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要約

ここでは、森林のウッドボーラーから昆虫病原性真菌を取得するためのプロトコルと、鞘翅目モデル昆虫を使用してそれらの昆虫病原性活性を評価するための代替方法を示します。この方法は、自然林の木材を退屈する害虫から昆虫病原性真菌資源を探索するのに効率的で便利です。

要約

森林ウッドボーラー(FWB)は、世界中で深刻な樹木の損傷と経済的損失を引き起こしています。FWBの出現期間中の昆虫病原性真菌(EPF)の放出は、化学的防除の許容可能な代替手段と考えられています。しかし、農業害虫とは対照的に、FWBのEPF資源は大幅に調査されていません。この論文では、野生の Monochamus alternatus 個体群を例に、FWBからEPFリソースを探索するためのプロトコルを紹介します。このプロトコルでは、トラップの割り当ては Mで餌付けされました。異なる集団への 代替 誘引物質は、カブトムシの出現期間中に、自然感染症状を伴う適切なサンプルの収集を保証しました。外皮を細かく解剖し、選択的な培地に置いた後、カブトムシの体の各部分から真菌種を単離し、分子形質と形態学的形質の両方に基づいて同定しました。

いくつかの真菌種は、健康な M. alternatus の胞子懸濁液による再感染により、寄生性EPFとして認定されました。 M. alternatus の行動表現型を走査型電子顕微鏡を用いて観察し、さらに鞘翅目モデル昆虫 Tribolium castaneumの行動表現型と比較した。両方の甲虫種で一貫した寄生表現型を示すEPFについて、 Tでのそれらの活性の評価。 カスタネウム は、 M. alternatusの将来の研究に致死性に関する貴重な情報を提供しました。このプロトコルは、中国の M. alternatus 個体群について新たに報告されたEPFの発見に役立ち、他のFWBからより多くのEPFリソースを探索するための効率的なアプローチとして適用できる可能性があります。

概要

害虫による荒廃は、森林と農業の生態系の両方に大きな生態学的および経済的損失をもたらしました。ほとんどの農業害虫は、宿主植物に損害を与えながら、天敵や人工的な防除剤にさらされます。それどころか、森林ウッドボーラー(FWB)は、宿主樹の幹1内で全発生サイクルをほぼ完了するため、野生野外でFWBから効率的な生物防除生物を探索するための大きな課題が提起されています。さらに悪いことに、FWBは多数の植物病原体2を保有しているか、これらの病原体と密接な関係を潜在的な媒介者として3,4持っており、森林の健康に対するFWBの悪影響を劇的に増幅しています。化学殺虫剤の過剰使用はFWBの重症度を緩和することができるが、殺虫抵抗性の出現5,6はそれらの環境への適用を制限する。特定のケースでは、昆虫寄生虫、捕食性節足動物、および昆虫病原性微生物が生物防除剤としてFWB7の分布領域に放出され、化学的防除8,9,10に代わる効率的で経済的に許容できる代替手段であることが証明されました。

昆虫病原性真菌(EPF)は、他のほとんどの微生物群よりもFWBを制御する上で優れていると考えられています。それらの胞子は、昆虫の宿主によって運ばれ、キューティクルまたは外皮8,11への浸透を通じて体表面に安定して固定することができる。EPFはまた、環境ストレスに対する優れた適応性を示し、一部の種はエンドファイト12,13として樹木の組織によくコロニーを形成し、それらの成長、生存、および伝達を促進します。しかし、農業産業のそれと比較して、自然林の生態系で使用されるEPFの種の多様性は著しく制限されています14,15,16。Beauveria bassiana(株PPRI 5339)は、南アフリカのユーカリゾウムシ17とBの2つの有望な分離株の組み合わせにIPMプログラムを促進するための最も有望な株として証明されました。 bassianaは、ヤシの木の畑18のさまざまな生活段階で、アカヤシゾウムシ、Rhynchophorus ferrugineusの実用的な微生物制御の機会を提供しました。Beauveriaとよく知られているMetarhiziumに加えて、Hypocreales目の他のEPF属、特にLecanicilliumの種(その多くは現在Akanthomyces属に分類されています19,20)は、チリのヒノキアブラムシなどの森林害虫の管理において強い病原性と高い可能性を示しました21。

マツノコギリハムシMonochamus alternatusは、中国および近隣諸国の悪名高い松林の害虫であり、松の木の枝や幹に穴を掘り、栄養素と水の輸送を妨げます22,23,24。さらに、M. alternatusはまた、植物寄生性のマツノザイセンチュウ(Bursaphelenchus xylophilus、PWN)の主要なベクターカブトムシとしての侵入を促進します。カブトムシの別の同属種、M。 galloprovincialisは、近年、ヨーロッパのいくつかの国でPWNを広めています25。以前の研究では、スペイン、日本、および中国の安徽省/浙江省で、Beauveria、Metarhizium、Lecanicillium(Verticillium、Lecanicilliumの旧名)など、Monochamus spp.からの天然EPFのいくつかの属が報告されています26,27,28,29.それにもかかわらず、これらのEPFのコレクションは、自然界でのカブトムシの広範な発生と比較して、一般的に特定の場所で制限されているようです。M. alternatus カブトムシは中国に地理的に広く分布しているため、さまざまな個体群でより多くの潜在的なEPFを探索するための代表的な木材穴あけ器と見なすことができます。

本プロトコルでは、 Mのいくつかの地理的集団からのEPFを調査する特定の手順を紹介します。中国南部の alternatus 。このプロトコルは、試験された真菌種が両方のカブトムシ種に対して一貫した行動表現型を有するという条件下で、昆虫病原性アッセイを実施するための代替としてモデル鞘翅目カブトムシを使用します。このプロトコルは、昆虫病原性真菌種の多様性が過小評価されているか、あまり調査されていない他の森林ウッドボーラーのEPF探査に関する洞察も提供できます。

プロトコル

1. M. alternatus からの菌類の単離(図1)

  1. カブトムシのサンプルを採取する
    1. マツノコギリカブトムシMを収集します。商業用トラップ(資料表を参照)を使用して、自然に感染した松林のカブトムシ個体群の予測出現期間の前に誘引剤を餌にしたオルタナタス。
      注:この研究では、カブトムシは中国南部の5つの地理的地域(湖州/浙江省、梁山/四川省、厦門/福建省、韶関/広東省、楡林/広西チワン族自治区)から収集されました。トラップの仕掛けは、上から順に、丸型天板(直径50cm)、十字型パネル(幅35cm、長さ66cm)、漏斗(上丸型35.5cm、底丸型5.5cm)、コレクションカップ(直径10.5cm、長さ26.5cm)です。宿主の揮発性物質(例えば、エタノールおよびα−ピネン)および凝集フェロモン(2−ウンデシルオキシ−1−エタノール)は、ベイト30として使用される。
    2. 試料を実験室に移す前に、試料にラベルを貼ってください。各カブトムシを新鮮な小枝で個々の滅菌チューブに入れます。小枝は2日ごとに新しい小枝と交換してください。
    3. 生きたカブトムシを25±1°Cで非加湿インキュベーター(16-8 L / Dサイクル)で飼育し、毎日観察します。
    4. 摂食と可動性の低下を示すサンプルを記録します。デッド Mを転送します。真菌の菌糸体と分生子の成長を観察するために、湿ったチャンバーに硬化して硬くなる オルタナタス 。
      注:昆虫病原性真菌に感染すると、カブトムシは感染の初期段階で摂食と運動性の低下を示しました31,32。死後、彼らの体は硬化して硬くなり、湿った部屋に保管された数日後に菌糸体と分生子が現れました33。
    5. 真菌感染症のカブトムシの死体は、将来使用するために4°Cで保管してください。このプロトコルに従うには、数時間以内にサンプルをすぐに処理して、より腐生性の真菌による汚染を避けてください。
  2. 成長培地の調製
    1. 39 gのジャガイモデキストロース寒天(PDA)粉末を1 Lの純水に加え、121°Cで30分間オートクレーブします。
    2. 動作可能な温度(~50°C)まで冷却し、ストレプトマイシン0.05g、ペニシリンG0.05g、テトラサイクリン0.05gを加え、振とうして培地を分散させます。
    3. 培地を清潔なベンチの下でペトリ皿に盛り付け、固化させてから使用します。
      注:抗生物質を含むPDA培地は、カブトムシからの分離に使用され、分離中の真菌の増殖に影響を与えることなく細菌の増殖を防ぎます。しかし、抗生物質を含まないPDA培地は、日々の栽培と保存に使用されています。
    4. 35 gのジャガイモデキストロースブロス(PDB)粉末を1 LのddH2Oに入れ、121°Cで30分間オートクレーブします。 冷やして使用してください。
  3. 真菌感染症の症状を伴うカブトムシサンプルの解剖
    1. 滅菌したハサミ、メス、虫ピンを準備します。その後、アルコールバーナーのあるクリーンベンチの下で作業します。
      注:解剖ツールの使用は、個人の好みに応じて調整できます。昆虫ピンは標準的な解剖針よりも鋭く、異なる仕様で解剖のニーズを満たすことができます。
    2. カブトムシの体外皮を滅菌および使い捨てのペトリ皿のツールで解剖します。中腸組織と後腸組織に損傷を与え、内部内容物が滲み出る可能性を避けるように注意してください。
    3. カブトムシの体を次のように主な位置に分けます:アンテナ、頭、胸部、腹部、翼(各ペア)、および脚。
  4. 菌類の精製
    1. 各ポジションの外皮をハサミで細かく切ります。抗生物質でPDAプレートの表面に外面をそっと押し付けます。
      注:外皮の真菌菌糸体がプレートに接種されていることを確認してください。
    2. パラフィルムで慎重に密封し、組織が菌糸体で完全に覆われるまで、25±1°Cのインキュベーターで培養します。
    3. 表現型特性(色、形状)に従って、1コロニーを抗生物質を含む新しいPDAに移し、25°C±1°Cで培養します。
    4. PDAと抗生物質でステップ1.4.3を2回または3回繰り返し、純粋なコロニーが別々に単離されるまで繰り返します。
      注:元のプレートで複数の真菌株が成長する場合は、菌糸体を正確に選択して、より多くの真菌種の選別を容易にします。
  5. 真菌分離物の保管
    1. 寒天ブロック(直径~5 mm)をコロニーから新しいPDAプレートに移します。
    2. インキュベーターで25±1°Cで1〜2週間培養します。
    3. 4°Cの冷蔵庫に入れて毎日保管し、さらに使用してください。
    4. 真菌株を250 mLフラスコ中の50 mLの滅菌PDBに接種し、25°Cで180 rpm / minで5〜7日間振とうします。
    5. 新たに成長した真菌菌糸体1mLを採取し、2mLの滅菌冷凍チューブ(グリセロールの最終濃度は10%)の滅菌済み20%グリセロール1mLに懸濁します。
    6. チューブをパラフィルムで密封し、-20°Cおよび-40°Cで予冷します。 次に、チューブをストックとして-80°Cに保ちます。

2. 真菌分離株の分子的および形態学的同定

  1. 真菌ゲノムDNAの抽出
    1. PDBで菌類を培養する(ステップ1.5.4で説明)。
    2. 菌糸体を採取し、ろ過してPDBから分離します。予冷した乳鉢と乳棒を使用して液体窒素で均質化します。
    3. 製造元の指示に従って、Fungi Genomic DNA Isolation Kitを使用してゲノムDNAを抽出します( 資料の表を参照)。
  2. PCR増幅とDNAシーケンシング
    1. 25 μLのTaq DNAポリメラーゼ、1 μLのテンプレート、2 μLのフォワードプライマーおよびリバースプライマー、およびddH2Oを合計容量50 μLまで、PCR反応混合物を調製します。
    2. プライマーペアITS1およびITS434 ( 表1を参照)を使用して、DNAサンプルのrDNA-ITS領域を増幅します。最初の変性を95°Cで4分間行い、続いて94°Cで35サイクルの変性を60秒間行い、58°Cで60秒間アニーリングし、72°Cで2分間伸長します。 72°Cで10分間の最終伸長。
    3. 1.5%アガロースゲルを用いた増幅生成物の電気泳動、100 V、100 mA
    4. PCRをシーケンシングします。
    5. Clustal X2.0 と MEGA 6.0 を使用してシーケンスをアライメントします。
      注:シーケンスアラインメント中、アラインメントが曖昧な部位は除外され、ギャップは欠損データとして扱われます。
    6. 取得した配列を、National Center for Biotechnology Information(NCBI)のウェブサイトでBLASTを使用してGenBankのITS配列データベースと比較します。真菌株の種情報を事前に特定します。
  3. 形態学的同定
    1. カメラを使用して、PDAプレートの表側と裏側の両方で成熟した真菌の純粋なコロニー形態をキャプチャします。
    2. 純粋な培養真菌のコロニーから分生子を接種針で摘み取り、滅菌水を一滴加えたスライドガラスに移します。
    3. カバースリップを持ち、~45°の角度でゆっくりと下ろし、カバースリップが気泡なく試料を覆うようにします。
    4. 真菌コロニーの端にあるコロニーからのメスで5 mm2 の寒天ブロックを切り取り、滅菌水を一滴加えたきれいなスライドガラスに移します。細い針で菌類を慎重に引き離し、特定の構造を確認します。
    5. 手順2.3.3を繰り返します。
    6. 光学顕微鏡(OM)で菌類の無性形態を観察し、菌糸、分生子の形状、透明度、姿勢などを観察します。無性特性の形状とサイズを記録して測定し、異なる真菌分離株を互いに区別します。
      注:真菌の構造を観察する能力を最大限に高めるために、染色剤と封入剤35を使用してください。

3. M. alternatusの真菌感染症状の誘導による行動表現型の観察

  1. 分生子懸濁液の調製
    1. 0.01% Tween-80を純水で調製し、121°Cで25分間オートクレーブします。 冷却後に使用してください。
    2. 適量の滅菌済み小さなガラスビーズと0.01% Tween-80溶液を2 mLの遠心チューブに加えます。
    3. 真菌のコロニーをチューブにこすり落とし、コロニーが壊れるまでボルテックスシェーカーで十分に振ってください。2層のガーゼを濾過して菌糸体を取り除きます。
      注:振とうは、0.01%Tween-80溶液中の分生子胞子の懸濁液を確保するために行われます。
    4. 血球計算盤でOMの下の胞子の数を数え、滅菌0.01%Tween-80で1 × 108 conidial/mLに調整し、4°Cで保存して使用します。
  2. カブトムシの準備
    1. 松の小枝(ほぼ同じサイズ)をオートクレーブにし、オーブン(~60°C)で乾燥させます。
    2. フィールド収集 M を保持します。25±1°Cのインキュベーター内の松の小枝を持つ オルタナタス 成虫。
    3. カブトムシを24時間飢餓状態にし、使用前にカブトムシの表面を漂白剤、エタノール、蒸留水[10:10:80(v:v)]で滅菌します。
  3. 真菌感染症の誘発
    1. 清潔なベンチの下で作業し、松の小枝を分生子懸濁液に10秒間浸し、空気中で乾燥させます。
    2. カブトムシを分生子懸濁液に10秒間浸し、50 mLの滅菌チューブ(チューブごとに1匹のカブトムシと1本の小枝)に移します。小枝は2日ごとに新しいものと交換してください。
    3. ネガティブコントロールのために、分生子懸濁液を滅菌0.01%Tween-80溶液のみに交換します。.各真菌株および対照群に対して5回の反復を行います。
    4. マツの小枝で生成されるフラスの量に基づいて、カブトムシの活動を評価します。摂食が止まったら、死んだと考えてください。
    5. 死んだカブトムシを新しい滅菌50mLチューブに移し、滅菌湿った綿を入れます。25 ± 1 °Cでインキュベートします。
      注:湿った綿は、菌類の成長には適切な水分が必要ですが、多すぎないようにするため、湿度を維持するために使用されます。
    6. 毎日同時にカブトムシの表面の変化を観察し、写真を撮ります。
  4. 真菌種の再分離と確認
    1. カブトムシの表面に明確な真菌感染の表現型が現れるまで、さまざまな組織から個々の菌糸体を新しいPDAプレートに選びます。
    2. 25°C±1°Cで培養し、観察して、接種した真菌の形態と一致していることを確認します。
  5. モデルカブトムシの治療
    1. モデルカブトムシ Tribolium castaneumで手順3.2.1-3.3.6を繰り返し、小麦ふすまを食品として使用し、小麦ふすまをUV光で滅菌します。
    2. 滅菌ピンセットでカブトムシに軽く触れます。応答がない場合は、彼らが死んでいると仮定します。

