Approches complémentaires pour interroger le flux de mitophagie dans les cellules β pancréatiques

Résumé

Ce protocole décrit deux méthodes pour l’analyse quantitative de la mitophagie dans les cellules β pancréatiques : premièrement, une combinaison de colorants spécifiques aux mitochondries perméables aux cellules, et deuxièmement, un rapporteur de mitophagie génétiquement codé. Ces deux techniques sont complémentaires et peuvent être déployées en fonction de besoins spécifiques, ce qui permet une flexibilité et une précision dans l’adressage quantitatif du contrôle de la qualité mitochondriale.

Résumé

La mitophagie est un mécanisme de contrôle de la qualité nécessaire au maintien d’une fonction mitochondriale optimale. Une mitophagie dysfonctionnelle à β cellules entraîne une libération insuffisante d’insuline. Les évaluations quantitatives avancées de la mitophagie nécessitent souvent l’utilisation de rapporteurs génétiques. Le modèle murin mt-Keima, qui exprime une sonde à double rapport d’excitation sensible au pH ciblant les mitochondries pour quantifier la mitophagie par cytométrie en flux, a été optimisé dans les cellules β. Le rapport entre les émissions de longueur d’onde mt-Keima acides/neutres peut être utilisé pour quantifier de manière robuste la mitophagie. Cependant, l’utilisation de rapporteurs de mitophagie génétique peut être difficile lorsque l’on travaille avec des modèles murins génétiques complexes ou des cellules difficiles à transfecter, telles que les îlots humains primaires. Ce protocole décrit une nouvelle méthode complémentaire à base de colorants pour quantifier la mitophagie à cellules β dans les îlots primaires à l’aide de MtPhagy. MtPhagy est un colorant sensible au pH et perméable aux cellules qui s’accumule dans les mitochondries et augmente son intensité de fluorescence lorsque les mitochondries se trouvent dans des environnements à faible pH, tels que les lysosomes pendant la mitophagie. En combinant le colorant MtPhagy avec la fluozine-3-AM, un indicateur de Zn²⁺ qui sélectionne les cellules β, et la tétraméthylrhodamine, ester éthylique (TMRE) pour évaluer le potentiel de la membrane mitochondriale, le flux de mitophagie peut être quantifié spécifiquement dans les cellules β par cytométrie en flux. Ces deux approches sont très complémentaires, ce qui permet une flexibilité et une précision dans l’évaluation du contrôle de la qualité mitochondriale dans de nombreux modèles β cellules.

Introduction

Les cellules β pancréatiques produisent et sécrètent de l’insuline pour répondre aux demandes métaboliques, et le dysfonctionnement des cellules β est responsable de l’hyperglycémie et de l’apparition du diabète dans les diabètes de type 1 et de type 2. Les β-cellules couplent le métabolisme du glucose avec la sécrétion d’insuline via l’énergétique mitochondriale et la production métabolique, qui dépendent d’une réserve de masse mitochondriale fonctionnelle ^1,2,3. Pour maintenir une fonction optimale des β cellules, les cellules β s’appuient sur des mécanismes de contrôle de ....

Protocole

Les études animales présentées dans ce protocole ont été examinées et approuvées par le Comité institutionnel de protection et d’utilisation des animaux de l’Université du Michigan. Des souris mâles C57BL/6J âgées de vingt semaines, soumises à un régime régulier de 15 semaines en graisses (RFD) ou à un régime riche en graisses (HFD), ont été utilisées pour cette étude.

1. Évaluation de la mitophagie par l’approche MtPhagy à base de colorant (Méthode 1)

1. Préparation et traitement des îlots de la souris
   1. Effectuez la culture des îlots pancréatiques et l’exposition à la valinomycine en suivant les étapes ci-dess....

Discussion

Ce protocole décrit deux méthodes complémentaires pour quantifier le flux de mitophagie dans les îlots primaires dissociés de souris. À l’aide de la méthode mt-Keima, une augmentation de la mitophagie a été quantifiée comme une augmentation du rapport entre les cellules acides (561 nm) et neutres (405 nm), tandis que dans la méthode MtPhago, l’augmentation du flux de mitophagie a été quantifiée comme une augmentation de la population^{de cellules à faible TMREà haute teneur en.......}

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Antibiotic-Antimycotic	Life Technologies	15240-062
Attune NxT Flow Cytometer	Thermofisher Scientific	A24858
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)	Thermofisher Scientific	D1306	DAPI reconstituted in ddH2O to reach 0.2 µg/mL stock
Dimethyl Sulfoxide	Sigma-Aldrich	317275
Fatty Acid Free heat shock BSA powder	Equitech	BAH66
Fetal bovine serum	Gemini Bio	900-108
Fluozin-3AM	Thermofisher Scientific	F24195	100 μg Fluozin-3AM powder reconstituted in 51 μL DMSO and 51 μL Pluronic F-127 to reach 1 mM stock.
Gibco RPMI 1640 Medium	Fisher Scientific	11-875-093
HEPES (1M)	Life Technologies	15630-080
MtPhagy dye	Dojindo	MT02-10	5 μg MtPhagy powder reconstituted with 50 μL DMSO to reach 100 μM stock.
MtPhagy dye	Dojindo	MT02-10
Penicillin-Streptomycin (100x)	Life Technologies	15140-122	1x Solution used in procotol by diluting 1:10 in ddH2O
Phosphate buffered saline, 10x	Fisher Scientific	BP399-20	1x Solution used in procotol by diluting 1:10 in ddH2O
Sodium Pyruvate (100x)	Life Technologies	11360-070	5 μg MtPhagy powder reconstituted with 50 μL DMSO to reach 100 μM stock.
TMRE [Tetramethylrhodamine, ethyl ester, perchlorate]	Anaspec	AS-88061	TMRE powder reconstituted in DMSO to reach 100 μM stock.
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red	Thermofisher Scientific	25300054
Valinomycin	Sigma	V0627	Valinomycin powder reconsituted in DMSO to reach 250 nM stock.