology. 13, 859886(2022).
  21. Montalva, C., et al. Lecanicillium attenuatum isolates affecting the invasive cypress aphid (Cinara cupressi) in Chile. BioControl. 62 (5), 625-637 (2017).
  22. Futai, K. Pine wood nematode, Bursaphelenchus xylophilus. Annual Review of Phytopathology. 51 (1), 61-83 (2013).
  23. Kobayashi, F., Yamane, A., Ikeda, T. The Japanese pine sawyer beetle as the vector of pine wilt disease. Annual Review of Entomology. 29 (1), 115-135 (1984).
  24. Zhao, L., Sun, J. Pinewood nematode Bursaphelenchus xylophilus. (Steiner and Buhrer) Nickle. Biological invasions and its management in China. 13, 3-21 (2017).
  25. Akbulut, S., Stamps, W. T. Insect vectors of the pinewood nematode: a review of the biology and ecology of Monochamus species. Forest Pathology. 42 (2), 89-99 (2012).
  26. Shimazu, M. Effects of temperature on growth of Beauveria bassiana F-263, a strain highly virulent to the Japanese pine sawyer, Monochamus alternatus, especially tolerance to high temperatures. Applied Entomology and Zoology. 39 (3), 469-475 (2004).
  27. Han, B., Piao, C. G., Wang, L. F., Li, Y., Zheng, R. Z. Survey, identification and virulence test of pathogens of the pine sawyer beetle, Monochamus alternatus, at forest farm of maanshan, anhui province. Forest Research. 20 (20), 204-208 (2007).
  28. Ma, L., Zhang, L., Lin, H., Mao, S. Investigation of pathogens of Monochamus alternatus in east China and virulence. Chinese Journal of Biological Control. 25 (3), 220-224 (2009).
  29. Alvarez-Baz, G., Fernandez-Bravo, M., Pajares, J., Quesada-Moraga, E. Potential of native Beauveria pseudobassiana strain for biological control of pine wood nematode vector Monochamus galloprovincialis. Journal of Invertebrate Pathology. 132, 48-56 (2015).
  30. Dong, Y., Xie, P., Zheng, K., Gu, Y., Fan, J. Teflon coating and anti-escape ring improve trapping efficiency of the longhorn beetle, Monochamus alternatus. Applied Sciences. 13 (3), 1664(2023).
  31. Gul, H. T., Saeed, S., Khan, F. Z. A. Entomopathogenic fungi as effective insect pest management tactic: a review. Applied Sciences and Business Economics. 1 (1), 10-18 (2014).
  32. Takuji Noma Strickler, K. Effects of Beauveria bassiana on Lygus hesperus (Hemiptera: Miridae) feeding and oviposition. Environmental Entomology. 29 (2), 394-402 (2000).
  33. Thakur, R., Sandhu, S. S. Distribution, occurrence and natural invertebrate hosts of indigenous entomopathogenic fungi of Central India. Indian Journal of Microbiology. 50 (1), 89-96 (2010).
  34. White, T. J., Bruns, T., Lee, S., Taylor, J. Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics. PCR Protocols. 18 (1), 315-322 (1990).
  35. Zaman, G., Chayen, J. An aqueous mounting medium. Journal of Clinical Pathology. 34 (5), 567-568 (1981).
  36. Koon, M. A., et al. Preparation of prokaryotic and eukaryotic organisms using chemical drying for morphological analysis in scanning electron microscopy (SEM). Journal of Visualized Experiments. (143), e58761(2019).
  37. Vilgalys, R., Hester, M. Rapid genetic identification and mapping of enzymatically amplified ribosomal DNA from several Cryptococcus species. Journal of Bacteriology. 172 (8), 4238-4246 (1990).
  38. Rehner, S. A., Samuels, G. J. Taxonomy and phylogeny of Gliocladium analysed from nuclear large subunit ribosomal DNA sequences. Mycological Reasearch. 98 (6), 625-634 (1994).
  39. Aphidech, S., Kusavadee, S. Isolation, identification, culture and production of adenosine and cordycepin from cicada larva infected with entomopathogenic fungi in Thailand. African Journal of Microbiology Research. 7 (2), 137-146 (2013).
  40. Wang, Y., et al. Polycephalomyces yunnanensis (Hypocreales), a new species of Polycephalomyces parasitizing Ophiocordyceps nutans and stink bugs (hemipteran adults). Phytotaxa. 208 (1), (2015).
  41. Qi, M., Xie, C. X., Chen, Q. W., Yu, Z. D. Pestalotiopsis trachicarpicola, a novel pathogen causes twig blight of Pinus bungeana (Pinaceae) in China. Antonie Van Leeuwenhoek. 114 (1), 1-9 (2021).
  42. Tamura, K., Stecher, G., Peterson, D., Filipski, A., Kumar, S. MEGA6: molecular evolutionary genetics analysis version 6.0. Molecular Biology and Evolution. 30 (12), 2725-2729 (2013).
  43. Wu, S., et al. Discovery of entomopathogenic fungi across geographical regions in southern China on pine sawyer beetle Monochamus alternatus and implication for multi-pathogen vectoring potential of this beetle. Frontiers in Plant Science. 13, 1061520(2022).
  44. Brodeur, J. Host specificity in biological control: insights from opportunistic pathogens. Evolutionary Applications. 5 (5), 470-480 (2012).
  45. Croll, D., Mcdonald, B. A. The genetic basis of local adaptation for pathogenic fungi in agricultural ecosystems. Molecular Ecology Resources. 26 (7), 2027-2040 (2017).
  46. Perez-Gonzalez, V. H., et al. Specific diversity of the entomopathogenic fungi Beauveria and Metarhizium in Mexican agricultural soils. Journal of Invertebrate Pathology. 119, 54-61 (2014).
  47. Debono, M., Gordee, R. S. Antibiotics that inhibit fungal cell wall development. Reviews of Microbiol. 48, 471-497 (1994).
  48. Li, S., et al. Exploring the accuracy of amplicon-based internal transcribed spacer markers for a fungal community. Molecular Ecology Resources. 20 (1), 170-184 (2019).
  49. Wan, J., Dai, Z., Zhang, K., Li, G., Zhao, P. Pathogenicity and metabolites of endoparasitic nematophagous fungus Drechmeria coniospora YMF 1.01759 against nematodes. Microorganisms. 9 (8), 1735(2021).
  50. Ammon, V., Wyllie, T. D., Brown, M. F. Investigation of the infection process of macrophomina phaseolina on the surface of soybean roots using scanning electron microscopy. Mycopathologia. 55 (2), 77-81 (1975).
  51. Throne, J. E., Hallman, G. J., Johnson, J. A., Follett, P. A. Post-harvest entomology research in the United States department of agriculture-agricultural research service. Pest Management Science. 59 (6-7), 619-628 (2003).
  52. Silver, K., et al. The Tribolium castaneum cell line TcA: a new tool kit for cell biology. Scientific Reports. 4 (1), 6840(2014).
  53. Fatehi, S., et al. Characterization of iflavirus in the red flour beetle, Tribolium castaneum (Coleoptera; Tenebrionidae). Insects. 14 (3), 220(2023).
  54. Li, C., et al. Identification and characterization of development-related microRNAs in the red flour beetle, Tribolium castaneum. International Journal of Molecular Sciences. 24 (7), 6685(2023).
  55. Li, J., et al. The TGF-β receptor gene saxophone influences larval-pupal-adult development in Tribolium castaneum. Molecules. 27 (18), 6017(2022).

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