Approcci complementari per interrogare il flusso mitofagico nelle cellule β pancreatiche

Riepilogo

Questo protocollo delinea due metodi per l'analisi quantitativa della mitofagia nelle cellule β pancreatiche: in primo luogo, una combinazione di coloranti specifici per mitocondri permeabili alle cellule e, in secondo luogo, un reporter mitofagico geneticamente codificato. Queste due tecniche sono complementari e possono essere implementate in base a esigenze specifiche, consentendo flessibilità e precisione nell'affrontare quantitativamente il controllo di qualità mitocondriale.

Abstract

La mitofagia è un meccanismo di controllo della qualità necessario per mantenere una funzione mitocondriale ottimale. La mitofagia disfunzionale a β cellule provoca un rilascio insufficiente di insulina. Le valutazioni quantitative avanzate della mitofagia spesso richiedono l'uso di reporter genetici. Il modello murino mt-Keima, che esprime una sonda raziometrica a doppia eccitazione sensibile al pH mirata ai mitocondri per quantificare la mitofagia tramite citometria a flusso, è stato ottimizzato in cellule β. Il rapporto tra le emissioni acide e neutre della lunghezza d'onda mt-Keima può essere utilizzato per quantificare in modo robusto la mitofagia. Tuttavia, l'utilizzo di reporter di mitofagia genetica può essere difficile quando si lavora con modelli murini genetici complessi o cellule difficili da trasfettare, come le isole umane primarie. Questo protocollo descrive un nuovo metodo complementare basato su coloranti per quantificare la mitofagia a β cellule nelle isole primarie utilizzando MtPhagy. La mtfagia è un colorante sensibile al pH e permeabile alle cellule che si accumula nei mitocondri e aumenta la sua intensità di fluorescenza quando i mitocondri si trovano in ambienti a basso pH, come i lisosomi durante la mitofagia. Combinando il colorante MtPhagy con Fluozin-3-AM, un indicatore Zn²⁺ che seleziona le cellule β, e Tetrametilrodamina, estere etilico (TMRE) per valutare il potenziale di membrana mitocondriale, il flusso mitofagico può essere quantificato in modo specifico nelle cellule β tramite citometria a flusso. Questi due approcci sono altamente complementari e consentono flessibilità e precisione nella valutazione del controllo di qualità mitocondriale in numerosi modelli di cellule β.

Introduzione

Le cellule β pancreatiche producono e secernono insulina per soddisfare le richieste metaboliche e la disfunzione delle cellule β è responsabile dell'iperglicemia e dell'insorgenza del diabete sia nel diabete di tipo 1 che in quello di tipo 2. Le cellule β accoppiano il metabolismo del glucosio con la secrezione di insulina attraverso l'energetica mitocondriale e l'output metabolico, che dipendono da una riserva di massa mitocondriale funzionale ^1,2,3. Per mantenere una funzione ottimale delle cellule β, le cellule β si affidano a meccanismi di controllo della qualità mitocon....

Protocollo

Gli studi sugli animali presentati in questo protocollo sono stati esaminati e approvati dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali dell'Università del Michigan. Per questo studio sono stati utilizzati topi maschi C57BL/6J di 20 settimane, con una dieta grassa regolare (RFD) di 15 settimane o una dieta ricca di grassi (HFD).

1. Valutazione della mitofagia tramite l'approccio MtPhagy basato su coloranti (Metodo 1)

1. Preparazione e trattamento delle isole di topo
   1. Eseguire la coltura delle isole e l'esposizione alla valinomicina seguendo i passaggi seguenti.
      1. Isolare le isole da topi con ....

Discussione

Questo protocollo ha descritto due metodi complementari per quantificare il flusso mitofagico nelle isole primarie di topo dissociate. Utilizzando il metodo mt-Keima, un aumento della mitofagia è stato quantificato come un aumento del rapporto tra cellule acide (561 nm) / neutre (405 nm), mentre nel metodo MtPhagi, l'aumento del flusso mitofagico è stato quantificato come un aumento della popolazione cellulare Fluozin^{ad alto}MtPhagy^{ad alto}TMRE^basso . Questi metodi consentono valutazioni .......

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Antibiotic-Antimycotic	Life Technologies	15240-062
Attune NxT Flow Cytometer	Thermofisher Scientific	A24858
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)	Thermofisher Scientific	D1306	DAPI reconstituted in ddH2O to reach 0.2 µg/mL stock
Dimethyl Sulfoxide	Sigma-Aldrich	317275
Fatty Acid Free heat shock BSA powder	Equitech	BAH66
Fetal bovine serum	Gemini Bio	900-108
Fluozin-3AM	Thermofisher Scientific	F24195	100 μg Fluozin-3AM powder reconstituted in 51 μL DMSO and 51 μL Pluronic F-127 to reach 1 mM stock.
Gibco RPMI 1640 Medium	Fisher Scientific	11-875-093
HEPES (1M)	Life Technologies	15630-080
MtPhagy dye	Dojindo	MT02-10	5 μg MtPhagy powder reconstituted with 50 μL DMSO to reach 100 μM stock.
MtPhagy dye	Dojindo	MT02-10
Penicillin-Streptomycin (100x)	Life Technologies	15140-122	1x Solution used in procotol by diluting 1:10 in ddH2O
Phosphate buffered saline, 10x	Fisher Scientific	BP399-20	1x Solution used in procotol by diluting 1:10 in ddH2O
Sodium Pyruvate (100x)	Life Technologies	11360-070	5 μg MtPhagy powder reconstituted with 50 μL DMSO to reach 100 μM stock.
TMRE [Tetramethylrhodamine, ethyl ester, perchlorate]	Anaspec	AS-88061	TMRE powder reconstituted in DMSO to reach 100 μM stock.
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red	Thermofisher Scientific	25300054
Valinomycin	Sigma	V0627	Valinomycin powder reconsituted in DMSO to reach 250 nM stock.