森林ウッドボーラーからの昆虫病原性真菌の分離、行動同定、および病原性評価

要約

ここでは、森林のウッドボーラーから昆虫病原性真菌を取得するためのプロトコルと、鞘翅目モデル昆虫を使用してそれらの昆虫病原性活性を評価するための代替方法を示します。この方法は、自然林の木材を退屈する害虫から昆虫病原性真菌資源を探索するのに効率的で便利です。

要約

森林ウッドボーラー(FWB)は、世界中で深刻な樹木の損傷と経済的損失を引き起こしています。FWBの出現期間中の昆虫病原性真菌(EPF)の放出は、化学的防除の許容可能な代替手段と考えられています。しかし、農業害虫とは対照的に、FWBのEPF資源は大幅に調査されていません。この論文では、野生の Monochamus alternatus 個体群を例に、FWBからEPFリソースを探索するためのプロトコルを紹介します。このプロトコルでは、トラップの割り当ては Mで餌付けされました。異なる集団への 代替 誘引物質は、カブトムシの出現期間中に、自然感染症状を伴う適切なサンプルの収集を保証しました。外皮を細かく解剖し、選択的な培地に置いた後、カブトムシの体の各部分から真菌種を単離し、分子形質と形態学的形質の両方に基づいて同定しました。

いくつかの真菌種は、健康な M. alternatus の胞子懸濁液による再感染により、寄生性EPFとして認定されました。 M. alternatus の行動表現型を走査型電子顕微鏡を用いて観察し、さらに鞘翅目モデル昆虫 Tribolium castaneumの行動表現型と比較した。両方の甲虫種で一貫した寄生表現型を示すEPFについて、 Tでのそれらの活性の評価。 カスタネウム は、 M. alternatusの将来の研究に致死性に関する貴重な情報を提供しました。このプロトコルは、中国の M. alternatus 個体群について新たに報告されたEPFの発見に役立ち、他のFWBからより多くのEPFリソースを探索するための効率的なアプローチとして適用できる可能性があります。

概要

害虫による荒廃は、森林と農業の生態系の両方に大きな生態学的および経済的損失をもたらしました。ほとんどの農業害虫は、宿主植物に損害を与えながら、天敵や人工的な防除剤にさらされます。それどころか、森林ウッドボーラー(FWB)は、宿主樹の幹¹内で全発生サイクルをほぼ完了するため、野生野外でFWBから効率的な生物防除生物を探索するための大きな課題が提起されています。さらに悪いことに、FWBは多数の植物病原体²を保有しているか、これらの病原体と密接な関係を潜在的な媒介者^として3,4持っており、森林の健康に対するFWBの悪影響を劇的に増幅しています。化学殺虫剤の過剰使用はFWBの重症度を緩和することができるが、殺虫抵抗性^の出現5,6はそれらの環境への適用を制限する。特定のケースでは、昆虫寄生虫、捕食性節足動物、および昆虫病原性微生物が生物防除剤として^FWB7の分布領域に放出され、化学的防除^8,9,10

プロトコル

1. M. alternatus からの菌類の単離(図1)

1. カブトムシのサンプルを採取する
   1. マツノコギリカブトムシMを収集します。商業用トラップ(資料表を参照)を使用して、自然に感染した松林のカブトムシ個体群の予測出現期間の前に誘引剤を餌にしたオルタナタス。
      注:この研究では、カブトムシは中国南部の5つの地理的地域(湖州/浙江省、梁山/四川省、厦門/福建省、韶関/広東省、楡林/広西チワン族自治区)から収集されました。トラップの仕掛けは、上から順に、丸型天板(直径50cm)、十字型パネル(幅35cm、長さ66cm)、漏斗(上丸型35.5cm、底丸型5.5cm)、コレクションカップ(直径10.5cm、長さ26.5cm)です。宿主の揮発性物質(例えば、エタノールおよびα−ピネン)および凝集フェロモン(2−ウンデシルオキシ−1−エタノール)は、ベイト³⁰として使用される。
   2. 試料を実験室に移す前に、試料にラベルを貼ってください。各カブトムシを新鮮な小枝で個々の滅菌チューブに入れます。小枝は2日ごとに新しい小枝と交換してください。
   3. ....

ディスカッション

FWBの異なる地理的集団は、EPF種の局所的な気候要因への長期的な環境適応および宿主昆虫の特定の遺伝子型集団^44,45のために、天然の昆虫病原性真菌とのさまざまな相互作用を発達させる可能性がある。サンプリングサイトを複数の昆虫発生地域に拡大することは、農業害虫に関する先行研究で説明されているように、自?.......

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL, 2 mL centrifuge tubes	Biosharp	BS-15-M
10 µL pipet tips	Sangon Biotech	F601216
10 µL, 20 µL, 100 µL, 200 µL, 1,000 µL pipettes	Rainin
1,000 µL pipet tips	Sangon Biotech	F630102
2 mL cryogenic vials	Corning	430659
20x PBS buffer	Sangon Biotech	B548117-0500
200 µL pipet tips	Sangon Biotech	F601227
2,000 bp maker	TaKaRar	SD0531
50 mL tubes	Nest	602052
50% glutaraldehyde solution	Sangon Biotech	G916054
50x TAE buffer	Sangon Biotech	B548101
6x loading buffer	TaKaRar	SD0503
Agarose	Sangon Biotech	A610013
Anhydrous ethanol	Jkchemical	LB10V37
Biochemistry Cultivation Cabinet	Shanghaiyiheng	LRH-250F
Chloroform	Juhua	61553
Commercial beetle traps	FEIMENGDI	BF-8	www.yinyouji.com
Gel imager	Bio-Rad	GelDoc XR+
Glycerol	Sangon Biotech	A600232
High speed refrigerated centrifuge	Sigma	D-37520
High-Pressure Steam Sterilization Pot	Mettler Toledo	JA5003
Isopropyl alcohol	General-reagent	G75885B
Nucleic acid dye	Sangon Biotech	A616696
Optical Microscope, OM	Leica	DM2000
Parafilm	Parafilm	PM996
PCR meter	Heal Force	Trident960
Penicillin G	Marklin	GB15743
Potato dextrose agar, PDA	Oxoid	CM0139
Potato dextrose broth, PDB	Solarbio	P9240
Primers	Sangon Biotech	/
Primers Taq	TaKaRar	RR902A
Rapid Fungi Genomic DNA Isolation Kit	Sangon Biotech	B518229
Scanning Electron Microscope, SEM	Hitachi	S-3400N
Streptomycin	Marklin	S6153
Tetracycline	Marklin	T829835
Tween-80	Marklin	T6336
Vacuum freeze dryer	Yamato	DC801
Vortex Shaker	HLD	WH-861
β-Mercaptoethanol	Marklin	M6230