A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

يحدد هذا البروتوكول طريقتين للتحليل الكمي للميتوفاجي في خلايا β البنكرياس: أولا ، مزيج من الأصباغ الخاصة بالميتوكوندريا المنفذة للخلايا ، وثانيا ، مراسل الميتوفاجي المشفر وراثيا. هاتان التقنيتان متكاملتان ويمكن نشرهما بناء على احتياجات محددة ، مما يسمح بالمرونة والدقة في معالجة مراقبة جودة الميتوكوندريا كميا.

Abstract

Mitophagy هي آلية لمراقبة الجودة ضرورية للحفاظ على وظيفة الميتوكوندريا المثلى. يؤدي خلل الميتوفاجي β الخلايا إلى عدم كفاية إفراز الأنسولين. غالبا ما تتطلب التقييمات الكمية المتقدمة للميوفاجي استخدام تقارير وراثية. تم تحسين نموذج الماوس mt-Keima ، الذي يعبر عن مسبار قياس نسبة الإثارة المزدوجة الحساسة لدرجة الحموضة المستهدفة بالميتوكوندريا لقياس الميتوفاجي عبر قياس التدفق الخلوي ، في خلايا β. يمكن استخدام نسبة انبعاثات الطول الموجي mt-Keima الحمضية إلى المحايدة لتحديد mitophagy بقوة. ومع ذلك ، قد يكون استخدام مراسلي الميتوفاجي الوراثي أمرا صعبا عند العمل مع نماذج الفئران الجينية المعقدة أو الخلايا التي يصعب نقلها ، مثل الجزر البشرية الأولية. يصف هذا البروتوكول طريقة تكميلية جديدة قائمة على الصبغة لتحديد كمية الميتوفاجي β الخلايا في الجزر الأولية باستخدام MtPhagy. MtPhagy عبارة عن صبغة حساسة لدرجة الحموضة ونفاذة للخلايا تتراكم في الميتوكوندريا وتزيد من شدة مضانها عندما تكون الميتوكوندريا في بيئات منخفضة الأس الهيدروجيني ، مثل الجسيمات الحالة أثناء الميتوفاجي. من خلال الجمع بين صبغة MtPhagy و Fluozin-3-AM ، وهو مؤشر Zn2+ يختار الخلايا β ، و Tetramethylrhodamine ، إيثيل استر (TMRE) لتقييم إمكانات غشاء الميتوكوندريا ، يمكن قياس تدفق الميتوفاجي على وجه التحديد في خلايا β عبر قياس التدفق الخلوي. هذان النهجان متكاملان للغاية ، مما يسمح بالمرونة والدقة في تقييم مراقبة جودة الميتوكوندريا في العديد من نماذج الخلايا β.

Introduction

تنتج خلايا β البنكرياس الأنسولين وتفرز لتلبية متطلبات التمثيل الغذائي ، ويكون خلل الخلايا β مسؤولا عن ارتفاع السكر في الدم وظهور مرض السكري في كل من مرض السكري من النوع 1 والنوع 2. تقوم الخلايا β بإقران استقلاب الجلوكوز بإفراز الأنسولين عبر طاقة الميتوكوندريا والإنتاج الأيضي ، والتي تعتمد على احتياطي كتلة الميتوكوندريا الوظيفية1،2،3. للحفاظ على الوظيفة المثلى للخلايا β ، تعتمد الخلايا β على آليات مراقبة جودة الميتوكوندريا لإزالة الميتوكوندريا القديمة أو التالفة والحفاظ على كتلة الميتوكوندريا الوظيفية4. يعد الالتهام الذاتي الانتقائي للميتوكوندريا ، المع....

Protocol

تمت مراجعة الدراسات على المقدمة في هذا البروتوكول والموافقة عليها من قبل لجنة رعاية واستخدام المؤسسية بجامعة ميشيغان. تم استخدام ذكور الفئران C57BL / 6J البالغة من العمر عشرين أسبوعا ، إما على نظام غذائي منتظم للدهون لمدة 15 أسبوعا (RFD) أو نظام غذائي عالي الدهون (HFD) ، لهذه الدراسة.

1. تقييم الميتوفاجي عبر نهج MtPhagy القائم على الصبغة (الطريقة 1)

  1. إعداد جزيرة الفأر والعلاج
    1. قم بإجراء استزراع الجزر والتعرض للفالينوميسين باتباع الخطوات أدناه.
      1. عزل الجزر من إما اتباع نظام غذائي منتظم للدهون (RFD) أو نظام غذائي عالي الدهون (HFD ، 60 سعرة حرارية ٪ الدهون19) الفئران ، باتباع الطرق ا....

النتائج

تقييم الميتوفاجي من خلال نهج MtPhagy القائم على الصبغة
تم تحسين هذا النهج القائم على الصبغة لتحليل تدفق الميتوفاجي داخل خلايا β الفأر الأولية دون الحاجة إلى مراسل وراثي ، باستخدام Fluozin-3-AM و TMRE و MtPhagy بالإضافة إلى DAPI لاستبعاد الخلايا الميتة. من خلال إقران هذه الأصباغ مع فالينوميسين ل.......

Discussion

وصف هذا البروتوكول طريقتين متكاملتين لقياس تدفق الميتوفاجي في جزر الفأر الأولية المنفصلة. باستخدام طريقة mt-Keima ، تم تحديد الزيادة في الميتوفاجي كنسبة متزايدة من الخلايا الحمضية (561 نانومتر) / المحايدة (405 نانومتر) ، بينما في طريقة MtPhagy ، تم قياس زيادة تدفق الميتوفاجي كزيادة فيعدد الخلايا ?.......

Disclosures

تلقت SAS تمويلا للمنح من شركة Ono Pharmaceutical Co.، Ltd. وهي مستشارة لشركة Novo Nordisk.

Acknowledgements

E.L-D. يقر بالدعم المقدم من المعاهد الوطنية للصحة (T32-AI007413 و T32-AG000114). تقر SAS بالدعم المقدم من JDRF (COE-2019-861) ، والمعاهد الوطنية للصحة (R01 DK135268 ، R01 DK108921 ، R01 DK135032 ، R01 DK136547 ، U01 DK127747) ، وزارة شؤون المحاربين القدامى (I01 BX004444) ، عائلة Brehm ، وعائلة أنتوني.

....

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Antibiotic-AntimycoticLife Technologies15240-062
Attune NxT Flow CytometerThermofisher ScientificA24858
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)Thermofisher ScientificD1306DAPI reconstituted in ddH2O to reach 0.2 µg/mL stock
Dimethyl SulfoxideSigma-Aldrich317275
Fatty Acid Free heat shock BSA powderEquitechBAH66
Fetal bovine serumGemini Bio900-108
Fluozin-3AM Thermofisher Scientific F24195100 μg Fluozin-3AM powder reconstituted in 51 μL DMSO and 51 μL Pluronic F-127 to reach 1 mM stock. 
Gibco RPMI 1640 MediumFisher Scientific11-875-093
HEPES (1M)Life Technologies15630-080
MtPhagy dyeDojindoMT02-105 μg MtPhagy powder reconstituted with 50 μL DMSO to reach 100 μM stock. 
MtPhagy dyeDojindoMT02-10
Penicillin-Streptomycin (100x)Life Technologies15140-1221x Solution used in procotol by diluting 1:10 in ddH2O
Phosphate buffered saline, 10xFisher ScientificBP399-201x Solution used in procotol by diluting 1:10 in ddH2O
Sodium Pyruvate (100x)Life Technologies11360-0705 μg MtPhagy powder reconstituted with 50 μL DMSO to reach 100 μM stock. 
TMRE [Tetramethylrhodamine, ethyl ester, perchlorate]AnaspecAS-88061TMRE powder reconstituted in DMSO to reach 100 μM stock.
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol redThermofisher Scientific25300054
ValinomycinSigmaV0627Valinomycin powder reconsituted in DMSO to reach 250 nM stock.

References

  1. Kaufman, B. A., Li, C., Soleimanpour, S. A. Mitochondrial regulation of β-cell function: maintaining the momentum for insulin release. Molecular Aspects of Medicine. 42, 91-104 (2015).
  2. Soleimanpour, S. A., et al.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

Mt Keima Mt Keima Mitophagy MtPhagy Fluozin 3 AM Zn2 TMRE

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Research

Education

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved