Approcci complementari per interrogare il flusso mitofagico nelle cellule β pancreatiche

Riepilogo

Questo protocollo delinea due metodi per l'analisi quantitativa della mitofagia nelle cellule β pancreatiche: in primo luogo, una combinazione di coloranti specifici per mitocondri permeabili alle cellule e, in secondo luogo, un reporter mitofagico geneticamente codificato. Queste due tecniche sono complementari e possono essere implementate in base a esigenze specifiche, consentendo flessibilità e precisione nell'affrontare quantitativamente il controllo di qualità mitocondriale.

Abstract

La mitofagia è un meccanismo di controllo della qualità necessario per mantenere una funzione mitocondriale ottimale. La mitofagia disfunzionale a β cellule provoca un rilascio insufficiente di insulina. Le valutazioni quantitative avanzate della mitofagia spesso richiedono l'uso di reporter genetici. Il modello murino mt-Keima, che esprime una sonda raziometrica a doppia eccitazione sensibile al pH mirata ai mitocondri per quantificare la mitofagia tramite citometria a flusso, è stato ottimizzato in cellule β. Il rapporto tra le emissioni acide e neutre della lunghezza d'onda mt-Keima può essere utilizzato per quantificare in modo robusto la mitofagia. Tuttavia, l'utilizzo di reporter di mitofagia genetica può essere difficile quando si lavora con modelli murini genetici complessi o cellule difficili da trasfettare, come le isole umane primarie. Questo protocollo descrive un nuovo metodo complementare basato su coloranti per quantificare la mitofagia a β cellule nelle isole primarie utilizzando MtPhagy. La mtfagia è un colorante sensibile al pH e permeabile alle cellule che si accumula nei mitocondri e aumenta la sua intensità di fluorescenza quando i mitocondri si trovano in ambienti a basso pH, come i lisosomi durante la mitofagia. Combinando il colorante MtPhagy con Fluozin-3-AM, un indicatore Zn²⁺ che seleziona le cellule β, e Tetrametilrodamina, estere etilico (TMRE) per valutare il potenziale di membrana mitocondriale, il flusso mitofagico può essere quantificato in modo specifico nelle cellule β tramite citometria a flusso. Questi due approcci sono altamente complementari e consentono flessibilità e precisione nella valutazione del controllo di qualità mitocondriale in numerosi modelli di cellule β.

Introduzione

Le cellule β pancreatiche producono e secernono insulina per soddisfare le richieste metaboliche e la disfunzione delle cellule β è responsabile dell'iperglicemia e dell'insorgenza del diabete sia nel diabete di tipo 1 che in quello di tipo 2. Le cellule β accoppiano il metabolismo del glucosio con la secrezione di insulina attraverso l'energetica mitocondriale e l'output metabolico, che dipendono da una riserva di massa mitocondriale funzionale ^1,2,3. Per mantenere una funzione ottimale delle cellule β, le cellule β si affidano a meccanismi di controllo della qualità mitocondriale per rimuovere i mitocondri invecchiati o danneggiati e preservare la massa mitocondriale funzionale⁴. L'autofagia mitocondriale selettiva, nota anche come mitofagia, è una componente chiave del percorso di controllo della qualità mitocondriale.

Le valutazioni della mitofagia nelle cellule vive spesso si basano sui cambiamenti del pH mitocondriale che si verificano durante la mitofagia. I mitocondri hanno un pH leggermente alcalino e i mitocondri sani risiedono normalmente nel citosol a pH neutro. Durante la mitofagia, i mitocondri danneggiati o disfunzionali vengono selettivamente incorporati negli autofagosomi e infine eliminati all'interno dei lisosomi acidi⁵. Diversi modelli murini reporter di mitofagia transgenica in vivo, come mt-Keima⁶, mitoQC⁷ e CMMR⁸, nonché sonde di mitofagia trasfettabili, come il plasmide Cox8-EGFP-mCherry⁹, utilizzano questa variazione di pH per fornire valutazioni quantitative della mitofagia. L'uso di topi transgenici che esprimono la sonda raziometrica a doppia eccitazione sensibile al pH mt-Keima è stato ottimizzato per le valutazioni della mitofagia nelle isole e nelle cellule β tramite citometria a flusso^10,11. Il rapporto tra le emissioni acide e neutre della lunghezza d'onda mt-Keima (il rapporto tra l'eccitazione acida di 561 nm e quella neutra di 480 nm) può essere utilizzato per quantificare in modo robusto la mitofagia ^6,12.

Questo protocollo descrive un approccio ottimizzato per valutare il flusso mitofagico nelle isole primarie e nelle cellule β isolate da topi transgenici mt-Keima ^10,11. Sebbene mt-Keima sia una sonda altamente sensibile, richiede complicati schemi di allevamento animale o la trasfezione di cellule, che spesso possono essere difficili quando si lavora in combinazione con altri modelli genetici o con isole umane primarie. Inoltre, l'uso di laser e rivelatori a fluorescenza multipli per identificare popolazioni cellulari neutre e acide può limitare l'uso combinatorio di altri reporter fluorescenti.

Per superare queste sfide, questo protocollo descrive anche un metodo complementare, a canale fluorescente singolo, basato su coloranti per il rilevamento robusto della mitofagia in cellule β da isole di topo isolate. Questo approccio, denominato metodo MtPhagy, utilizza una combinazione di tre coloranti permeabili alle cellule per selezionare le cellule β, quantificare le popolazioni cellulari attivamente sottoposte a mitofagia e valutare contemporaneamente il potenziale di membrana mitocondriale (MMP o Δψm).

Il primo di questi coloranti è la Fluozin-3-AM, un indicatore Zn²⁺ permeabile alle cellule con un Ex/Em 494/516 nm¹³. Le isole di topo comprendono una popolazione eterogenea di cellule funzionalmente distinte, tra cui cellule α, β, δ e PP. Le cellule β comprendono circa l'80% delle cellule all'interno dell'isolotto di topo e possono essere distinte da altri tipi di cellule insulari a causa della loro elevata concentrazione di Zn²⁺ all'interno dei granuli di insulina^14,15, consentendo l'identificazione delle cellule β come la popolazione^{ad alto contenuto} di Fluozin-3-AM. Il colorante MtPhagy, un colorante sensibile al pH che è immobilizzato sui mitocondri tramite un legame chimico ed emette una debole fluorescenza, è utilizzato anche in questo protocollo¹⁶. Dopo l'induzione della mitofagia, i mitocondri danneggiati vengono incorporati nel lisosoma acido e il colorante MtPhagy aumenta la sua intensità di fluorescenza all'interno dell'ambiente a basso pH (Ex/Em 561/570-700 nm).

Inoltre, la tetrametilrodamina, estere etilico (TMRE), viene utilizzata per valutare la MMP. TMRE è un colorante permeabile alle cellule carica positiva (Ex/Em 552/575 nm) che viene sequestrato dai mitocondri sani a causa della relativa carica negativa sostenuta dal loro potenziale di membrana¹⁷. I mitocondri danneggiati o malsani dissipano il loro potenziale di membrana, con conseguente diminuzione della capacità di sequestrare la TMRE. Utilizzando questi coloranti insieme, le cellule β sottoposte a mitofagia possono essere identificate come^{la bassa popolazione} di Fluozin^{ad alta}MtPhagy^{ad alto}TMRE tramite citometria a flusso. Poiché la mitofagia è un processo dinamico piuttosto che statico, questo protocollo è stato ottimizzato per valutare il flusso mitofagico utilizzando valinomicina, uno ionoforo K⁺ che induce la mitofagia dopo la dissipazione di MMP¹⁸. Il confronto della mitofagia in presenza e assenza di valinomicina consente di valutare il flusso mitofagico in diversi gruppi di campioni.

La natura basata sul colorante dell'attuale approccio consente di estrapolarlo alle isole umane e ad altri tipi di cellule difficili da trasfettare e aggira la necessità di complicati schemi di allevamento degli animali, a differenza del protocollo mt-Keima. L'obiettivo generale di questo protocollo è quello di quantificare la mitofagia nelle cellule β a livello di singola cellula attraverso due metodi indipendenti basati sulla citometria a flusso. Nel loro insieme, questo protocollo descrive due metodi potenti e complementari che consentono sia precisione che flessibilità nello studio quantitativo del controllo di qualità mitocondriale.

Protocollo

Gli studi sugli animali presentati in questo protocollo sono stati esaminati e approvati dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali dell'Università del Michigan. Per questo studio sono stati utilizzati topi maschi C57BL/6J di 20 settimane, con una dieta grassa regolare (RFD) di 15 settimane o una dieta ricca di grassi (HFD).

1. Valutazione della mitofagia tramite l'approccio MtPhagy basato su coloranti (Metodo 1)

1. Preparazione e trattamento delle isole di topo
   1. Eseguire la coltura delle isole e l'esposizione alla valinomicina seguendo i passaggi seguenti.
      1. Isolare le isole da topi con dieta grassa normale (RFD) o dieta ricca di grassi (HFD, 60 kcal% di grassi¹⁹), seguendo i metodi^{descritti in} precedenza ^2,10.
      2. Campioni di isole di coltura per una notte a 37 °C in terreno RPMI integrato con 100 unità/mL di antibiotico antimicotico, 50 unità/mL di penicillina-streptomicina, 1 mM di piruvato di sodio, 10 mM di HEPES e 10% di siero fetale bovino (FBS) (vedere Tabella dei materiali). Questo mezzo sarà indicato come "mezzo isolotto".
      3. Utilizzando una pipetta, prelevare 100 isole per condizione in piastre di Petri da 6 cm in 2 mL di terreno insulare.
         NOTA: Condizioni utilizzate per questo protocollo: (1) Controllo non colorato: isolotti RFD non colorati; (2) Controllo solo DAPI: isolotti RFD colorati con DAPI; (3) Controllo solo Fluozin-3-AM: isolotti RFD colorati con Fluozin-3-AM; (4) Controllo solo MtPhagy: isolotti RFD colorati con MtPhagy; (5) Controllo solo TMRE: isolotti RFD colorati con TMRE; (6) RFD non trattata: isole RFD colorate con MtPhagy, TMRE, Fluozin-3-AM e DAPI; (7) Isole RFD esposte alla valinomicina: isole RFD esposte a valinomicina e colorate con MtPhagy, TMRE, Fluozin-3-AM e DAPI; (8) HFD non trattata: isole HFD colorate con MtPhagy, TMRE, Fluozin-3-AM e DAPI; (9) Isole HFD esposte alla valinomicina: isolotti HFD esposti a valinomicina e colorati con MtPhagy, TMRE, Fluozin-3-AM e DAPI.
      4. Per le condizioni (7) e (9) (vedere NOTA sopra) esposte alla valinomicina, aggiungere 2 μL di 250 nΜ di valinomicina (vedere la tabella dei materiali) alle isole nella capsula di Petri per 3 ore per indurre la mitofagia.
   2. Eseguire la dissociazione di una singola cellula.
      1. Dopo 3 ore di esposizione alla valinomicina, prelevare 100 isolotti da ciascuna condizione in provette di microcentrifuga separate utilizzando una pipetta.
      2. Centrifugare le isole a 350 x g per 1 minuto a 10 °C ed eliminare il surnatante con una pipetta.
      3. Lavare i campioni 2x con 1 mL 1x soluzione salina tamponata con fosfato (PBS), con fasi di centrifuga (350 x g/1 min, 10 °C) tra ogni lavaggio. Scartare il surnatante con una pipetta dopo ogni lavaggio.
      4. Per dissociare le isole in singole cellule, aggiungere 500 μL di tripsina allo 0,05% (preriscaldata a 37 °C) alla provetta per microcentrifuga di un campione per evitare un'eccessiva digestione delle isole. Pipettare ripetutamente su e giù fino a quando le isole non sono visibilmente disperse.
      5. Aggiungere immediatamente 1 mL di terreno insulare preriscaldato per neutralizzare la tripsina. Ripetere la tripsinizzazione e la neutralizzazione per ogni campione, una alla volta.
      6. Centrifugare i campioni a 500 x g per 5 minuti a 10 °C. Rimuovere il surnatante con una pipetta, facendo attenzione a non disturbare il pellet.
         NOTA: Il pellet sarà delicato per i campioni esposti alla valinomicina.
      7. Lavare i campioni 2 volte con terreno RPMI, senza rosso fenolo, integrato con 100 unità/mL di antibiotico antimicotico, 50 unità/mL di penicillina-streptomicina, 1 mM di piruvato di sodio, 10 mM di HEPES e 10% di albumina sierica bovina (BSA). Questo mezzo sarà indicato come "mezzo di flusso dell'isolotto". Includere le fasi di centrifuga (350 x g/1 min, 10 °C) tra un lavaggio e l'altro. Scartare il surnatante con una pipetta dopo ogni lavaggio.
   3. Colorare le cellule con MtPhagy, TMRE, Fluozin-3-AM e DAPI per prepararsi alla citometria a flusso.
      1. Risospendere i campioni di isole in 500 μL di mezzo di flusso delle isole.
      2. Aggiungere 0,25 μL di 100 μM di MtFagy stock (vedere la Tabella dei materiali) alle provette che ricevono il colorante MtPhagy (condizioni 4, 6, 7, 8 e 9, NOTA al punto 1.1.1).
      3. Aggiungere 0,25 μL di 100 μM di materiale TMRE (vedere la tabella dei materiali) alle provette che ricevono il colorante TMRE (condizioni 5, 6, 7, 8 e 9).
      4. Aggiungere 0,25 μL di 1 mM di Fluozin-3-AM (vedere la tabella dei materiali) alle provette che ricevono il colorante Fluozin-3-AM (condizioni 3, 6, 7, 8 e 9).
      5. Tubi a vortice a bassa velocità per 5 s per miscelare.
      6. Avvolgere le provette per microcentrifuga in un foglio di alluminio per proteggerle dalla luce e incubarle a 37 °C per 30 min. A metà dell'incubazione, tubi a vortice a bassa velocità per 5-10 secondi per mescolarsi.
      7. Dopo l'incubazione, centrifugare i campioni a 350 x g per 1 minuto a 10 °C. Scartare il surnatante con una pipetta.
      8. Risospendere i campioni in un mezzo di flusso insulare da 500 μL. Aggiungere 0,2 μg/mL di DAPI (vedere la tabella dei materiali) alle condizioni 2, 6, 7, 8 e 9.
      9. Centrifugare i campioni a 350 x g per 1 minuto a 10 °C. Scartare il surnatante utilizzando una pipetta e risospendere in 500 μL di fluido di flusso dell'isola.
      10. Posizionare i campioni sul ghiaccio.
2. Citometria a flusso
   1. Avviare lo strumento (vedere la tabella dei materiali).
      NOTA: Qualsiasi citometro a flusso con i filtri appropriati funzionerà. In questo studio sono stati utilizzati i seguenti filtri: (1) VL1 per DAPI: Eccitazione/Emissione - 405 nm/440 nm (50 nm); (2) BL1 per Fluozin-3-AM: Eccitazione/Emissione - 488 nm/530 nm (30 nm); (3) BL2 per il colorante MtPhagy: Eccitazione/Emissione - 488 nm/590 nm (40 nm); (4) YL1 per TMRE: eccitazione/emissione - 561 nm/585 nm (16 nm).
   2. Regolare le tensioni per la dispersione diretta (FSC) e laterale (SSC) per garantire che le popolazioni di celle siano al centro del grafico a dispersione. Per questo protocollo, le tensioni utilizzate erano 120 V per FSC e 260 V per SSC per garantire che le celle rientrino uniformemente all'interno dell'FSC-A vs. Grafico SSC-A (Figura 1A).
   3. Per escludere celle non singole, aggiungere un gate rettangolare su FSC-H vs. FSC-W seguito da SSC-H vs. SSC-W (Figura 1B,C).
   4. Regolare le tensioni e la compensazione per DAPI per filtrare le celle β attive. Impostare i gate di fluorescenza per ciascun fluoroforo utilizzato in base al campione RFD non colorato (Figure 1D-F).
      NOTA: Tensioni utilizzate per ciascun canale: (1) VL1: 320-360 V; (2) BL1: 300-340 V; (3) BL2: 260-300 V; (4) YL1: 300-340 V.
   5. Una volta stabiliti i gate, raccogliere 10.000 eventi per campione.
      NOTA: Utilizzando questo approccio di gating, i livelli di mitofagia in condizioni basali e dopo l'induzione della valinomicina sono stati valutati sia nelle isole RFD che HFD (Figura 2).
   6. Salvare i dati come file FCS per l'analisi.

2. Valutazione della mitofagia utilizzando il reporter mt-Keima geneticamente codificato (Metodo 2)

1. Preparazione delle isole di topo e dissociazione di singole cellule
   1. Eseguire la coltura delle isole e l'esposizione alla valinomicina seguendo i passaggi seguenti.
      1. Isolare le isole pancreatiche da topi wild-type (WT) e mt-Keima/+ (mt-Keima)⁶. In questo metodo sono stati utilizzati topi maschi di 20 settimane WT o mt-Keima/+ alimentati con RFD.
      2. Campioni di isolotti di coltura durante la notte a 37 °C nel terreno dell'isolotto.
      3. Utilizzando una pipetta, prelevare 100 isole per condizione in piastre di Petri da 6 cm con 2 ml di terreno insulare.
         NOTA: Condizioni utilizzate per questo protocollo: (1) Controllo non colorato: isolotti WT non colorati; (2) Controllo solo DAPI: isolotti WT colorati con DAPI; (3) Controllo solo Fluozin-3-AM: isolotti WT colorati con Fluozin-3-AM; (4) controllo solo mt-Keima: isolotti mt-Keima/+ non macchiati; (5) Non trattati: isolotti mt-Keima/+ colorati con Fluozin-3-AM e DAPI; (6) Valinomicina: isolotti mt-Keima/+ esposti a valinomicina e colorati con Fluozin-3-AM e DAPI.
      4. Per la condizione (6) con esposizione alla valinomicina, aggiungere 2 μL di 250 nM di valinomicina alle isole nella capsula di Petri per 3 ore per indurre la mitofagia.
   2. Eseguire la dissociazione unicellulare.
      1. Eseguire le fasi di dissociazione di una singola cellula, come descritto al punto 1.1.2.
   3. Colorare le cellule con Fluozin-3-AM e DAPI.
      1. Risospendere i campioni di isole in 500 μL di mezzo di flusso delle isole.
      2. Aggiungere 0,25 μL di 1 mM di Fluozin-3-AM alle provette che ricevono il colorante Fluozin-3-AM (condizioni 3, 5 e 6).
      3. Incubare le cellule a 37 °C e procedere al trattamento con DAPI, come descritto nei passaggi 1.1.3.5-1.3.10.
2. Citometria a flusso
   1. Avviare lo strumento. Qualsiasi citometro a flusso con i filtri appropriati funzionerà.
      NOTA: In questo studio sono stati utilizzati i seguenti filtri: (1) VL1 per DAPI: Eccitazione/Emissione - 405 nm/440 nm (50 nm); (2) BL1 per Fluozin-3-AM: Eccitazione/Emissione - 488 nm/530 nm (30 nm); (3) VL3 per mt-Keima neutro: Eccitazione/Emissione - 405 nm/603 nm (48 nm); (4) YL2 per l'acido mt-Keima: Eccitazione/Emissione - 561 nm/620 nm (15 nm).
   2. Regolare le tensioni FSC e SSC ed escludere le celle non singole come descritto nei passaggi 1.2.2-1.2.3 (Figure 3A-C).
   3. Regolare le tensioni e la compensazione per DAPI, Fluozin-3-AM e mt-Keima utilizzando controlli non colorati e single-positivi (condizioni 1-4) per garantire che le popolazioni di cellule fluorescenza-positive siano distinguibili dalle cellule non colorate. Una volta applicata la compensazione appropriata a ciascun canale, impostare il gate negativo DAPI e il gate positivo Fluozin-3-AM per filtrare le celle β vive (Figure 3D-E).
   4. Impostare uno schema di gating triangolare utilizzando il campione positivo mt-Keima (condizione 4) per identificare le popolazioni cellulari acide e neutre (Figura 3F).
      NOTA: Tensioni tipicamente utilizzate per ciascun canale: (1) VL1: 320-340 V; (2) BL2: 260-280 V; (3) VL3: 280-300 V; (4) YL2: 280-300 V.
   5. Una volta stabiliti i gate, raccogliere 10.000 eventi per campione. Gli schemi di gating per le condizioni 5 e 6 sono illustrati nella Figura 3A-G.
   6. Salvare i dati come file FCS per l'analisi.

Risultati

Valutazione della mitofagia tramite l'approccio MtPhagy basato su coloranti
Questo approccio basato su coloranti è stato ottimizzato per analizzare il flusso mitofagico all'interno delle cellule primarie di β di topo senza la necessità di un reporter genetico, utilizzando Fluozin-3-AM, TMRE e MtPhagy, nonché DAPI per escludere le cellule morte. Accoppiando questi coloranti con valinomicina per indurre la mitofagia, questo protocollo delinea un metodo basato su coloranti per misurare selettivamente...

Discussione

Questo protocollo ha descritto due metodi complementari per quantificare il flusso mitofagico nelle isole primarie di topo dissociate. Utilizzando il metodo mt-Keima, un aumento della mitofagia è stato quantificato come un aumento del rapporto tra cellule acide (561 nm) / neutre (405 nm), mentre nel metodo MtPhagi, l'aumento del flusso mitofagico è stato quantificato come un aumento della popolazione cellulare Fluozin^{ad alto}MtPhagy^{ad alto}TMRE^basso . Questi metodi consentono valutazioni ...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Antibiotic-Antimycotic	Life Technologies	15240-062
Attune NxT Flow Cytometer	Thermofisher Scientific	A24858
Dimethyl Sulfoxide	Sigma-Aldrich	317275
Fatty Acid Free heat shock BSA powder	Equitech	BAH66
Fetal bovine serum	Gemini Bio	900-108
Fluozin-3AM	Thermofisher Scientific	F24195	100 μg Fluozin-3AM powder reconstituted in 51 μL DMSO and 51 μL Pluronic F-127 to reach 1 mM stock.
Gibco RPMI 1640 Medium	Fisher Scientific	11-875-093
HEPES (1M)	Life Technologies	15630-080
MtPhagy dye	Dojindo	MT02-10	5 μg MtPhagy powder reconstituted with 50 μL DMSO to reach 100 μM stock.
MtPhagy dye	Dojindo	MT02-10
Penicillin-Streptomycin (100x)	Life Technologies	15140-122	1x Solution used in procotol by diluting 1:10 in ddH2O
Phosphate buffered saline, 10x	Fisher Scientific	BP399-20	1x Solution used in procotol by diluting 1:10 in ddH2O
Sodium Pyruvate (100x)	Life Technologies	11360-070	5 μg MtPhagy powder reconstituted with 50 μL DMSO to reach 100 μM stock.
TMRE [Tetramethylrhodamine, ethyl ester, perchlorate]	Anaspec	AS-88061	TMRE powder reconstituted in DMSO to reach 100 μM stock.
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red	Thermofisher Scientific	25300054
Valinomycin	Sigma	V0627	Valinomycin powder reconsituted in DMSO to reach 250 nM stock.