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요약

여기에서 우리는 숲 나무 천공충에서 곤충병원성 균류를 얻기 위한 프로토콜과 딱정벌레목 모델 곤충을 사용하여 곤충병원성 활성을 평가하는 대체 방법을 제시합니다. 이 방법은 자연 산림에서 나무를 뚫는 곤충 해충으로부터 곤충 병원성 곰팡이 자원을 탐사하는 데 효율적이고 편리합니다.

초록

FWB(Forest Wood Borers)는 전 세계적으로 심각한 나무 피해와 경제적 손실을 초래합니다. FWB 출현 기간 동안 곤충병원성 곰팡이(EPF)의 방출은 화학적 방제에 대한 수용 가능한 대안으로 간주됩니다. 그러나 EPF 자원은 농업 해충과 달리 FWB에 대해 훨씬 덜 탐사되었습니다. 이 논문은 야생 Monochamus alternatus 개체군을 예로 들어 FWB에서 EPF 자원을 탐색하기 위한 프로토콜을 제시합니다. 이 프로토콜에서 함정 할당은 M으로 미끼입니다. 다른 개체군에 대한 Alternatus 유인제는 딱정벌레의 출현 기간 동안 자연 감염 증상이 있는 적절한 샘플의 수집을 보장했습니다. 외피를 정교하게 해부하여 선택적 배지에 놓은 후, 딱정벌레 몸체의 각 부분에서 곰팡이 종을 분리하고 분자 및 형태 학적 특성을 기반으로 식별했습니다.

몇몇 곰팡이 종은 포자 현탁액과 함께 건강한 M. alternatus 의 재감염을 통해 기생 EPF로 인증되었습니다. M. alternatus 에 대한 그들의 행동 표현형은 주사 전자 현미경을 사용하여 관찰되었으며 딱정벌레목 모델 곤충 Tribolium castaneum의 표현형과 추가로 비교되었습니다. 두 딱정벌레 종 모두에서 일관된 기생 표현형을 나타내는 EPF의 경우 T에 대한 활성 평가. castaneum 은 M. alternatus에 대한 향후 연구를 위해 치사율에 대한 귀중한 정보를 제공했습니다. 이 프로토콜은 중국의 M. alternatus 개체군에 대해 새로 보고된 EPF를 발견하는 데 도움이 되었으며, 이는 다른 FWB에서 더 많은 EPF 자원을 탐색하기 위한 효율적인 접근 방식으로 적용될 수 있습니다.

서문

해충으로 인한 황폐화는 산림과 농업 생태계 모두에서 큰 생태학적, 경제적 손실을 초래했습니다. 대부분의 농업 해충은 천적이나 인공 방제제에 노출되면서 숙주 식물에 피해를 줍니다. 대신, 산림나무천공자(FWB)는 숙주나무 줄기1 내에서 전체 발달 주기를 거의 완료하는데, 이는 야생에서 FWB의 효율적인 생물 방제 유기체를 탐색하는 데 큰 도전을 제기합니다. 더욱 심각한 것은 FWB가 많은 수의 식물병원체2를 운반하거나 이러한 병원체와 잠재적인 매개체3,4로서 밀접한 관계를 맺고 있어 FWB가 산림 건강에 미치는 부정적인 영향을 극적으로 증폭시킨다는 것이다. 화학 살충제의 과도한 사용은 FWB의 심각성을 완화할 수 있지만, 살충 내성 5,6의 출현은 환경 적용을 제한한다. 특정 경우에, 곤충 기생충, 포식성 절지동물 및 곤충병원성 미생물이 생물방제로서 FWB7의 분포 영역에 방출되었으며, 화학적 방제에 대한 효율적이고 경제적으로 수용 가능한 대안으로 입증되었다 8,9,10.

곤충병원성 진균(EPF)은 대부분의 다른 미생물 그룹에 비해 FWB를 제어하는 데 이점이 있는 것으로 간주됩니다. 그들의 포자는 곤충 숙주에 의해 운반 될 수 있으며 표피 또는 외피(8,11)로의 침투를 통해 신체 표면에 안정적으로 고정 될 수 있습니다. EPF는 또한 환경 스트레스에 대한 우수한 적응력을 나타내며 일부 종은 내생식물12,13로 나무 조직에 잘 식민지화되어 성장, 생존 및 전달을 용이하게 합니다. 그러나 농업 산업과 비교할 때 자연 산림 생태계에서 사용되는 EPF의 종 다양성은 현저히 제한되어 있습니다 14,15,16. Beauveria bassiana (균주 PPRI 5339)는 남아프리카 공화국의 유칼립투스 바구미17에 대한 IPM 프로그램을 홍보하는 가장 유망한 균주와 B의 두 유망한 분리물의 조합으로 입증되었습니다. Bassiana는 야자수 밭의 다양한 생활 단계에서 붉은 야자 바구미, Rhynchophorus ferrugineus의 실용적인 미생물 방제를위한 기회를 제공했습니다18. Beauveria와 잘 알려진 Metarhizium 외에도 Hypocreales 목의 다른 EPF 속, 특히 Lecanicillium 종 (그 중 다수는 현재 Akanthomyces19,20 속으로 분류됨)은 칠레의 사이프러스 진딧물과 같은 산림 해충 관리에서 강한 병원성과 높은 잠재력을 보여주었습니다21.

소나무 톱질 딱정벌레 Monochamus alternatus는 중국과 이웃 국가에서 악명 높은 소나무 숲 해충으로, 소나무의 가지와 줄기에 굴을 파고 들어가 영양분과 물의 수송을 방해합니다 22,23,24. 게다가, M. alternatus는 또한 식물 기생 소나무 선충 (Bursaphelenchus xylophilus, PWN)의 침입을 주요 벡터 딱정벌레로 촉진합니다. 딱정벌레의 또 다른 동종 종인 M. galloprovincialis는 최근 몇 년 동안 유럽의 여러 국가에서 PWN을 퍼뜨렸습니다25. 이전 연구에서는 스페인, 일본 및 중국의 안후이/저장성에서 Beauveria, Metarhizium 및 Lecanicillium(Verticillium, Lecanicillium의 이전 이름)과 같은 Monochamus spp.의 여러 천연 EPF 속을 보고했습니다 26,27,28,29. 그럼에도 불구하고, 이러한 EPF의 수집은 자연 분야에서 Monochamus 딱정벌레의 광범위한 발생에 비해 특정 위치에서 일반적으로 제한되는 것으로 보입니다. M. alternatus 딱정벌레는 중국에서 광범위한 지리적 분포를 가지고 있기 때문에 다양한 개체군에 걸쳐 더 많은 잠재적인 EPF를 탐색하기 위한 대표적인 목재 보어로 간주될 수 있습니다.

본 프로토콜에서는 M의 여러 지리적 집단에서 EPF를 탐색하는 특정 절차를 소개합니다. 중국 남부의 alternatus . 이 프로토콜은 테스트된 곰팡이 종이 두 딱정벌레 종 모두에서 일관된 행동 표현형을 갖는 조건에서 곤충 병원성 분석을 수행하기 위해 모델 딱정벌레 딱정벌레를 대체품으로 사용합니다. 이 프로토콜은 또한 곤충병원성 곰팡이 종의 다양성이 과소평가되거나 덜 조사되는 다른 산림 목재 보어에 대한 EPF 탐사에 대한 통찰력을 제공할 수 있습니다.

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프로토콜

1. M. alternatus 에서 곰팡이 분리(그림 1)

  1. 딱정벌레 표본 수집
    1. 소나무 sawyer 딱정벌레 M을 수집하십시오. 자연적으로 감염된 소나무 숲에서 딱정벌레 개체군의 예측된 출현 기간 전에 유인제로 미끼를 던진 상업용 트랩(재료 표 참조)을 사용하는 Alternatus.
      참고: 이 연구에서는 중국 남부의 5개 지역(후저우/저장, 량산/쓰촨, 샤먼/푸젠성, 사오관/광동, 위린/광시)에서 딱정벌레를 수집했습니다. 위에서 아래로 트랩 설정은 둥근 상단(지름 50cm), 십자형 패널(폭 35cm, 길이 66cm), 깔때기(상단 원형 지름 35.5cm, 하단 원형 지름 5.5cm), 수집 컵(지름 10.5cm, 길이 26.5cm)입니다. 숙주 휘발성 물질(예: 에탄올 및 α-피넨) 및 응집 페로몬(2-운데실옥시-1-에탄올)이 미끼(30)로 사용된다.
    2. 실험실로 옮기기 전에 표본에 라벨을 붙입니다. 각 딱정벌레를 신선한 나뭇 가지가있는 개별 멸균 된 튜브에 넣으십시오. 나뭇 가지를 2 일마다 신선한 것으로 교체하십시오.
    3. 살아있는 딱정벌레를 25 ± 1 °C에서 비가습 인큐베이터(16-8 L/D 주기)에서 사육하고 매일 관찰합니다.
    4. 수유 및 이동성 감소를 보여주는 샘플을 기록하십시오. 데드 M을 옮깁니다. 곰팡이 균사체와 분생포자의 성장을 관찰하기 위해 젖은 방에 굳어지고 뻣뻣해지는 alternatus .
      참고: 곤충병원성 곰팡이에 감염되면 딱정벌레는 감염 초기 단계에서 섭식과 이동성의 감소를 보였다31,32. 사망 후, 그들의 몸은 굳어지고 뻣뻣해졌으며, 균사체와 분생포자(conidia)는 습한 방(33)에 보관된 후 몇 일 후에 나타났다.
    5. 곰팡이 감염이 있는 딱정벌레 사체는 나중에 사용할 수 있도록 4°C에서 보관하십시오. 이 프로토콜을 따르려면 더 많은 부영양성 곰팡이에 오염되지 않도록 몇 시간 내에 샘플을 즉시 처리하십시오.
  2. 성장 배지의 준비
    1. 39g의 감자 포도당 한천(PDA) 분말을 순수한 물 1L에 넣고 121°C에서 30분 동안 고압멸균합니다.
    2. 작동 가능한 온도(~50°C)로 식히고 스트렙토마이신 0.05g, 페니실린 G 0.05g, 테트라사이클린 0.05g을 넣고 흔들어 배지를 분포시킵니다.
    3. 깨끗한 벤치 아래에서 매체를 페트리 접시에 담아 응고 후 사용하십시오.
      참고: 항생제가 포함된 PDA 배지는 딱정벌레로부터 분리하는 데 사용되며, 이는 격리 중 곰팡이 성장에 영향을 주지 않고 박테리아의 성장을 방지합니다. 그러나 항생제가 없는 PDA 배지는 일상적인 재배 및 보존을 위해 사용됩니다.
    4. 35g의 감자 포도당 육수(PDB) 분말을 ddH2O 1L에 넣고 121°C에서 30분 동안 고압멸균합니다. 식혀서 사용하십시오.
  3. 곰팡이 감염 증상이 있는 딱정벌레 샘플의 해부
    1. 멸균 된 가위, 메스 및 곤충 핀을 준비하십시오. 그런 다음 알코올 버너가 있는 깨끗한 벤치 아래에서 작업하십시오.
      알림: 해부 도구의 사용은 개인 취향에 따라 조정할 수 있습니다. 곤충 핀은 표준 해부 바늘보다 날카롭고 다양한 사양으로 해부의 필요성을 충족시킬 수 있습니다.
    2. 멸균 및 일회용 페트리 접시에서 도구를 사용하여 딱정벌레 몸 외피를 해부하십시오. 내부 내용물이 누출될 수 있는 중장과 뒷장 조직의 손상 가능성을 피하십시오.
    3. 딱정벌레 몸을 더듬이, 머리, 흉부, 복부, 날개 (각 쌍) 및 다리와 같이 주요 위치로 나눕니다.
  4. 곰팡이 정화
    1. 각 위치의 외피를 가위로 작은 조각으로 자릅니다. 항생제를 사용하여 PDA 플레이트의 외부 표면을 부드럽게 누릅니다.
      알림: 외피의 곰팡이 균사체가 플레이트에 접종되었는지 확인하십시오.
    2. 파라필름으로 조심스럽게 밀봉하고 조직이 균사체로 완전히 덮일 때까지 25 ± 1 °C의 인큐베이터에서 배양합니다.
    3. 표현형 특성(색상, 모양)에 따른 단일 콜로니를 25 ± 1°C에서 배양용 항생제를 사용하여 새 PDA에 옮깁니다.
    4. 순수한 콜로니가 별도로 분리될 때까지 항생제를 사용하여 PDA에서 1.4.3단계를 두 번 또는 세 번 반복합니다.
      참고: 원래 플레이트에서 여러 곰팡이 균주가 자라는 경우 더 많은 곰팡이 종을 쉽게 분류할 수 있도록 균사체를 정확하게 선택하십시오.
  5. 곰팡이 분리물의 저장
    1. 한천 블록(직경 ~5mm)을 콜로니에서 새 PDA 플레이트로 옮깁니다.
    2. 25 ± 1 °C의 인큐베이터에서 1-2 주 동안 배양.
    3. 나중에 사용할 수 있도록 매일 보관할 수 있도록 4°C 냉장고에 넣으십시오.
    4. 250mL 플라스크에 담긴 50mL의 멸균 PDB에 곰팡이 균주를 접종하고 25°C에서 180rpm/min으로 5-7일 동안 흔듭니다.
    5. 갓 자란 곰팡이 균사체 1mL를 수확하여 2mL 멸균 냉동 튜브에 있는 멸균된 20% 글리세롤 1mL에 현탁시킵니다(글리세롤의 최종 농도는 10%).
    6. 파라필름으로 튜브를 밀봉하고 -20°C 및 -40°C에서 예냉각합니다. 그런 다음 튜브를 -80 °C에서 스톡으로 유지합니다.

2. 분리된 진균의 분자 및 형태학적 식별

  1. 곰팡이 게놈 DNA 추출
    1. 1.5.4단계에서 설명한 대로 PDB의 배양 곰팡이.
    2. 균사체를 수확하고 여과하여 PDB에서 분리합니다. 미리 냉각된 모르타르와 유봉을 사용하여 액체 질소로 균질화합니다.
    3. 제조업체의 지침에 따라 Fungi Genomic DNA Isolation Kit를 사용하여 게놈 DNA를 추출합니다( 재료 표 참조).
  2. PCR 증폭 및 DNA 염기서열분석
    1. PCR 반응 혼합물을 다음과 같이 준비합니다: 25 μL의 Taq DNA 중합효소, 1 μL의 주형, 2 μL의 정방향 및 역방향 프라이머, 및 ddH2O를 총 부피 50 μL로 만듭니다.
    2. 다음 절차에 따라 프라이머 쌍 ITS1 및 ITS434 ( 표 1 참조)를 사용하여 DNA 샘플의 rDNA-ITS 영역을 증폭합니다 : 95 ° C에서 4 분 동안 초기 변성 한 후 94 ° C에서 60 초 동안 변성 35 사이클, 60 초 동안 58 ° C에서 어닐링, 72 ° C에서 2 분 동안 연신율, 72°C에서 10분 동안 최종 연신율.
    3. 100V, 100mA에서 1.5% 아가로스 겔을 사용한 증폭된 제품의 전기영동.
    4. PCR의 염기서열을 분석합니다.
    5. Clustal X2.0 및 MEGA 6.0을 사용하여 시퀀스를 정렬합니다.
      참고: 시퀀스 정렬 중에 모호한 정렬이 있는 사이트는 제외되고 간격은 누락된 데이터로 처리됩니다.
    6. 얻은 염기서열을 NCBI(National Center for Biotechnology Information) 웹 사이트의 BLAST를 사용하여 GenBank의 ITS 염기서열 데이터베이스에 있는 염기서열과 비교합니다. 곰팡이 균주 종 정보를 사전에 식별합니다.
  3. 형태학적 식별(Morphological Identification)
    1. 카메라를 사용하여 PDA 플레이트의 전면과 후면 모두에서 성숙한 곰팡이 순수 콜로니 형태를 캡처합니다.
    2. 접종 바늘로 순수 배양 곰팡이 군체에서 분생포자를 뽑아내고 멸균수 한 방울과 함께 유리 슬라이드로 옮깁니다.
    3. 커버 슬립을 잡고 ~45°의 각도로 천천히 내려놓으면 커버 슬립이 기포 없이 표본을 덮을 수 있습니다.
    4. 곰팡이 식민지의 가장자리에있는 식민지에서 메스로 5mm2 한천 블록을 자르고 멸균수 한 방울로 깨끗한 유리 슬라이드로 옮깁니다. 특정 구조를 보기 위해 가는 바늘로 곰팡이를 조심스럽게 떼어냅니다.
    5. 2.3.3단계를 반복합니다.
    6. 광학 현미경(OM)으로 균사, 분생포자, phialides 및 분생포자의 모양, 투명도 및 자세를 포함하여 균류의 무성 형태를 관찰합니다. 무성생식 특성의 모양과 크기를 기록하고 측정하여 서로 다른 곰팡이 분리체를 구별합니다.
      알림: 곰팡이 구조를 관찰할 수 있는 능력을 최대화하려면 얼룩 및 장착 매체35를 사용하십시오.

