Approches complémentaires pour interroger le flux de mitophagie dans les cellules β pancréatiques

Résumé

Ce protocole décrit deux méthodes pour l’analyse quantitative de la mitophagie dans les cellules β pancréatiques : premièrement, une combinaison de colorants spécifiques aux mitochondries perméables aux cellules, et deuxièmement, un rapporteur de mitophagie génétiquement codé. Ces deux techniques sont complémentaires et peuvent être déployées en fonction de besoins spécifiques, ce qui permet une flexibilité et une précision dans l’adressage quantitatif du contrôle de la qualité mitochondriale.

Résumé

La mitophagie est un mécanisme de contrôle de la qualité nécessaire au maintien d’une fonction mitochondriale optimale. Une mitophagie dysfonctionnelle à β cellules entraîne une libération insuffisante d’insuline. Les évaluations quantitatives avancées de la mitophagie nécessitent souvent l’utilisation de rapporteurs génétiques. Le modèle murin mt-Keima, qui exprime une sonde à double rapport d’excitation sensible au pH ciblant les mitochondries pour quantifier la mitophagie par cytométrie en flux, a été optimisé dans les cellules β. Le rapport entre les émissions de longueur d’onde mt-Keima acides/neutres peut être utilisé pour quantifier de manière robuste la mitophagie. Cependant, l’utilisation de rapporteurs de mitophagie génétique peut être difficile lorsque l’on travaille avec des modèles murins génétiques complexes ou des cellules difficiles à transfecter, telles que les îlots humains primaires. Ce protocole décrit une nouvelle méthode complémentaire à base de colorants pour quantifier la mitophagie à cellules β dans les îlots primaires à l’aide de MtPhagy. MtPhagy est un colorant sensible au pH et perméable aux cellules qui s’accumule dans les mitochondries et augmente son intensité de fluorescence lorsque les mitochondries se trouvent dans des environnements à faible pH, tels que les lysosomes pendant la mitophagie. En combinant le colorant MtPhagy avec la fluozine-3-AM, un indicateur de Zn²⁺ qui sélectionne les cellules β, et la tétraméthylrhodamine, ester éthylique (TMRE) pour évaluer le potentiel de la membrane mitochondriale, le flux de mitophagie peut être quantifié spécifiquement dans les cellules β par cytométrie en flux. Ces deux approches sont très complémentaires, ce qui permet une flexibilité et une précision dans l’évaluation du contrôle de la qualité mitochondriale dans de nombreux modèles β cellules.

Introduction

Les cellules β pancréatiques produisent et sécrètent de l’insuline pour répondre aux demandes métaboliques, et le dysfonctionnement des cellules β est responsable de l’hyperglycémie et de l’apparition du diabète dans les diabètes de type 1 et de type 2. Les β-cellules couplent le métabolisme du glucose avec la sécrétion d’insuline via l’énergétique mitochondriale et la production métabolique, qui dépendent d’une réserve de masse mitochondriale fonctionnelle ^1,2,3. Pour maintenir une fonction optimale des β cellules, les cellules β s’appuient sur des mécanismes de contrôle de la qualité mitochondriale pour éliminer les mitochondries âgées ou endommagées et préserver la masse mitochondriale fonctionnelle⁴. L’autophagie mitochondriale sélective, également connue sous le nom de mitophagie, est un élément clé de la voie de contrôle de la qualité mitochondriale.

Les évaluations de la mitophagie dans les cellules vivantes reposent souvent sur les changements du pH mitochondrial qui se produisent au cours de la mitophagie. Les mitochondries ont un pH légèrement alcalin et les mitochondries saines résident normalement dans le cytosol au pH neutre. Au cours de la mitophagie, les mitochondries endommagées ou dysfonctionnelles sont sélectivement incorporées dans les autophagosomes et finissent par être éliminées dans les lysosomes acides⁵. Plusieurs modèles murins rapporteurs de mitophagie transgénique in vivo, tels que mt-Keima⁶, mitoQC⁷ et CMMR⁸, ainsi que des sondes de mitophagie transfécondables, telles que le plasmide Cox8-EGFP-mCherry⁹, utilisent ce changement de pH pour fournir des évaluations quantitatives de la mitophagie. L’utilisation de souris transgéniques exprimant la sonde métrique à double rapport d’excitation sensible au pH mt-Keima a été optimisée pour les évaluations de mitophagie dans les îlots pancréatiques et les cellules β par cytométrie en flux^10,11. Le rapport entre les émissions de longueur d’onde mt-Keima acides/neutres (le rapport entre l’excitation acide de 561 nm et l’excitation neutre de 480 nm) peut être utilisé pour quantifier de manière robuste la mitophagie ^6,12.

Ce protocole décrit une approche optimisée pour évaluer le flux de mitophagie dans les îlots primaires et les cellules β isolées de souris transgéniques mt-Keima^10,11. Bien que mt-Keima soit une sonde très sensible, elle nécessite soit des schémas de sélection animale compliqués, soit la transfection de cellules, ce qui peut souvent être difficile lorsqu’on travaille en combinaison avec d’autres modèles génétiques ou avec des îlots humains primaires. De plus, l’utilisation de plusieurs lasers et détecteurs à fluorescence pour identifier les populations cellulaires neutres et acides peut limiter l’utilisation combinatoire d’autres rapporteurs fluorescents.

Pour surmonter ces défis, ce protocole décrit également une méthode complémentaire, à canal fluorescent unique, à base de colorant, pour une détection robuste de la mitophagie dans les cellules β provenant d’îlots de souris isolés. Cette approche, connue sous le nom de méthode MtPhagogy, utilise une combinaison de trois colorants perméables aux cellules pour sélectionner les cellules β, quantifier les populations cellulaires subissant activement la mitophagie et évaluer simultanément le potentiel de membrane mitochondriale (MMP ou Δψm).

Le premier de ces colorants est le Fluozin-3-AM, un indicateur de Zn²⁺ perméable aux cellules avec un Ex/Em 494/516 nm¹³. Les îlots de souris comprennent une population hétérogène de cellules fonctionnellement distinctes, y compris des cellules α, β, δ et PP. Les cellules β comprennent environ 80 % des cellules de l’îlot de souris et se distinguent des autres types de cellules d’îlots en raison de leur concentration élevée en Zn²⁺ dans les granules d’insuline^14,15, ce qui permet d’identifier les cellules β comme étant la population^élevée de Fluozin-3-AM. Le colorant MtPhago, un colorant sensible au pH qui est immobilisé sur les mitochondries via une liaison chimique et émet une faible fluorescence, est également utilisé dans ce protocole¹⁶. Lors de l’induction de la mitophagie, les mitochondries endommagées sont incorporées dans le lysosome acide et le colorant MtPhagy augmente son intensité de fluorescence dans l’environnement à faible pH (Ex/Em 561/570-700 nm).

De plus, la tétraméthylrhodamine, ester éthylique (TMRE), est utilisée pour évaluer la MMP. Le TMRE est un colorant chargé positivement perméable aux cellules (Ex/Em 552/575 nm) qui est séquestré par les mitochondries saines en raison de la charge négative relative maintenue par leur potentiel membranaire¹⁷. Les mitochondries endommagées ou malsaines dissipent leur potentiel membranaire, ce qui entraîne une diminution de la capacité à séquestrer l’ERM. En utilisant ces colorants ensemble, les cellules β subissant une mitophagie peuvent être identifiées comme la population^{à haute teneur en}Fluozine à haute teneur en TMRE^parcytométrie en flux. Étant donné que la mitophagie est un processus dynamique plutôt que statique, ce protocole a été optimisé pour évaluer le flux de mitophagie à l’aide de la valinomycine, un ionophore K⁺ qui induit la mitophagie après dissipation de MMP¹⁸. La comparaison de la mitophagie en présence et en absence de valinomycine permet d’évaluer le flux de mitophagie dans différents groupes d’échantillons.

La nature colorante de l’approche actuelle permet de l’extrapoler aux îlots humains et à d’autres types de cellules difficiles à transfecter et de contourner la nécessité de schémas de sélection animale compliqués, contrairement au protocole mt-Keima. L’objectif principal de ce protocole est de quantifier la mitophagie dans les cellules β au niveau de la cellule unique via deux méthodes indépendantes basées sur la cytométrie en flux. Pris ensemble, ce protocole décrit deux méthodes puissantes et complémentaires qui permettent à la fois précision et flexibilité dans l’étude quantitative du contrôle de la qualité mitochondriale.

Protocole

Les études animales présentées dans ce protocole ont été examinées et approuvées par le Comité institutionnel de protection et d’utilisation des animaux de l’Université du Michigan. Des souris mâles C57BL/6J âgées de vingt semaines, soumises à un régime régulier de 15 semaines en graisses (RFD) ou à un régime riche en graisses (HFD), ont été utilisées pour cette étude.

1. Évaluation de la mitophagie par l’approche MtPhagy à base de colorant (Méthode 1)

1. Préparation et traitement des îlots de la souris
   1. Effectuez la culture des îlots pancréatiques et l’exposition à la valinomycine en suivant les étapes ci-dessous.
      1. Isolez les îlots de souris d’un régime alimentaire régulier en graisses (RFD) ou d’un régime riche en graisses (HFD, 60 kcal% Fat¹⁹), en suivant les méthodes décrites précédemment ^2,10.
      2. Cultiver des échantillons d’îlots pancréatiques pendant la nuit à 37 °C dans un milieu RPMI complété par 100 unités/mL d’antibiotique-antimycosique, 50 unités/mL de pénicilline-streptomycine, 1 mM de pyruvate de sodium, 10 mM de HEPES et 10 % de sérum de veau fœtal (FBS) (voir le tableau des matériaux). Ce milieu sera appelé « milieu d’îlot ».
      3. À l’aide d’une pipette, prélever 100 îlots par condition dans des boîtes de Pétri de 6 cm dans 2 mL de milieu d’îlots.
         REMARQUE : Conditions utilisées pour ce protocole : (1) Contrôle non coloré : îlots RFD non colorés ; (2) Contrôle DAPI uniquement : îlots RFD colorés avec DAPI ; (3) Contrôle de Fluozin-3-AM uniquement : îlots RFD colorés avec Fluozin-3-AM ; (4) Contrôle MtPhagy uniquement : îlots RFD colorés avec MtPhagy ; (5) Contrôle TMRE uniquement : îlots RFD colorés avec TMRE ; (6) RFD non traité : îlots RFD colorés avec MtPhagy, TMRE, Fluozin-3-AM et DAPI ; (7) Îlots RFD exposés à la valinomycine : Îlots RFD exposés à la valinomycine et colorés avec MtPhagy, TMRE, Fluozin-3-AM et DAPI ; (8) HFD non traité : îlots HFD colorés avec MtPhagy, TMRE, Fluozin-3-AM et DAPI ; (9) Îlots HFD exposés à la valinomycine : Îlots HFD exposés à la valinomycine et colorés avec MtPhagy, TMRE, Fluozin-3-AM et DAPI.
      4. Pour les conditions (7) et (9) (voir NOTE ci-dessus) exposées à la valinomycine, ajouter 2 μL de stock de valinomycine à 250 nΜ (voir tableau des matériaux) aux îlots de Pétri pendant 3 h pour induire la mitophagie.
   2. Effectuer la dissociation d’une seule cellule.
      1. Après 3 h d’exposition à la valinomycine, prélever 100 îlots de chaque condition dans des tubes de microcentrifugation séparés à l’aide d’une pipette.
      2. Essorer les îlots à 350 x g pendant 1 min à 10 °C et jeter le surnageant à l’aide d’une pipette.
      3. Laver les échantillons 2 fois avec 1 mL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS), en effectuant des étapes d’essorage (350 x g/1 min, 10 °C) entre chaque lavage. Jeter le surnageant à l’aide d’une pipette après chaque lavage.
      4. Pour dissocier les îlots en cellules individuelles, ajouter 500 μL de trypsine à 0,05 % (préchauffée à 37 °C) dans le tube de microcentrifugation d’un échantillon afin d’éviter une digestion excessive des îlots. Pipetez de haut en bas à plusieurs reprises jusqu’à ce que les îlots soient visiblement dispersés.
      5. Ajouter immédiatement 1 mL de milieu d’îlot préchauffé pour neutraliser la trypsine. Répétez la trypsinisation et la neutralisation pour chaque échantillon, un à la fois.
      6. Essorer les échantillons à 500 x g pendant 5 min à 10 °C. Retirer le surnageant à l’aide d’une pipette, en prenant soin de ne pas déranger la pastille.
         REMARQUE : Les pastilles seront délicates pour les échantillons exposés à la valinomycine.
      7. Laver les échantillons 2 fois avec un milieu RPMI, sans rouge phénolique, complété par 100 unités/mL d’antibiotique-antimycosique, 50 unités/mL de pénicilline-streptomycine, 1 mM de pyruvate de sodium, 10 mM de HEPES et 10 % d’albumine sérique bovine (BSA). Ce milieu sera appelé « milieu d’écoulement d’îlots ». Inclure des étapes d’essorage (350 x g/1 min, 10 °C) entre chaque lavage. Jeter le surnageant à l’aide d’une pipette après chaque lavage.
   3. Colorer les cellules avec MtPhagy, TMRE, Fluozin-3-AM et DAPI pour les préparer à la cytométrie en flux.
      1. Remettre en suspension des échantillons d’îlots pancréatiques dans 500 μL de milieu d’écoulement d’îlots.
      2. Ajouter 0,25 μL de 100 μM de MtPhagy (voir le tableau des matériaux) aux tubes recevant le colorant MtPhagy (conditions 4, 6, 7, 8 et 9, NOTE à l’étape 1.1.1).
      3. Ajouter 0,25 μL de 100 μM de TMRE (voir le tableau des matériaux) aux tubes recevant le colorant TMRE (conditions 5, 6, 7, 8 et 9).
      4. Ajouter 0,25 μL de 1 mM de Fluozin-3-AM (voir le tableau des matériaux) aux tubes recevant le colorant Fluozin-3-AM (conditions 3, 6, 7, 8 et 9).
      5. Tubes vortex à basse vitesse pendant 5 s pour mélanger.
      6. Envelopper les tubes de la microcentrifugeuse dans du papier d’aluminium à l’abri de la lumière et incuber à 37 °C pendant 30 min. À mi-incubation, les tubes vortex à basse vitesse pendant 5 à 10 s se mélangent.
      7. Après incubation, centrifuger des échantillons à 350 x g pendant 1 min à 10 °C. Jeter le surnageant à l’aide d’une pipette.
      8. Remettre les échantillons en suspension dans un milieu d’écoulement d’îlot de 500 μL. Ajouter 0,2 μg/mL de DAPI (voir le tableau des matériaux) aux conditions 2, 6, 7, 8 et 9.
      9. Essorer les échantillons à 350 x g pendant 1 min à 10 °C. Jeter le surnageant à l’aide d’une pipette et remettre en suspension dans 500 μL de milieu d’écoulement des îlots pancréatiques.
      10. Placer les échantillons sur de la glace.
2. Cytométrie en flux
   1. Démarrez l’instrument (voir Tableau des matériaux).
      REMARQUE : N’importe quel cytomètre en flux avec les filtres appropriés fonctionnera. Les filtres suivants ont été utilisés dans cette étude : (1) VL1 pour DAPI : Excitation/Émission - 405 nm/440 nm (50 nm) ; (2) BL1 pour Fluozin-3-AM : Excitation/Émission - 488 nm/530 nm (30 nm) ; (3) BL2 pour le colorant MtPhagy : Excitation/Émission - 488 nm/590 nm (40 nm) ; (4) YL1 pour TMRE : Excitation/Émission - 561 nm/585 nm (16 nm).
   2. Ajustez les tensions pour la diffusion directe (FSC) et latérale (SSC) pour vous assurer que les populations cellulaires sont au centre du nuage de points. Pour ce protocole, les tensions utilisées étaient de 120 V pour le FSC et de 260 V pour le SSC afin de garantir que les cellules se situent uniformément dans le FSC-A par rapport au FSC-A. Graphique SSC-A (figure 1A).
   3. Pour exclure les cellules non individuelles, ajoutez une porte rectangulaire sur FSC-H vs. FSC-W suivi de SSC-H vs. SSC-W (Figure 1B, C).
   4. Ajustez les tensions et la compensation pour le DAPI afin de filtrer les cellules β sous tension. Définir des grilles de fluorescence pour chaque fluorophore utilisé en fonction de l’échantillon RFD non coloré (figures 1D-F).
      REMARQUE : Tensions utilisées pour chaque canal : (1) VL1 : 320-360 V ; (2) BL1 : 300 à 340 V ; (3) BL2 : 260 à 300 V ; (4) YL1 : 300 à 340 V.
   5. Une fois les points de contrôle établis, collectez 10 000 événements par échantillon.
      NOTA : À l’aide de cette approche de déclenchement, les niveaux de mitophagie dans des conditions basales et lors de l’induction de la valinomycine ont été évalués dans les îlots RFD et HFD (Figure 2).
   6. Enregistrez les données sous forme de fichiers FCS pour les analyser.

2. Évaluation de la mitophagie à l’aide du rapporteur mt-Keima génétiquement codé (Méthode 2)

1. Préparation d’îlots de souris et dissociation d’une cellule unique
   1. Effectuez la culture des îlots pancréatiques et l’exposition à la valinomycine en suivant les étapes ci-dessous.
      1. Isolez les îlots pancréatiques de souris de type sauvage (WT) et mt-Keima/+ (mt-Keima)⁶. Dans cette méthode, des souris mâles de 20 semaines nourries avec des souris RFD WT ou mt-Keima/+ ont été utilisées.
      2. Cultiver des échantillons d’îlots pancréatiques pendant la nuit à 37 °C dans un milieu d’îlots.
      3. À l’aide d’une pipette, prélever 100 îlots par condition dans des boîtes de Pétri de 6 cm avec 2 mL de milieu d’îlots.
         NOTA : Conditions utilisées pour ce protocole : (1) Témoin non coloré : îlots WT non colorés ; (2) Contrôle DAPI uniquement : îlots WT colorés au DAPI ; (3) Lutte contre la Fluozine-3-AM uniquement : îlots WT colorés à la Fluozine-3-AM ; (4) contrôle du mt-Keima uniquement : îlots mt-Keima/+ non colorés ; (5) Non traité : îlots mt-Keima/+ colorés à la Fluozin-3-AM et au DAPI ; (6) Valinomycine : îlots mt-Keima/+ exposés à la valinomycine et colorés à la fluozine-3-AM et au DAPI.
      4. Pour la condition (6) avec exposition à la valinomycine, ajouter 2 μL de stock de valinomycine à 250 nM aux îlots pancréatiques dans une boîte de Pétri pendant 3 h pour induire la mitophagie.
   2. Effectuer la dissociation d’une seule cellule.
      1. Effectuez les étapes de dissociation d’une seule cellule, comme décrit à l’étape 1.1.2.
   3. Colorer les cellules avec Fluozin-3-AM et DAPI.
      1. Remettre en suspension des échantillons d’îlots pancréatiques dans 500 μL de milieu d’écoulement d’îlots.
      2. Ajouter 0,25 μL de 1 mM de Fluozin-3-AM dans les tubes recevant le colorant Fluozin-3-AM (conditions 3, 5 et 6).
      3. Incuber les cellules à 37 °C et procéder au traitement DAPI, comme décrit aux étapes 1.1.3.5 à 1.3.10.
2. Cytométrie en flux
   1. Démarrez l’instrument. N’importe quel cytomètre en flux avec les filtres appropriés fonctionnera.
      NOTA : Les filtres suivants ont été utilisés dans cette étude : (1) VL1 pour DAPI : Excitation/Émission - 405 nm/440 nm (50 nm) ; (2) BL1 pour Fluozin-3-AM : Excitation/Émission - 488 nm/530 nm (30 nm) ; (3) VL3 pour le neutre mt-Keima : Excitation/Émission - 405 nm/603 nm (48 nm) ; (4) YL2 pour l’acide mt-Keima : Excitation/Émission - 561 nm/620 nm (15 nm).
   2. Ajustez les tensions FSC et SSC et excluez les cellules non simples comme décrit aux étapes 1.2.2 à 1.2.3 (figures 3A à C).
   3. Ajustez les tensions et la compensation pour le DAPI, la Fluozine-3-AM et le mt-Keima à l’aide de témoins non colorés et à positif unique (conditions 1 à 4) pour vous assurer que les populations cellulaires positives à la fluorescence peuvent être distinguées des cellules non colorées. Une fois que la compensation appropriée a été appliquée à chaque canal, réglez la porte négative DAPI et les portes positives Fluozin-3-AM pour filtrer les cellules β vivantes (figures 3D-E).
   4. Mettre en place un schéma de contrôle triangulaire à l’aide de l’échantillon positif mt-Keima (condition 4) pour identifier les populations de cellules acides et neutres (Figure 3F).
      REMARQUE : Tensions généralement utilisées pour chaque canal : (1) VL1 : 320-340 V ; (2) BL2 : 260 à 280 V ; (3) VL3 : 280 à 300 V ; (4) YL2 : 280 à 300 V.
   5. Une fois les points de contrôle établis, collectez 10 000 événements par échantillon. Les schémas de déclenchement pour les conditions 5 et 6 sont illustrés à la figure 3A-G.
   6. Enregistrez les données sous forme de fichiers FCS pour les analyser.

Résultats

Évaluation de la mitophagie via l’approche MtPhagy à base de colorants
Cette approche basée sur les colorants a été optimisée pour analyser le flux de mitophagie dans les cellules β primaires de souris sans avoir besoin d’un rapporteur génétique, en utilisant Fluozin-3-AM, TMRE et MtPhagy ainsi que DAPI pour exclure les cellules mortes. En associant ces colorants à la valinomycine pour induire la mitophagie, ce protocole décrit une méthode à base de colorants pour mesurer sélectiveme...

Discussion

Ce protocole décrit deux méthodes complémentaires pour quantifier le flux de mitophagie dans les îlots primaires dissociés de souris. À l’aide de la méthode mt-Keima, une augmentation de la mitophagie a été quantifiée comme une augmentation du rapport entre les cellules acides (561 nm) et neutres (405 nm), tandis que dans la méthode MtPhago, l’augmentation du flux de mitophagie a été quantifiée comme une augmentation de la population^{de cellules à faible TMREà haute teneur en...}

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Antibiotic-Antimycotic	Life Technologies	15240-062
Attune NxT Flow Cytometer	Thermofisher Scientific	A24858
Dimethyl Sulfoxide	Sigma-Aldrich	317275
Fatty Acid Free heat shock BSA powder	Equitech	BAH66
Fetal bovine serum	Gemini Bio	900-108
Fluozin-3AM	Thermofisher Scientific	F24195	100 μg Fluozin-3AM powder reconstituted in 51 μL DMSO and 51 μL Pluronic F-127 to reach 1 mM stock.
Gibco RPMI 1640 Medium	Fisher Scientific	11-875-093
HEPES (1M)	Life Technologies	15630-080
MtPhagy dye	Dojindo	MT02-10	5 μg MtPhagy powder reconstituted with 50 μL DMSO to reach 100 μM stock.
MtPhagy dye	Dojindo	MT02-10
Penicillin-Streptomycin (100x)	Life Technologies	15140-122	1x Solution used in procotol by diluting 1:10 in ddH2O
Phosphate buffered saline, 10x	Fisher Scientific	BP399-20	1x Solution used in procotol by diluting 1:10 in ddH2O
Sodium Pyruvate (100x)	Life Technologies	11360-070	5 μg MtPhagy powder reconstituted with 50 μL DMSO to reach 100 μM stock.
TMRE [Tetramethylrhodamine, ethyl ester, perchlorate]	Anaspec	AS-88061	TMRE powder reconstituted in DMSO to reach 100 μM stock.
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red	Thermofisher Scientific	25300054
Valinomycin	Sigma	V0627	Valinomycin powder reconsituted in DMSO to reach 250 nM stock.