Isolation, Behavioral Identification, and Pathogenicity Assessment of Entomopathogenic Fungi from a Forest Wood Borer(포레스트 우드 보어의 곤충병원성 곰팡이의 격리, 행동 식별 및 병원성 평가)

요약

여기에서 우리는 숲 나무 천공충에서 곤충병원성 균류를 얻기 위한 프로토콜과 딱정벌레목 모델 곤충을 사용하여 곤충병원성 활성을 평가하는 대체 방법을 제시합니다. 이 방법은 자연 산림에서 나무를 뚫는 곤충 해충으로부터 곤충 병원성 곰팡이 자원을 탐사하는 데 효율적이고 편리합니다.

초록

FWB(Forest Wood Borers)는 전 세계적으로 심각한 나무 피해와 경제적 손실을 초래합니다. FWB 출현 기간 동안 곤충병원성 곰팡이(EPF)의 방출은 화학적 방제에 대한 수용 가능한 대안으로 간주됩니다. 그러나 EPF 자원은 농업 해충과 달리 FWB에 대해 훨씬 덜 탐사되었습니다. 이 논문은 야생 Monochamus alternatus 개체군을 예로 들어 FWB에서 EPF 자원을 탐색하기 위한 프로토콜을 제시합니다. 이 프로토콜에서 함정 할당은 M으로 미끼입니다. 다른 개체군에 대한 Alternatus 유인제는 딱정벌레의 출현 기간 동안 자연 감염 증상이 있는 적절한 샘플의 수집을 보장했습니다. 외피를 정교하게 해부하여 선택적 배지에 놓은 후, 딱정벌레 몸체의 각 부분에서 곰팡이 종을 분리하고 분자 및 형태 학적 특성을 기반으로 식별했습니다.

몇몇 곰팡이 종은 포자 현탁액과 함께 건강한 M. alternatus 의 재감염을 통해 기생 EPF로 인증되었습니다. M. alternatus 에 대한 그들의 행동 표현형은 주사 전자 현미경을 사용하여 관찰되었으며 딱정벌레목 모델 곤충 Tribolium castaneum의 표현형과 추가로 비교되었습니다. 두 딱정벌레 종 모두에서 일관된 기생 표현형을 나타내는 EPF의 경우 T에 대한 활성 평가. castaneum 은 M. alternatus에 대한 향후 연구를 위해 치사율에 대한 귀중한 정보를 제공했습니다. 이 프로토콜은 중국의 M. alternatus 개체군에 대해 새로 보고된 EPF를 발견하는 데 도움이 되었으며, 이는 다른 FWB에서 더 많은 EPF 자원을 탐색하기 위한 효율적인 접근 방식으로 적용될 수 있습니다.

서문

해충으로 인한 황폐화는 산림과 농업 생태계 모두에서 큰 생태학적, 경제적 손실을 초래했습니다. 대부분의 농업 해충은 천적이나 인공 방제제에 노출되면서 숙주 식물에 피해를 줍니다. 대신, 산림나무천공자(FWB)는 숙주나무 줄기¹ 내에서 전체 발달 주기를 거의 완료하는데, 이는 야생에서 FWB의 효율적인 생물 방제 유기체를 탐색하는 데 큰 도전을 제기합니다. 더욱 심각한 것은 FWB가 많은 수의 식물^병원체2를 운반하거나 이러한 병원체와 잠재적인 매개체^3,4로서 밀접한 관계를 맺고 있어 FWB가 산림 건강에 미치는 부정적인 영향을 극적으로 증폭시킨다는 것이다. 화학 살충제의 과도한 사용은 FWB의 심각성을 완화할 수 있지만, 살충 내성 ^5,6의 출현은 환경 적용을 제한한다. 특정 경우에, 곤충 기생충, 포식성 절지동물 및 곤충병원성 미생물이 생물방제로서 FWB⁷의 분포 영역에 방출되었으며, 화학적 방제에....

프로토콜

1. M. alternatus 에서 곰팡이 분리(그림 1)

1. 딱정벌레 표본 수집
   1. 소나무 sawyer 딱정벌레 M을 수집하십시오. 자연적으로 감염된 소나무 숲에서 딱정벌레 개체군의 예측된 출현 기간 전에 유인제로 미끼를 던진 상업용 트랩(재료 표 참조)을 사용하는 Alternatus.
      참고: 이 연구에서는 중국 남부의 5개 지역(후저우/저장, 량산/쓰촨, 샤먼/푸젠성, 사오관/광동, 위린/광시)에서 딱정벌레를 수집했습니다. 위에서 아래로 트랩 설정은 둥근 상단(지름 50cm), 십자형 패널(폭 35cm, 길이 66cm), 깔때기(상단 원형 지름 35.5cm, 하단 원형 지름 5.5cm), 수집 컵(지름 10.5cm, 길이 26.5cm)입니다. 숙주 휘발성 물질(예: 에탄올 및 α-피넨) 및 응집 페로몬(2-운데실옥시-1-에탄올)이 미끼(³⁰)로 사용된다.
   2. 실험실로 옮기기 전에 표본에 라벨을 붙입니다. 각 딱정벌레를 신선한 나뭇 가지가있는 개별 멸균....

토론

FWB의 다른 지리적 개체군은 지역 기후 요인에 대한 EPF 종의 장기적인 환경 적응 및 숙주 곤충^44,45의 특정 유전형 개체군으로 인해 자연 곤충병원성 곰팡이와 다양한 상호 작용을 개발할 수 있습니다. 샘플링 장소를 여러 곤충 발생 지역으로 확장하는 것은 농업 해충에 대한 이전 연구에서 설명한 바와 같이 자연 숙주로부터 다?.......

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL, 2 mL centrifuge tubes	Biosharp	BS-15-M
10 µL pipet tips	Sangon Biotech	F601216
10 µL, 20 µL, 100 µL, 200 µL, 1,000 µL pipettes	Rainin
1,000 µL pipet tips	Sangon Biotech	F630102
2 mL cryogenic vials	Corning	430659
20x PBS buffer	Sangon Biotech	B548117-0500
200 µL pipet tips	Sangon Biotech	F601227
2,000 bp maker	TaKaRar	SD0531
50 mL tubes	Nest	602052
50% glutaraldehyde solution	Sangon Biotech	G916054
50x TAE buffer	Sangon Biotech	B548101
6x loading buffer	TaKaRar	SD0503
Agarose	Sangon Biotech	A610013
Anhydrous ethanol	Jkchemical	LB10V37
Biochemistry Cultivation Cabinet	Shanghaiyiheng	LRH-250F
Chloroform	Juhua	61553
Commercial beetle traps	FEIMENGDI	BF-8	www.yinyouji.com
Gel imager	Bio-Rad	GelDoc XR+
Glycerol	Sangon Biotech	A600232
High speed refrigerated centrifuge	Sigma	D-37520
High-Pressure Steam Sterilization Pot	Mettler Toledo	JA5003
Isopropyl alcohol	General-reagent	G75885B
Nucleic acid dye	Sangon Biotech	A616696
Optical Microscope, OM	Leica	DM2000
Parafilm	Parafilm	PM996
PCR meter	Heal Force	Trident960
Penicillin G	Marklin	GB15743
Potato dextrose agar, PDA	Oxoid	CM0139
Potato dextrose broth, PDB	Solarbio	P9240
Primers	Sangon Biotech	/
Primers Taq	TaKaRar	RR902A
Rapid Fungi Genomic DNA Isolation Kit	Sangon Biotech	B518229
Scanning Electron Microscope, SEM	Hitachi	S-3400N
Streptomycin	Marklin	S6153
Tetracycline	Marklin	T829835
Tween-80	Marklin	T6336
Vacuum freeze dryer	Yamato	DC801
Vortex Shaker	HLD	WH-861
β-Mercaptoethanol	Marklin	M6230