3. M. alternatus에 대한 곰팡이 감염 증상 유도를 통해 행동 표현형을 관찰합니다.

  1. 원추형 현탁액의 준비
    1. 순수한 물로 0.01% Tween-80을 준비하고 121°C에서 25분 동안 고압멸균합니다. 냉각 후 사용하십시오.
    2. 적당량의 멸균 소형 유리 비드와 0.01% Tween-80 용액을 2mL 원심분리기 튜브에 추가합니다.
    3. 곰팡이 군체를 튜브에 긁어내고 군체가 부서질 때까지 와류 셰이커로 충분히 흔듭니다. 균사체를 제거하기 위해 두 겹의 거즈를 걸러냅니다.
      참고: 0.01% Tween-80 용액에서 분생포자의 중단을 보장하기 위해 쉐이킹이 수행됩니다.
    4. 혈구계로 OM 아래의 포자 수를 세고 멸균 0.01% Tween-80을 사용하여 1 × 108 conidial/mL로 조정하고 4°C에서 사용합니다.
  2. 딱정벌레의 준비
    1. 소나무 나뭇 가지 (거의 같은 크기)를 오토 클레이브하고 오븐 (~ 60 ° C)에서 건조시킵니다.
    2. 현장에서 수집한 M을 보관하십시오. 25 ± 1 °C의 인큐베이터에서 소나무 나뭇 가지가있는 교 대 성인.
    3. 딱정벌레를 24시간 동안 굶기고 사용하기 전에 딱정벌레의 표면을 표백제, 에탄올 및 증류수[10:10:80 (v:v)]로 살균하십시오.
  3. 진균 감염의 유도
    1. 깨끗한 벤치 아래에서 작업하고 소나무 가지를 원추형 서스펜션에 10초 동안 담그고 공기 중에서 말리십시오.
    2. 딱정벌레를 원추형 현탁액에 10초 동안 담근 다음 50mL 멸균 튜브(튜브당 딱정벌레 1개와 나뭇가지 1개)로 옮깁니다. 나뭇 가지를 2 일마다 새 것으로 교체하십시오.
    3. 네거티브 컨트롤의 경우 원추형 현탁액을 멸균 0.01% Tween-80 용액으로만 변경하십시오. 각 진균 균주와 대조군에 대해 5번의 반복실험을 수행합니다.
    4. 소나무 나뭇 가지에서 생성 된 frass의 양을 기준으로 딱정벌레의 활동을 평가하십시오. 먹이가 중단되면 죽은 것으로 간주하십시오.
    5. 죽은 딱정벌레를 새로운 멸균 50mL 튜브에 옮기고 멸균 촉촉한 면 조각을 놓습니다. 25 ± 1 °C에서 배양합니다.
      알림: 곰팡이의 성장에는 적절한 수분이 필요하지만 너무 많지는 않기 때문에 젖은 면은 습도를 유지하는 데 사용됩니다.
    6. 매일 같은 시간에 딱정벌레 표면의 변화를 관찰하고 사진을 찍습니다.
  4. 재격리 및 곰팡이 종 확인
    1. 딱정벌레 표면에 명확한 진균 감염 표현형이 나타날 때까지 다른 조직에서 균사체를 개별적으로 선택하여 새 PDA 플레이트에 넣습니다.
    2. 25 ± 1 °C에서 배양하고 형태가 접종 된 곰팡이의 형태와 일치하는지 관찰합니다.
  5. 모델 딱정벌레의 치료
    1. 밀기울을 식품으로 사용하여 모델 딱정벌레 Tribolium castaneum에서 3.2.1-3.3.6 단계를 반복하고 밀기울을 UV 광선으로 살균합니다.
    2. 멸균 핀셋으로 딱정벌레를 가볍게 만지십시오. 응답이 없으면 죽었다고 가정합니다.

4. M. alternatus 및 모델 딱정벌레에서 곰팡이의 감염 표현형을 확인합니다.

  1. 관찰을 위한 시료 준비
    1. 감염된 M을 절개합니다. Alternatus 시체는 1.3단계에서와 같이 조심스럽게 처리됩니다.
    2. T를 선택합니다. 진균 감염의 명백한 증상이 있는 Castaneum 시체.
    3. PDA에서 자라는 4개의 성숙한 곰팡이 군집의 5mm 디스크 플러그를 자릅니다.
  2. 시료 전처리
    1. 플러그, 감염된 딱정벌레 조직 및 시체를 4°C에서 2일 동안 미리 냉각된 2.5% 글루타르알데히드에 넣습니다.
    2. 0.1% 인산염 완충액(pH 7.2-7.4)에서 5분 동안 샘플을 세 번 세척하고 30%, 50%, 70%, 80%, 90%, 95%, 100% 에탄올로 10분 동안 탈수합니다.
    3. 진공 동결 건조기에서 샘플을 건조시킵니다.
      알림: 절단, 담그기, 탈수, 세척 및 건조를 포함한 전체 전처리 과정은 샘플 손상을 방지하기 위해 주의해야 합니다.
  3. 주사전자현미경(SEM) 관찰
    1. 스퍼터 코팅기를 사용하여 전처리된 샘플에 백금을 코팅하고 주사 전자 현미경(36)으로 관찰합니다.
    2. PDA, M에서 자라는 균사와 분생포자의 형태학적 특성을 기록합니다. Alternatus 조직 및 모델 딱정벌레 몸체.
    3. 결과가 2.3단계의 OM에 있는 결과와 일치하는지 비교합니다.

5. 곤충병원성 활성 평가

  1. 원추형 현탁액의 준비
    1. 원추형 현탁액의 준비는 3.1.1-3.1.4 단계와 동일합니다.
  2. 모형 딱정벌레의 전처리
    1. T를 배양하고, 먹이고, 살균하고, 굶깁니다. 3.5.1단계에서와 같이 카스타네움.
    2. 밀기울을 UV로 살균하고 멸균 페트리 접시에 동일한 무게를 둡니다.
  3. 곤충병원성 활성 시험
    1. 밀기울을 원추형 현탁액으로 처리하고 실온의 깨끗한 벤치 아래에서 공기 중에서 건조시킵니다.
    2. T를 담그십시오. 카스타네움 딱정벌레를 10초 동안 원추형 현탁액에 넣고 페트리 접시로 옮깁니다(각 페트리 접시에서 n = 20). 새 밀기울을 4일마다 동일한 원추형 처리로 교체하십시오.
    3. 네거티브 컨트롤의 경우 멸균 0.01% Tween-80 용액만 적용하십시오.
      참고: 각 처리 그룹과 대조군에 대해 최소 3회의 반복실험을 따로 보관하십시오.
    4. 매일 죽은 딱정벌레를 세십시오.
      알림: 멸균 핀셋으로 딱정벌레를 가볍게 만지십시오. 응답이 부족한 경우 그들이 죽었다고 가정합니다.
  4. 다중 유전자 계통발생 분석
    1. 2.1단계에서 설명한 대로 곤충병원성 진균 게놈 DNA를 추출합니다.
      참고: 모델 딱정벌레에 대해 중요한 감염 표현형과 강력한 곤충 병원성 활성을 보이는 기생 EPF에 대해 다중 유전자 식별이 수행됩니다.
    2. 핵 리보솜 SSU34 유전자에 걸친 영역, 대형 서브유닛 rRNA 유전자(LSU37,38)의 세그먼트, 신장 인자 1-알파(tef-1α39) 유전자의 일부, RNA 중합효소 ІІ(rpb240)의 두 번째로 큰 서브유닛 서열, β-튜불린41의 일부를 포함하여 다음 유전자를 증폭합니다. 프라이머 쌍 NS1/NS4, LR7/LROR, EF-983F/EF-2218R, RPB2-5'F/RPB2-5'R 및 TUB1/TUB22를 각각 사용하는 유전자(표 1 참조).
      1. 단계 2.2.1에서와 같이 PCR 반응 혼합물을 준비한다.
      2. 95°C에서 4분 동안 초기 변성, 이후 94°C에서 60초 동안 변성하는 35사이클(tef-1α, rpb2, SSU), 38사이클(LSU) 또는 39사이클(β-튜불린), 47°C에서 60초 동안 어닐링(LSU), 55°C에서 60초(tef-1α), 54°C에서 40초(β-튜불린), 50°C에서 30초(rpb2, SSU), 72°C에서 1분 동안 연신율, 72°C에서 10분 동안 최종 연신율.
    3. 2.2.4-2.2.5 단계와 동일한 단계에 따라 순서를 지정하고 정렬합니다.
    4. ML(Maximum Likelihood) 방법42에 따라 MEGA 6.0에 의한 계통발생 분석을 수행합니다.

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결과

M에서 분리된 곰팡이의 분리 및 식별. 알터나투스
유인 트랩의 도움으로 많은 수 (총 약 500 마리의 딱정벌레)의 M. Alternatus 는 5 개의 지리적 지역에서 수집되었습니다. 곤충병원성 곰팡이에 의한 감염의 전형적인 증상이 있는 딱정벌레 시체를 채취하였다; 그런 다음, 모든 딱정벌레의 신체 외피를 프로토콜 단계 1.3에 설명된 대로 ...

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토론

FWB의 다른 지리적 개체군은 지역 기후 요인에 대한 EPF 종의 장기적인 환경 적응 및 숙주 곤충44,45의 특정 유전형 개체군으로 인해 자연 곤충병원성 곰팡이와 다양한 상호 작용을 개발할 수 있습니다. 샘플링 장소를 여러 곤충 발생 지역으로 확장하는 것은 농업 해충에 대한 이전 연구에서 설명한 바와 같이 자연 숙주로부터 다?...

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공개

저자는 이해 상충이 없음을 선언합니다.

감사의 말

이 연구는 중국 국가핵심연구개발프로그램(2021YFC2600100)과 저장성 자연과학재단(LY21C040001)의 지원을 받았다.

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1.5 mL, 2 mL centrifuge tubesBiosharpBS-15-M
10 µL pipet tipsSangon BiotechF601216
10 µL, 20 µL, 100 µL, 200 µL, 1,000 µL pipettesRainin
1,000 µL pipet tipsSangon BiotechF630102
2 mL cryogenic vialsCorning430659
20x PBS bufferSangon BiotechB548117-0500
200 µL pipet tipsSangon BiotechF601227
2,000 bp makerTaKaRarSD0531
50 mL tubesNest602052
50% glutaraldehyde solutionSangon BiotechG916054
50x TAE bufferSangon BiotechB548101
6x loading bufferTaKaRarSD0503
AgaroseSangon BiotechA610013
Anhydrous ethanolJkchemicalLB10V37
Biochemistry Cultivation CabinetShanghaiyihengLRH-250F
ChloroformJuhua61553
Commercial beetle trapsFEIMENGDIBF-8www.yinyouji.com
Gel imagerBio-RadGelDoc XR+
GlycerolSangon BiotechA600232
High speed refrigerated centrifugeSigmaD-37520
High-Pressure Steam Sterilization PotMettler ToledoJA5003
Isopropyl alcoholGeneral-reagentG75885B
Nucleic acid dyeSangon BiotechA616696
Optical Microscope, OMLeicaDM2000
ParafilmParafilmPM996
PCR meterHeal ForceTrident960
Penicillin GMarklinGB15743
Potato dextrose agar, PDAOxoidCM0139
Potato dextrose broth, PDBSolarbioP9240
PrimersSangon Biotech/
Primers TaqTaKaRarRR902A
Rapid Fungi Genomic DNA Isolation KitSangon BiotechB518229
Scanning Electron Microscope, SEMHitachiS-3400N
StreptomycinMarklinS6153
TetracyclineMarklinT829835
Tween-80MarklinT6336
Vacuum freeze dryerYamatoDC801
Vortex ShakerHLDWH-861
β-MercaptoethanolMarklinM6230

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