4. M. alternatus およびモデルカブトムシに対する真菌の感染表現型の確認

  1. 観察のためのサンプル調製
    1. 感染した Mを解剖します。ステップ1.3のように 慎重に死体を交互 に。
    2. Tを選びます。真菌感染症の明らかな症状を伴うカスタネウム体。
    3. PDAで増殖する4つの成熟真菌コロニーの5mmディスクプラグを切断します。
  2. サンプル前処理
    1. プラグ、感染したカブトムシ組織、および体を、予冷した2.5%グルタルアルデヒドに4°Cで2日間入れます。
    2. 0.1%リン酸緩衝液(pH 7.2-7.4)でサンプルを3回5分間洗浄し、30%、50%、70%、80%、90%、95%、100%エタノールで10分間脱水します。
    3. サンプルを真空凍結乾燥機で乾燥させます。
      注:サンプルの損傷を防ぐために、切断、浸漬、脱水、洗浄、乾燥など、前処理プロセス全体に注意する必要があります。
  3. 走査型電子顕微鏡(SEM)観察
    1. 前処理した試料をスパッタコーターを用いて白金でコーティングし、走査型電子顕微鏡36で観察する。
    2. PDAで成長する菌糸と分生子の形態学的特性を記録する、 M. alternatus 組織、およびモデルカブトムシの体。
    3. 結果がステップ2.3のOMの結果と一致しているかどうかを比較します。

5. 昆虫病原性活性の評価

  1. 分生子懸濁液の調製
    1. 分生子懸濁液の調製は、ステップ3.1.1-3.1.4と同じです。
  2. モデルカブトムシの前処理
    1. Tを培養し、餌を与え、滅菌し、飢えさせます。ステップ 3.5.1 の castaneum と同じです。
    2. 小麦ふすまをUVで滅菌し、滅菌したペトリ皿に同じ重量を置きます。
  3. 昆虫病原性活性試験
    1. 小麦ふすまを分生子懸濁液で処理し、室温のきれいなベンチの下で空気中で乾燥させます。
    2. Tを浸す。カスタネウムカブトムシを分生子懸濁液中で10秒間移動させ、それらをペトリ皿に移します(各ペトリ皿でn = 20)。新しい小麦ふすまを4日ごとに同じ分生子処理に交換します。
    3. ネガティブコントロールには、滅菌済みの0.01%Tween-80溶液のみを適用してください。
      注:各治療群とコントロールに対して少なくとも3回の繰り返しを確保しておきます。
    4. 毎日死んだカブトムシを数えます。
      注意: 滅菌ピンセットでカブトムシに軽く触れます。応答が不足している場合は、彼らが死んでいると仮定します。
  4. 多遺伝子系統解析
    1. ステップ2.1で説明したように、昆虫病原性真菌ゲノムDNAを抽出します。
      注:モデルカブトムシに対して有意な感染表現型と強い昆虫病原性活性を示す寄生性EPFに対して、多遺伝子同定が行われます。
    2. 核リボソームSSU34遺伝子にまたがる領域、大きなサブユニットrRNA遺伝子の一部(LSU37,38)、伸長因子1-α(tef-1α39)遺伝子の一部、RNAポリメラーゼІІの2番目に大きいサブユニット配列(rpb240)、およびβ-チューブリンの一部を含む、次の遺伝子を増幅します41遺伝子、プライマーペアNS1/NS4、LR7/LROR、EF-983F/EF-2218R、RPB2-5'F/RPB2-5'R、およびTUB1/TUB22(表1参照)をそれぞれ使用して。
      1. ステップ2.2.1のようにPCR反応混合物を調製します。
      2. 増幅は、95°Cで4分間の初期変性、続いて35サイクル(tef-1α、 rpb2、 SSU)、38サイクル(LSU)、または39サイクル(β-チューブリン)で94°Cで60秒間変性、47°Cで60秒間(LSU)、55°Cで60秒間(tef-1α)、54°Cで40秒間(β-チューブリン)、および50°Cで30秒間(rpb2、 SSU)、72°Cで1分間の伸び、および72°Cで10分間の最終伸び。
    3. 手順2.2.4-2.2.5に示されているのと同じ手順に従って、シーケンスとアライメントを行います。
    4. 最尤法(ML)法42に基づき、MEGA 6.0による系統解析を行う。

結果

Mからの真菌分離株の単離と同定。 オルタナタス
誘引トラップの助けを借りて、多数の(合計約500匹のカブトムシ) のM。 alternatus は5つの地理的地域から収集されました。昆虫病原性真菌による感染の典型的な症状を持つカブトムシの死体が選ばれました。次に、すべてのカブトムシの体外皮を、プロトコルステップ1.3で説明?...

ディスカッション

FWBの異なる地理的集団は、EPF種の局所的な気候要因への長期的な環境適応および宿主昆虫の特定の遺伝子型集団44,45のために、天然の昆虫病原性真菌とのさまざまな相互作用を発達させる可能性がある。サンプリングサイトを複数の昆虫発生地域に拡大することは、農業害虫に関する先行研究で説明されているように、自?...

開示事項

著者は、利益相反を宣言しません。

謝辞

本研究は、National Key Research and Development Program of China(2021YFC2600100)およびThe Natural Science Foundation of Zhejiang Province(LY21C040001)の支援を受けて行われました。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
1.5 mL, 2 mL centrifuge tubesBiosharpBS-15-M
10 µL pipet tipsSangon BiotechF601216
10 µL, 20 µL, 100 µL, 200 µL, 1,000 µL pipettesRainin
1,000 µL pipet tipsSangon BiotechF630102
2 mL cryogenic vialsCorning430659
20x PBS bufferSangon BiotechB548117-0500
200 µL pipet tipsSangon BiotechF601227
2,000 bp makerTaKaRarSD0531
50 mL tubesNest602052
50% glutaraldehyde solutionSangon BiotechG916054
50x TAE bufferSangon BiotechB548101
6x loading bufferTaKaRarSD0503
AgaroseSangon BiotechA610013
Anhydrous ethanolJkchemicalLB10V37
Biochemistry Cultivation CabinetShanghaiyihengLRH-250F
ChloroformJuhua61553
Commercial beetle trapsFEIMENGDIBF-8www.yinyouji.com
Gel imagerBio-RadGelDoc XR+
GlycerolSangon BiotechA600232
High speed refrigerated centrifugeSigmaD-37520
High-Pressure Steam Sterilization PotMettler ToledoJA5003
Isopropyl alcoholGeneral-reagentG75885B
Nucleic acid dyeSangon BiotechA616696
Optical Microscope, OMLeicaDM2000
ParafilmParafilmPM996
PCR meterHeal ForceTrident960
Penicillin GMarklinGB15743
Potato dextrose agar, PDAOxoidCM0139
Potato dextrose broth, PDBSolarbioP9240
PrimersSangon Biotech/
Primers TaqTaKaRarRR902A
Rapid Fungi Genomic DNA Isolation KitSangon BiotechB518229
Scanning Electron Microscope, SEMHitachiS-3400N
StreptomycinMarklinS6153
TetracyclineMarklinT829835
Tween-80MarklinT6336
Vacuum freeze dryerYamatoDC801
Vortex ShakerHLDWH-861
β-MercaptoethanolMarklinM6230

参考文献

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