Комплементарные подходы к исследованию потока митофагии в β-клетках поджелудочной железы

Резюме

В этом протоколе описаны два метода количественного анализа митофагии в β-клетках поджелудочной железы: во-первых, комбинация проницаемых для клеток митохондриально-специфических красителей, и, во-вторых, генетически кодируемый репортер митофагии. Эти два метода дополняют друг друга и могут быть применены в зависимости от конкретных потребностей, что обеспечивает гибкость и точность в количественном контроле качества митохондрий.

Аннотация

Митофагия – это механизм контроля качества, необходимый для поддержания оптимальной функции митохондрий. Дисфункциональная β-клеточная митофагия приводит к недостаточному высвобождению инсулина. Расширенная количественная оценка митофагии часто требует использования генетических репортеров. Мышиная модель mt-Keima, которая экспрессирует митохондриально-чувствительный рН-чувствительный ратиометрический зонд с двойным возбуждением для количественной оценки митофагии с помощью проточной цитометрии, была оптимизирована в β-клетках. Соотношение кислотных и нейтральных длин волн mt-Keima может быть использовано для надежной количественной оценки митофагии. Тем не менее, использование репортеров генетической митофагии может быть сложной задачей при работе со сложными генетическими моделями мышей или трудно трансфицируемыми клетками, такими как первичные островки человека. Этот протокол описывает новый комплементарный метод на основе красителя для количественной оценки митофагии β-клеток в первичных островках с использованием MtPhagy. MtPhagy — это pH-чувствительный, проницаемый для клеток краситель, который накапливается в митохондриях и увеличивает интенсивность флуоресценции, когда митохондрии находятся в среде с низким pH, например, лизосомы во время митофагии. Комбинируя краситель MtPhagy с флюозином-3-AM, индикатором Zn²⁺ , который селекционирует β-клетки, и тетраметилродамином, этиловым эфиром (TMRE) для оценки мембранного потенциала митохондрий, поток митофагии может быть количественно определен конкретно в β-клетках с помощью проточной цитометрии. Эти два подхода в значительной степени дополняют друг друга, обеспечивая гибкость и точность в оценке контроля качества митохондрий в многочисленных моделях β-клеток.

Введение

β-клетки поджелудочной железы вырабатывают и секретируют инсулин для удовлетворения метаболических потребностей, а дисфункция β-клеток ответственна за гипергликемию и начало диабета как при диабете 1-го, так и 2-го типа. β-клетки связывают метаболизм глюкозы с секрецией инсулина через митохондриальную энергетику и метаболический выход, которые зависят от резерва функциональной митохондриальной массы ^1,2,3. Для поддержания оптимального функционирования β-клеток β-клетки полагаются на механизмы контроля качества митохондрий для удаления старых или поврежденных митохондрий и сох....

протокол

Исследования на животных, представленные в этом протоколе, были рассмотрены и одобрены Комитетом по уходу за животными и их использованию Мичиганского университета. Для этого исследования были использованы 20-недельные самцы мышей C57BL/6J, находившиеся либо на 15-недельной диете с регулярным содержанием жиров (RFD), либо на диете с высоким содержанием жиров (HFD).

1. Оценка митофагии с помощью метода MtPhagy на основе красителя (Метод 1)

1. Подготовка и лечение островков мыши
   1. Проведите посев островков и воздействие валиномицина, выполнив следующие действия.
      1. Изолируют островки от мышей с обычной жировой....

Результаты

Оценка митофагии с помощью метода MtPhagy на основе красителя
Этот подход, основанный на красителях, был оптимизирован для анализа потока митофагии в первичных β-клетках мышей без необходимости использования генетического репортера, с использованием Fluozin-3-AM, TMRE и MtPhagy, а также DAP.......

Обсуждение

В этом протоколе описаны два взаимодополняющих метода количественной оценки потока митофагии в диссоциированных первичных островках мышей. С помощью метода mt-Keima увеличение митофагии количественно оценивалось как увеличение соотношения кислотных (561 нм)/нейтральных (405 нм) клеток, тог.......

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Antibiotic-Antimycotic	Life Technologies	15240-062
Attune NxT Flow Cytometer	Thermofisher Scientific	A24858
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)	Thermofisher Scientific	D1306	DAPI reconstituted in ddH2O to reach 0.2 µg/mL stock
Dimethyl Sulfoxide	Sigma-Aldrich	317275
Fatty Acid Free heat shock BSA powder	Equitech	BAH66
Fetal bovine serum	Gemini Bio	900-108
Fluozin-3AM	Thermofisher Scientific	F24195	100 μg Fluozin-3AM powder reconstituted in 51 μL DMSO and 51 μL Pluronic F-127 to reach 1 mM stock.
Gibco RPMI 1640 Medium	Fisher Scientific	11-875-093
HEPES (1M)	Life Technologies	15630-080
MtPhagy dye	Dojindo	MT02-10	5 μg MtPhagy powder reconstituted with 50 μL DMSO to reach 100 μM stock.
MtPhagy dye	Dojindo	MT02-10
Penicillin-Streptomycin (100x)	Life Technologies	15140-122	1x Solution used in procotol by diluting 1:10 in ddH2O
Phosphate buffered saline, 10x	Fisher Scientific	BP399-20	1x Solution used in procotol by diluting 1:10 in ddH2O
Sodium Pyruvate (100x)	Life Technologies	11360-070	5 μg MtPhagy powder reconstituted with 50 μL DMSO to reach 100 μM stock.
TMRE [Tetramethylrhodamine, ethyl ester, perchlorate]	Anaspec	AS-88061	TMRE powder reconstituted in DMSO to reach 100 μM stock.
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red	Thermofisher Scientific	25300054
Valinomycin	Sigma	V0627	Valinomycin powder reconsituted in DMSO to reach 250 nM stock.