JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

В этом протоколе описаны два метода количественного анализа митофагии в β-клетках поджелудочной железы: во-первых, комбинация проницаемых для клеток митохондриально-специфических красителей, и, во-вторых, генетически кодируемый репортер митофагии. Эти два метода дополняют друг друга и могут быть применены в зависимости от конкретных потребностей, что обеспечивает гибкость и точность в количественном контроле качества митохондрий.

Аннотация

Митофагия – это механизм контроля качества, необходимый для поддержания оптимальной функции митохондрий. Дисфункциональная β-клеточная митофагия приводит к недостаточному высвобождению инсулина. Расширенная количественная оценка митофагии часто требует использования генетических репортеров. Мышиная модель mt-Keima, которая экспрессирует митохондриально-чувствительный рН-чувствительный ратиометрический зонд с двойным возбуждением для количественной оценки митофагии с помощью проточной цитометрии, была оптимизирована в β-клетках. Соотношение кислотных и нейтральных длин волн mt-Keima может быть использовано для надежной количественной оценки митофагии. Тем не менее, использование репортеров генетической митофагии может быть сложной задачей при работе со сложными генетическими моделями мышей или трудно трансфицируемыми клетками, такими как первичные островки человека. Этот протокол описывает новый комплементарный метод на основе красителя для количественной оценки митофагии β-клеток в первичных островках с использованием MtPhagy. MtPhagy — это pH-чувствительный, проницаемый для клеток краситель, который накапливается в митохондриях и увеличивает интенсивность флуоресценции, когда митохондрии находятся в среде с низким pH, например, лизосомы во время митофагии. Комбинируя краситель MtPhagy с флюозином-3-AM, индикатором Zn2+ , который селекционирует β-клетки, и тетраметилродамином, этиловым эфиром (TMRE) для оценки мембранного потенциала митохондрий, поток митофагии может быть количественно определен конкретно в β-клетках с помощью проточной цитометрии. Эти два подхода в значительной степени дополняют друг друга, обеспечивая гибкость и точность в оценке контроля качества митохондрий в многочисленных моделях β-клеток.

Введение

β-клетки поджелудочной железы вырабатывают и секретируют инсулин для удовлетворения метаболических потребностей, а дисфункция β-клеток ответственна за гипергликемию и начало диабета как при диабете 1-го, так и 2-го типа. β-клетки связывают метаболизм глюкозы с секрецией инсулина через митохондриальную энергетику и метаболический выход, которые зависят от резерва функциональной митохондриальной массы 1,2,3. Для поддержания оптимального функционирования β-клеток β-клетки полагаются на механизмы контроля качества митохондрий для удаления старых или поврежденных митохондрий и сохранения функциональной митохондриальной массы. Селективная митохондриальная аутофагия, также известная как митофагия, является ключевым компонентом пути контроля качества митохондрий.

Оценка митофагии в живых клетках часто основывается на изменениях рН митохондрий, которые происходят во время митофагии. Митохондрии имеют слабощелочной рН, а здоровые митохондрии обычно находятся в рН-нейтральном цитозоле. Во время митофагии поврежденные или дисфункциональные митохондрии избирательно включаются в аутофагосомы и, в конечном итоге, очищаются в кислых лизосомах5. Несколько моделей репортерных мышей с трансгенной митофагией in vivo, такие как mt-Keima6, mitoQC7 и CMMR8, а также трансфектабельные митофагические зонды, такие как плазмида Cox8-EGFP-mCherry9, используют это изменение рН для количественной оценки митофагии. Использование трансгенных мышей, экспрессирующих pH-чувствительный рН-чувствительный ритиометрический зонд с двойным возбуждением, было оптимизировано для оценки митофагии в островках и β-клетках с помощью проточной цитометрии10,11. Отношение кислотных и нейтральных длин волн mt-Keima (отношение кислотного возбуждения 561 нм к нейтральному возбуждению 480 нм) может быть использовано для надежной количественной оценки митофагии 6,12.

Данный протокол описывает оптимизированный подход к оценке потока митофагии в первичных островках и β-клетках, выделенных от трансгенных мышей mt-Keima10,11. Несмотря на то, что mt-Keima является высокочувствительным зондом, он требует либо сложных схем разведения животных, либо трансфекции клеток, что часто может быть сложной задачей при работе в сочетании с другими генетическими моделями или с первичными островками человека. Кроме того, использование нескольких флуоресцентных лазеров и детекторов для идентификации нейтральных и кислых клеточных популяций может ограничить комбинаторное использование других флуоресцентных репортеров.

Для преодоления этих проблем в этом протоколе также описан комплементарный метод на основе одного флуоресцентного канала на основе красителя для надежного обнаружения митофагии в β-клетках из изолированных островков мыши. Этот подход, называемый методом MtPhagy, использует комбинацию трех проницаемых для клеток красителей для отбора β-клеток, количественной оценки клеточных популяций, активно подвергающихся митофагии, и одновременной оценки мембранного потенциала митохондрий (MMP или Δψm).

Первым из этих красителей является Fluozin-3-AM, проницаемый для клеток индикатор Zn2+ с Ex/Em 494/516 нм13. Островки мышей представляют собой гетерогенную популяцию функционально различных клеток, включая α-, β-, δ- и PP-клетки. β-клетки составляют примерно 80% клеток в островке мыши и могут быть отличимы от других типов островковых клеток из-за их высокой концентрации Zn2+ в гранулах инсулина14,15, что позволяет идентифицировать β-клетки каквысокую популяцию Fluozin-3-AM. Вэтом протоколе также используется краситель MtPhagy, pH-чувствительный краситель, который иммобилизован на митохондриях посредством химической связи и излучает слабую флуоресценцию. При индукции митофагии поврежденные митохондрии включаются в кислую лизосому, и краситель MtPhagy увеличивает интенсивность флуоресценции в среде с низким pH (Ex/Em 561/570-700 нм).

Кроме того, для оценки ММР используется тетраметилродамин, этиловый эфир (TMRE). TMRE представляет собой проницаемый для клеток положительно заряженный краситель (Ex/Em 552/575 нм), который секвестрируется здоровыми митохондриями из-за относительного отрицательного заряда, поддерживаемого их мембранным потенциалом17. Поврежденные или нездоровые митохондрии рассеивают свой мембранный потенциал, что приводит к снижению способности связывать TMRE. Используя эти красители вместе, β-клетки, подвергающиеся митофагии, могут быть идентифицированы какнизкая популяция MtPhagyс высокимсодержанием флюозина MtPhagy high TMRE с помощью проточной цитометрии. Поскольку митофагия является динамическим, а не статическим процессом, этот протокол был оптимизирован для оценки потока митофагии с использованием валиномицина, K+-ионофора, который индуцирует митофагию после диссипации MMP18. Сравнение митофагии в присутствии и отсутствии валиномицина позволяет оценить поток митофагии в разных группах образцов.

Основанный на красителях характер современного подхода позволяет экстраполировать его на островки человека и другие трудно трансфицируемые типы клеток и обходит необходимость в сложных схемах разведения животных, в отличие от протокола mt-Keima. Главной целью этого протокола является количественная оценка митофагии в β-клетках на уровне одной клетки с помощью двух независимых методов, основанных на проточной цитометрии. Взятые вместе, этот протокол описывает два мощных и взаимодополняющих метода, которые обеспечивают как точность, так и гибкость в количественном исследовании контроля качества митохондрий.

протокол

Исследования на животных, представленные в этом протоколе, были рассмотрены и одобрены Комитетом по уходу за животными и их использованию Мичиганского университета. Для этого исследования были использованы 20-недельные самцы мышей C57BL/6J, находившиеся либо на 15-недельной диете с регулярным содержанием жиров (RFD), либо на диете с высоким содержанием жиров (HFD).

1. Оценка митофагии с помощью метода MtPhagy на основе красителя (Метод 1)

  1. Подготовка и лечение островков мыши
    1. Проведите посев островков и воздействие валиномицина, выполнив следующие действия.
      1. Изолируют островки от мышей с обычной жировой диетой (RFD) или диетой с высоким содержанием жиров (HFD, 60 ккал% жира19), следуя ранее описанным методам 2,10.
      2. Образцы островковых культур в течение ночи при 37 °C в среде RPMI с добавлением 100 ЕД/мл антимикотического антибиотика, 50 ЕД/мл пенициллина-стрептомицина, 1 мМ пирувата натрия, 10 мМ HEPES и 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS) (см. таблицу материалов). Эта среда будет называться "островковой средой".
      3. С помощью пипетки набирают по 100 островков в чашки Петри диаметром 6 см в 2 мл островковой среды.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Условия, используемые для этого протокола: (1) Контроль без пятен: неокрашенные островки RFD; (2) Управление только DAPI: островки RFD, окрашенные DAPI; (3) Контроль только флуозина-3-АМ: островки RFD, окрашенные флуозином-3-АМ; (4) Управление только MtPhagy: островки RFD, окрашенные MtPhagy; (5) Управление только TMRE: островки RFD, окрашенные TMRE; (6) RFD без обработки: островки RFD, окрашенные MtPhagy, TMRE, Fluozin-3-AM и DAPI; (7) Островки RFD, подверженные воздействию валиномицина: островки RFD, подвергшиеся воздействию валиномицина и окрашенные MtPhagy, TMRE, Fluozin-3-AM и DAPI; (8) HFD необработанные: островки HFD, окрашенные MtPhagy, TMRE, Fluozin-3-AM и DAPI; (9) Островки HFD, подверженные воздействию валиномицина: островки HFD, подвергшиеся воздействию валиномицина и окрашенные MtPhagy, TMRE, Fluozin-3-AM и DAPI.
      4. Для условий (7) и (9) (см. ПРИМЕЧАНИЕ выше), подвергшихся воздействию валиномицина, добавляют 2 мкл 250 нМк валиномицина (см. таблицу материалов) к островкам в чашке Петри в течение 3 ч, чтобы индуцировать митофагию.
    2. Выполните диссоциацию одиночных клеток.
      1. После 3-часовой экспозиции валиномицина с помощью пипетки отбирают по 100 островков от каждого состояния в отдельные микроцентрифужные пробирки.
      2. Отжим островки при 350 x g в течение 1 мин при 10 °C и выбросьте надосадочную жидкость с помощью пипетки.
      3. Промывайте образцы 2 раза 1 мл 1x фосфатно-солевым буфером (PBS) с этапами отжима (350 x g/1 мин, 10 °C) между каждой промывкой. Выбрасывайте надосадочную жидкость с помощью пипетки после каждой стирки.
      4. Чтобы диссоциировать островки на отдельные клетки, добавьте 500 мкл 0,05% трипсина (предварительно нагретого до 37 °C) в микроцентрифужную пробирку одного образца, чтобы предотвратить чрезмерное переваривание островков. Пипетки поднимайте и опускайте несколько раз до тех пор, пока островки не станут заметно рассеянными.
      5. Немедленно добавьте 1 мл предварительно подогретой островковой среды, чтобы нейтрализовать трипсин. Повторите трипсинизацию и нейтрализацию для каждого образца по одному.
      6. Отжим образцов при 500 x g в течение 5 мин при 10 °C. Удалите надосадочную жидкость пипеткой, стараясь не потревожить гранулу.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Гранулы будут деликатными для образцов, подвергшихся воздействию валиномицина.
      7. Промывают образцы 2 раза средой RPMI, без фенольного красного, с добавлением 100 ЕД/мл антимикотического антибиотика, 50 ЕД/мл пенициллина-стрептомицина, 1 мМ пирувата натрия, 10 мМ HEPES и 10% бычьего сывороточного альбумина (БСА). Эта среда будет называться «средой островкового потока». Включайте этапы отжима (350 x g/1 мин, 10 °C) между каждой стиркой. Выбрасывайте надосадочную жидкость с помощью пипетки после каждой стирки.
    3. Окрасьте клетки MtPhagy, TMRE, Fluozin-3-AM и DAPI для подготовки к проточной цитометрии.
      1. Ресуспендируйте островковые образцы в 500 мкл островковой проточной среды.
      2. Добавьте 0,25 мкл 100 мкМ материала MtPhagy (см. Таблицу материалов) в пробирки, получающие краситель MtPhagy (условия 4, 6, 7, 8 и 9, ПРИМЕЧАНИЕ к шагу 1.1.1).
      3. Добавьте 0,25 мкл 100 мкМ материала TMRE (см. таблицу материалов) в пробирки, получающие краситель TMRE (условия 5, 6, 7, 8 и 9).
      4. Добавляют 0,25 мкл 1 мМ препарата Флуозин-3-АМ (см. таблицу материалов) в пробирки, получающие краситель Флуозин-3-АМ (условия 3, 6, 7, 8 и 9).
      5. Вихревые трубки на низкой скорости в течение 5 с для перемешивания.
      6. Заверните пробирки микроцентрифуги в алюминиевую фольгу для защиты от света и инкубируйте при 37 °C в течение 30 мин. В середине инкубации вихревые пробирки на низкой скорости в течение 5-10 с перемешивают.
      7. После инкубации образцы центрифугируют при 350 x g в течение 1 мин при 10 °C. Выбросьте надосадочную жидкость с помощью пипетки.
      8. Ресуспендируйте образцы в проточной среде островков объемом 500 мкл. Добавьте 0,2 мкг/мл DAPI (см. таблицу материалов) к условиям 2, 6, 7, 8 и 9.
      9. Отжим образцы при 350 x g в течение 1 мин при 10 °C. Удалите надосадочную жидкость с помощью пипетки и повторно суспендируйте в 500 мкл островковой проточной среды.
      10. Поместите образцы на лед.
  2. Проточная цитометрия
    1. Запустите прибор (см. Таблицу материалов).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Подойдет любой проточный цитометр с соответствующими фильтрами. В данном исследовании использовались следующие фильтры: (1) VL1 для DAPI: Возбуждение/излучение - 405 нм/440 нм (50 нм); (2) BL1 для Fluozin-3-AM: возбуждение/излучение - 488 нм/530 нм (30 нм); (3) BL2 для красителя MtPhagy: возбуждение/излучение - 488 нм/590 нм (40 нм); (4) YL1 для TMRE: возбуждение/излучение - 561 нм/585 нм (16 нм).
    2. Отрегулируйте напряжения для прямого (FSC) и бокового рассеяния (SSC), чтобы убедиться, что популяции ячеек находятся в центре диаграммы рассеяния. Для этого протокола использовалось напряжение 120 В для FSC и 260 В для SSC, чтобы обеспечить равномерное распределение ячеек в пределах FSC-A и SSC. График SSC-A (рис. 1А).
    3. Чтобы исключить неодиночные ячейки, добавьте прямоугольный вентиль для FSC-H vs. FSC-W, за которым следует SSC-H vs. SSC-W (рис. 1B,C).
    4. Отрегулируйте напряжение и компенсацию для DAPI для фильтрации живых β-элементов. Установите флуоресцентные вентили для каждого используемого флуорофора на основе неокрашенного образца RFD (рис. 1D-F).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Напряжение, используемое для каждого канала: (1) VL1: 320-360 В; (2) BL1: 300-340 В; (3) BL2: 260-300 В; (4) YL1: 300-340 В.
    5. После установки шлюзов соберите 10 000 событий на выборку.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Используя этот подход, уровни митофагии в базальных условиях и при индукции валиномицина оценивали как в RFD, так и в HFD островках (рис. 2).
    6. Сохранение данных в виде файлов FCS для анализа.

2. Оценка митофагии с помощью генетически кодируемого репортера mt-Keima (Метод 2)

  1. Препарирование островков мыши и диссоциация отдельных клеток
    1. Проведите посев островков и воздействие валиномицина, выполнив следующие действия.
      1. Изолировать островки поджелудочной железы от мышей дикого типа (WT) и mt-Keima/+ (mt-Keima)6. В этом методе использовали 20-недельных самцов мышей WT или mt-Keima/+, которых кормили RFD.
      2. Культуральные островковые образцы в течение ночи при 37 °C в островковой среде.
      3. С помощью пипетки наберите 100 островков в чашки Петри диаметром 6 см с 2 мл островковой среды.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Условия, используемые для этого протокола: (1) Неокрашенный контроль: Неокрашенные островки WT; (2) Контроль только DAPI: островки WT, окрашенные DAPI; (3) Контроль только флуозина-3-АМ: островки WT, окрашенные флуозином-3-АМ; (4) Контроль только mt-Keima: Неокрашенные островки mt-Keima/+; (5) Необработанные: островки mt-Keima/+, окрашенные флуозином-3-AM и DAPI; (6) Валиномицин: островки mt-Keima/+, подвергшиеся воздействию валиномицина и окрашенные Fluozin-3-AM и DAPI.
      4. При условии (6) с экспозицией валиномицина добавляют 2 мкл 250 нМ валиномицина к островкам в чашке Петри в течение 3 ч, чтобы индуцировать митофагию.
    2. Выполните диссоциацию одной клетки.
      1. Выполните этапы диссоциации одиночных клеток, как описано в шаге 1.1.2.
    3. Окрашивают клетки препаратами Fluozin-3-AM и DAPI.
      1. Ресуспендируйте островковые образцы в 500 мкл островковой проточной среды.
      2. Добавьте 0,25 мкл 1 мМ препарата Флуозин-3-АМ в пробирки, получающие краситель Флуозин-3-АМ (условия 3, 5 и 6).
      3. Инкубируют клетки при 37 °C и приступают к обработке DAPI, как описано в шагах 1.1.3.5-1.3.10.
  2. Проточная цитометрия
    1. Запустите прибор. Подойдет любой проточный цитометр с соответствующими фильтрами.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В этом исследовании использовались следующие фильтры: (1) VL1 для DAPI: Возбуждение/излучение - 405 нм/440 нм (50 нм); (2) BL1 для Fluozin-3-AM: возбуждение/излучение - 488 нм/530 нм (30 нм); (3) VL3 для нейтрали mt-Keima: возбуждение/излучение - 405 нм/603 нм (48 нм); (4) YL2 для мт-кеймской кислоты: возбуждение/излучение - 561 нм/620 нм (15 нм).
    2. Отрегулируйте напряжения FSC и SSC и исключите неодиночные ячейки, как описано в шагах 1.2.2-1.2.3 (рисунки 3A-C).
    3. Отрегулируйте напряжения и компенсацию для DAPI, Fluozin-3-AM и mt-Keima, используя неокрашенные и одиночные положительные элементы управления (условия 1-4), чтобы убедиться, что флуоресцентно-положительные клеточные популяции можно отличить от неокрашенных. После того, как к каждому каналу применена соответствующая компенсация, настройте отрицательный затвор DAPI и положительный затвор Fluozin-3-AM для фильтрации живых β-ячеек (рис. 3D-E).
    4. Настройте схему треугольного стробирования с использованием положительного образца mt-Keima (условие 4) для идентификации кислых и нейтральных клеточных популяций (рис. 3F).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Напряжения, обычно используемые для каждого канала: (1) VL1: 320-340 В; (2) BL2: 260-280 В; (3) VL3: 280-300 В; (4) YL2: 280-300 В.
    5. После установки шлюзов соберите 10 000 событий на выборку. Литниковые схемы для условий 5 и 6 проиллюстрированы на рисунке 3A-G.
    6. Сохранение данных в виде файлов FCS для анализа.

Результаты

Оценка митофагии с помощью метода MtPhagy на основе красителя
Этот подход, основанный на красителях, был оптимизирован для анализа потока митофагии в первичных β-клетках мышей без необходимости использования генетического репортера, с использованием Fluozin-3-AM, TMRE и MtPhagy, а также DAP...

Обсуждение

В этом протоколе описаны два взаимодополняющих метода количественной оценки потока митофагии в диссоциированных первичных островках мышей. С помощью метода mt-Keima увеличение митофагии количественно оценивалось как увеличение соотношения кислотных (561 нм)/нейтральных (405 нм) клеток, тог...

Раскрытие информации

Компания SAS получила грантовое финансирование от компании Ono Pharmaceutical Co., Ltd. и является консультантом компании «Ново Нордиск».

Благодарности

Э.Л-Д. выражает признательность за поддержку со стороны NIH (T32-AI007413 и T32-AG000114). SAS выражает признательность за поддержку со стороны JDRF (COE-2019-861), NIH (R01 DK135268, R01 DK108921, R01 DK135032, R01 DK136547, U01 DK127747), Департамента по делам ветеранов (I01 BX004444), семьи Брем и семьи Энтони.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
Antibiotic-AntimycoticLife Technologies15240-062
Attune NxT Flow CytometerThermofisher ScientificA24858
Dimethyl SulfoxideSigma-Aldrich317275
Fatty Acid Free heat shock BSA powderEquitechBAH66
Fetal bovine serumGemini Bio900-108
Fluozin-3AM Thermofisher Scientific F24195100 μg Fluozin-3AM powder reconstituted in 51 μL DMSO and 51 μL Pluronic F-127 to reach 1 mM stock. 
Gibco RPMI 1640 MediumFisher Scientific11-875-093
HEPES (1M)Life Technologies15630-080
MtPhagy dyeDojindoMT02-105 μg MtPhagy powder reconstituted with 50 μL DMSO to reach 100 μM stock. 
MtPhagy dyeDojindoMT02-10
Penicillin-Streptomycin (100x)Life Technologies15140-1221x Solution used in procotol by diluting 1:10 in ddH2O
Phosphate buffered saline, 10xFisher ScientificBP399-201x Solution used in procotol by diluting 1:10 in ddH2O
Sodium Pyruvate (100x)Life Technologies11360-0705 μg MtPhagy powder reconstituted with 50 μL DMSO to reach 100 μM stock. 
TMRE [Tetramethylrhodamine, ethyl ester, perchlorate]AnaspecAS-88061TMRE powder reconstituted in DMSO to reach 100 μM stock.
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol redThermofisher Scientific25300054
ValinomycinSigmaV0627Valinomycin powder reconsituted in DMSO to reach 250 nM stock.

Ссылки

  1. Kaufman, B. A., Li, C., Soleimanpour, S. A. Mitochondrial regulation of β-cell function: maintaining the momentum for insulin release. Molecular Aspects of Medicine. 42, 91-104 (2015).
  2. Soleimanpour, S. A., et al. The diabetes susceptibility gene Clec16a regulates mitophagy. Cell. 157 (7), 1577-1590 (2014).
  3. Pearson, G., et al. Clec16a, Nrdp1, and USP8 form a ubiquitin-dependent tripartite complex that regulates β-cell mitophagy. Diabetes. 67 (2), 265-277 (2018).
  4. Hattori, N., Saiki, S., Imai, Y. Regulation by mitophagy. International Journal of Biochemistry and Cell Biology. 53, 147-150 (2014).
  5. Berezhnov, A. V., et al. Intracellular pH modulates autophagy and mitophagy. Journal of Biological Chemistry. 291 (16), 8701-8708 (2016).
  6. Sun, N., et al. Measuring in vivo mitophagy. Molecular Cell. 60 (4), 685-696 (2015).
  7. McWilliams, T. G., et al. mito-QC illuminates mitophagy and mitochondrial architecture in vivo. Journal of Cell Biology. 214 (3), 333-345 (2016).
  8. Aoyagi, K., et al. A new beta cell-specific mitophagy reporter mouse shows that metabolic stress leads to accumulation of dysfunctional mitochondria despite increased mitophagy. Diabetologia. 66 (1), 147-162 (2023).
  9. Ma, X., Ding, W. X. A fluorescence imaging based-assay to monitor mitophagy in cultured hepatocytes and mouse liver. Liver Research. 5 (1), 16-20 (2021).
  10. Sidarala, V., et al. Mitophagy protects β cells from inflammatory damage in diabetes. JCI Insight. 5 (24), 141138 (2020).
  11. Gingerich, M. A., et al. An intrinsically disordered protein region encoded by the human disease gene CLEC16A regulates mitophagy. Autophagy. 19 (2), 525-543 (2023).
  12. Sun, N., Malide, D., Liu, J., Rovira, I. I., Combs, C. A., Finkel, T. A fluorescence-based imaging method to measure in vitro and in vivo mitophagy using mt-Keima. Nature Protocols. 12 (8), 1576-1587 (2017).
  13. Zhao, J., Bertoglio, B. A., Gee, K. R., Kay, A. R. The zinc indicator FluoZin-3 is not perturbed significantly by physiological levels of calcium or magnesium. Cell Calcium. 44 (4), 422-426 (2008).
  14. Da Silva Xavier, G. The Cells of the Islets of Langerhans. Journal of Clinical Medicine. 7 (3), 54 (2018).
  15. Thapa, B., et al. Imaging β-cell function using a zinc-responsive MRI contrast agent may identify first responder islets. Frontiers in Endocrinology. 12, 809867 (2022).
  16. Iwashita, H., et al. Live cell imaging of mitochondrial autophagy with a novel fluorescent small molecule. ACS Chemical Biology. 12 (10), 2546-2551 (2017).
  17. Crowley, L. C., Christensen, M. E., Waterhouse, N. J. Measuring mitochondrial transmembrane potential by TMRE staining. Cold Spring Harbor Protocols. 2016 (12), 087361 (2016).
  18. Klein, B., Wörndl, K., Lütz-Meindl, U., Kerschbaum, H. H. Perturbation of intracellular K(+) homeostasis with valinomycin promotes cell death by mitochondrial swelling and autophagic processes. Apoptosis. 16 (11), 1101-1117 (2011).
  19. Ji, Y., et al. Toll-like receptors TLR2 and TLR4 block the replication of pancreatic β cells in diet-induced obesity. Nature Immunology. 20 (6), 677-686 (2019).
  20. Sauvat, A., et al. Quantification of cellular viability by automated microscopy and flow cytometry. Oncotarget. 6 (11), 9467-9475 (2015).
  21. Liu, Y. T., et al. Mt-Keima detects PINK1-PRKN mitophagy in vivo with greater sensitivity than mito-QC. Autophagy. 17 (11), 3753-3762 (2021).
  22. Mauro-Lizcano, M., et al. New method to assess mitophagy flux by flow cytometry. Autophagy. 11 (5), 833-843 (2015).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

PHMt Keima3Zn2TMRE

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены