A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
يحدد هذا البروتوكول طريقتين للتحليل الكمي للميتوفاجي في خلايا β البنكرياس: أولا ، مزيج من الأصباغ الخاصة بالميتوكوندريا المنفذة للخلايا ، وثانيا ، مراسل الميتوفاجي المشفر وراثيا. هاتان التقنيتان متكاملتان ويمكن نشرهما بناء على احتياجات محددة ، مما يسمح بالمرونة والدقة في معالجة مراقبة جودة الميتوكوندريا كميا.
Mitophagy هي آلية لمراقبة الجودة ضرورية للحفاظ على وظيفة الميتوكوندريا المثلى. يؤدي خلل الميتوفاجي β الخلايا إلى عدم كفاية إفراز الأنسولين. غالبا ما تتطلب التقييمات الكمية المتقدمة للميوفاجي استخدام تقارير وراثية. تم تحسين نموذج الماوس mt-Keima ، الذي يعبر عن مسبار قياس نسبة الإثارة المزدوجة الحساسة لدرجة الحموضة المستهدفة بالميتوكوندريا لقياس الميتوفاجي عبر قياس التدفق الخلوي ، في خلايا β. يمكن استخدام نسبة انبعاثات الطول الموجي mt-Keima الحمضية إلى المحايدة لتحديد mitophagy بقوة. ومع ذلك ، قد يكون استخدام مراسلي الميتوفاجي الوراثي أمرا صعبا عند العمل مع نماذج الفئران الجينية المعقدة أو الخلايا التي يصعب نقلها ، مثل الجزر البشرية الأولية. يصف هذا البروتوكول طريقة تكميلية جديدة قائمة على الصبغة لتحديد كمية الميتوفاجي β الخلايا في الجزر الأولية باستخدام MtPhagy. MtPhagy عبارة عن صبغة حساسة لدرجة الحموضة ونفاذة للخلايا تتراكم في الميتوكوندريا وتزيد من شدة مضانها عندما تكون الميتوكوندريا في بيئات منخفضة الأس الهيدروجيني ، مثل الجسيمات الحالة أثناء الميتوفاجي. من خلال الجمع بين صبغة MtPhagy و Fluozin-3-AM ، وهو مؤشر Zn2+ يختار الخلايا β ، و Tetramethylrhodamine ، إيثيل استر (TMRE) لتقييم إمكانات غشاء الميتوكوندريا ، يمكن قياس تدفق الميتوفاجي على وجه التحديد في خلايا β عبر قياس التدفق الخلوي. هذان النهجان متكاملان للغاية ، مما يسمح بالمرونة والدقة في تقييم مراقبة جودة الميتوكوندريا في العديد من نماذج الخلايا β.
تنتج خلايا β البنكرياس الأنسولين وتفرز لتلبية متطلبات التمثيل الغذائي ، ويكون خلل الخلايا β مسؤولا عن ارتفاع السكر في الدم وظهور مرض السكري في كل من مرض السكري من النوع 1 والنوع 2. تقوم الخلايا β بإقران استقلاب الجلوكوز بإفراز الأنسولين عبر طاقة الميتوكوندريا والإنتاج الأيضي ، والتي تعتمد على احتياطي كتلة الميتوكوندريا الوظيفية1،2،3. للحفاظ على الوظيفة المثلى للخلايا β ، تعتمد الخلايا β على آليات مراقبة جودة الميتوكوندريا لإزالة الميتوكوندريا القديمة أو التالفة والحفاظ على كتلة الميتوكوندريا الوظيفية4. يعد الالتهام الذاتي الانتقائي للميتوكوندريا ، المع....
تمت مراجعة الدراسات على المقدمة في هذا البروتوكول والموافقة عليها من قبل لجنة رعاية واستخدام المؤسسية بجامعة ميشيغان. تم استخدام ذكور الفئران C57BL / 6J البالغة من العمر عشرين أسبوعا ، إما على نظام غذائي منتظم للدهون لمدة 15 أسبوعا (RFD) أو نظام غذائي عالي الدهون (HFD) ، لهذه الدراسة.
1. تقييم الميتوفاجي عبر نهج MtPhagy القائم على الصبغة (الطريقة 1)
تقييم الميتوفاجي من خلال نهج MtPhagy القائم على الصبغة
تم تحسين هذا النهج القائم على الصبغة لتحليل تدفق الميتوفاجي داخل خلايا β الفأر الأولية دون الحاجة إلى مراسل وراثي ، باستخدام Fluozin-3-AM و TMRE و MtPhagy بالإضافة إلى DAPI لاستبعاد الخلايا الميتة. من خلال إقران هذه الأصباغ مع فالينوميسين ل.......
وصف هذا البروتوكول طريقتين متكاملتين لقياس تدفق الميتوفاجي في جزر الفأر الأولية المنفصلة. باستخدام طريقة mt-Keima ، تم تحديد الزيادة في الميتوفاجي كنسبة متزايدة من الخلايا الحمضية (561 نانومتر) / المحايدة (405 نانومتر) ، بينما في طريقة MtPhagy ، تم قياس زيادة تدفق الميتوفاجي كزيادة فيعدد الخلايا ?.......
تلقت SAS تمويلا للمنح من شركة Ono Pharmaceutical Co.، Ltd. وهي مستشارة لشركة Novo Nordisk.
E.L-D. يقر بالدعم المقدم من المعاهد الوطنية للصحة (T32-AI007413 و T32-AG000114). تقر SAS بالدعم المقدم من JDRF (COE-2019-861) ، والمعاهد الوطنية للصحة (R01 DK135268 ، R01 DK108921 ، R01 DK135032 ، R01 DK136547 ، U01 DK127747) ، وزارة شؤون المحاربين القدامى (I01 BX004444) ، عائلة Brehm ، وعائلة أنتوني.
....Name | Company | Catalog Number | Comments |
Antibiotic-Antimycotic | Life Technologies | 15240-062 | |
Attune NxT Flow Cytometer | Thermofisher Scientific | A24858 | |
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Thermofisher Scientific | D1306 | DAPI reconstituted in ddH2O to reach 0.2 µg/mL stock |
Dimethyl Sulfoxide | Sigma-Aldrich | 317275 | |
Fatty Acid Free heat shock BSA powder | Equitech | BAH66 | |
Fetal bovine serum | Gemini Bio | 900-108 | |
Fluozin-3AM | Thermofisher Scientific | F24195 | 100 μg Fluozin-3AM powder reconstituted in 51 μL DMSO and 51 μL Pluronic F-127 to reach 1 mM stock. |
Gibco RPMI 1640 Medium | Fisher Scientific | 11-875-093 | |
HEPES (1M) | Life Technologies | 15630-080 | |
MtPhagy dye | Dojindo | MT02-10 | 5 μg MtPhagy powder reconstituted with 50 μL DMSO to reach 100 μM stock. |
MtPhagy dye | Dojindo | MT02-10 | |
Penicillin-Streptomycin (100x) | Life Technologies | 15140-122 | 1x Solution used in procotol by diluting 1:10 in ddH2O |
Phosphate buffered saline, 10x | Fisher Scientific | BP399-20 | 1x Solution used in procotol by diluting 1:10 in ddH2O |
Sodium Pyruvate (100x) | Life Technologies | 11360-070 | 5 μg MtPhagy powder reconstituted with 50 μL DMSO to reach 100 μM stock. |
TMRE [Tetramethylrhodamine, ethyl ester, perchlorate] | Anaspec | AS-88061 | TMRE powder reconstituted in DMSO to reach 100 μM stock. |
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Thermofisher Scientific | 25300054 | |
Valinomycin | Sigma | V0627 | Valinomycin powder reconsituted in DMSO to reach 250 nM stock. |
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionExplore More Articles
This article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved