Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

В этом протоколе описаны два метода количественного анализа митофагии в β-клетках поджелудочной железы: во-первых, комбинация проницаемых для клеток митохондриально-специфических красителей, и, во-вторых, генетически кодируемый репортер митофагии. Эти два метода дополняют друг друга и могут быть применены в зависимости от конкретных потребностей, что обеспечивает гибкость и точность в количественном контроле качества митохондрий.

Аннотация

Митофагия – это механизм контроля качества, необходимый для поддержания оптимальной функции митохондрий. Дисфункциональная β-клеточная митофагия приводит к недостаточному высвобождению инсулина. Расширенная количественная оценка митофагии часто требует использования генетических репортеров. Мышиная модель mt-Keima, которая экспрессирует митохондриально-чувствительный рН-чувствительный ратиометрический зонд с двойным возбуждением для количественной оценки митофагии с помощью проточной цитометрии, была оптимизирована в β-клетках. Соотношение кислотных и нейтральных длин волн mt-Keima может быть использовано для надежной количественной оценки митофагии. Тем не менее, использование репортеров генетической митофагии может быть сложной задачей при работе со сложными генетическими моделями мышей или трудно трансфицируемыми клетками, такими как первичные островки человека. Этот протокол описывает новый комплементарный метод на основе красителя для количественной оценки митофагии β-клеток в первичных островках с использованием MtPhagy. MtPhagy — это pH-чувствительный, проницаемый для клеток краситель, который накапливается в митохондриях и увеличивает интенсивность флуоресценции, когда митохондрии находятся в среде с низким pH, например, лизосомы во время митофагии. Комбинируя краситель MtPhagy с флюозином-3-AM, индикатором Zn2+ , который селекционирует β-клетки, и тетраметилродамином, этиловым эфиром (TMRE) для оценки мембранного потенциала митохондрий, поток митофагии может быть количественно определен конкретно в β-клетках с помощью проточной цитометрии. Эти два подхода в значительной степени дополняют друг друга, обеспечивая гибкость и точность в оценке контроля качества митохондрий в многочисленных моделях β-клеток.

Введение

β-клетки поджелудочной железы вырабатывают и секретируют инсулин для удовлетворения метаболических потребностей, а дисфункция β-клеток ответственна за гипергликемию и начало диабета как при диабете 1-го, так и 2-го типа. β-клетки связывают метаболизм глюкозы с секрецией инсулина через митохондриальную энергетику и метаболический выход, которые зависят от резерва функциональной митохондриальной массы 1,2,3. Для поддержания оптимального функционирования β-клеток β-клетки полагаются на механизмы контроля качества митохондрий для удаления старых или поврежденных митохондрий и сох....

протокол

Исследования на животных, представленные в этом протоколе, были рассмотрены и одобрены Комитетом по уходу за животными и их использованию Мичиганского университета. Для этого исследования были использованы 20-недельные самцы мышей C57BL/6J, находившиеся либо на 15-недельной диете с регулярным содержанием жиров (RFD), либо на диете с высоким содержанием жиров (HFD).

1. Оценка митофагии с помощью метода MtPhagy на основе красителя (Метод 1)

  1. Подготовка и лечение островков мыши
    1. Проведите посев островков и воздействие валиномицина, выполнив следующие действия.
      1. Изолируют островки от мышей с обычной жировой....

Результаты

Оценка митофагии с помощью метода MtPhagy на основе красителя
Этот подход, основанный на красителях, был оптимизирован для анализа потока митофагии в первичных β-клетках мышей без необходимости использования генетического репортера, с использованием Fluozin-3-AM, TMRE и MtPhagy, а также DAP.......

Обсуждение

В этом протоколе описаны два взаимодополняющих метода количественной оценки потока митофагии в диссоциированных первичных островках мышей. С помощью метода mt-Keima увеличение митофагии количественно оценивалось как увеличение соотношения кислотных (561 нм)/нейтральных (405 нм) клеток, тог.......

Раскрытие информации

Компания SAS получила грантовое финансирование от компании Ono Pharmaceutical Co., Ltd. и является консультантом компании «Ново Нордиск».

Благодарности

Э.Л-Д. выражает признательность за поддержку со стороны NIH (T32-AI007413 и T32-AG000114). SAS выражает признательность за поддержку со стороны JDRF (COE-2019-861), NIH (R01 DK135268, R01 DK108921, R01 DK135032, R01 DK136547, U01 DK127747), Департамента по делам ветеранов (I01 BX004444), семьи Брем и семьи Энтони.

....

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
Antibiotic-AntimycoticLife Technologies15240-062
Attune NxT Flow CytometerThermofisher ScientificA24858
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)Thermofisher ScientificD1306DAPI reconstituted in ddH2O to reach 0.2 µg/mL stock
Dimethyl SulfoxideSigma-Aldrich317275
Fatty Acid Free heat shock BSA powderEquitechBAH66
Fetal bovine serumGemini Bio900-108
Fluozin-3AM Thermofisher Scientific F24195100 μg Fluozin-3AM powder reconstituted in 51 μL DMSO and 51 μL Pluronic F-127 to reach 1 mM stock. 
Gibco RPMI 1640 MediumFisher Scientific11-875-093
HEPES (1M)Life Technologies15630-080
MtPhagy dyeDojindoMT02-105 μg MtPhagy powder reconstituted with 50 μL DMSO to reach 100 μM stock. 
MtPhagy dyeDojindoMT02-10
Penicillin-Streptomycin (100x)Life Technologies15140-1221x Solution used in procotol by diluting 1:10 in ddH2O
Phosphate buffered saline, 10xFisher ScientificBP399-201x Solution used in procotol by diluting 1:10 in ddH2O
Sodium Pyruvate (100x)Life Technologies11360-0705 μg MtPhagy powder reconstituted with 50 μL DMSO to reach 100 μM stock. 
TMRE [Tetramethylrhodamine, ethyl ester, perchlorate]AnaspecAS-88061TMRE powder reconstituted in DMSO to reach 100 μM stock.
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol redThermofisher Scientific25300054
ValinomycinSigmaV0627Valinomycin powder reconsituted in DMSO to reach 250 nM stock.

Ссылки

  1. Kaufman, B. A., Li, C., Soleimanpour, S. A. Mitochondrial regulation of β-cell function: maintaining the momentum for insulin release. Molecular Aspects of Medicine. 42, 91-104 (2015).
  2. Soleimanpour, S. A., et al.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

PHMt Keima3Zn2TMRE

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Исследования

Образование

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены