A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

نقدم مجموعتين داخليتين من RT-qPCR بخطوة واحدة قائمة على المسبار لفيروسات الجهاز التنفسي الشائعة. الفحص الأول هو ل SARS-CoV-2 (N) ، والإنفلونزا A (H1N1 و H3N2) ، والإنفلونزا B. والثاني هو ل SARS-Cov-2 (N) و MERS (UpE و ORF1a). يمكن تنفيذ هذه المقايسات بنجاح في أي مختبر متخصص.

Abstract

يشكل فيروس كورونا 2 المسبب لمرض فيروس كورونا 2019 (COVID-19) المسبب لمرض فيروس كورونا 2019 (COVID-19) تهديدا خطيرا لصحة عامة الناس. خلال مواسم الأنفلونزا ، قد يتسبب انتشار SARS-CoV-2 وفيروسات الجهاز التنفسي الأخرى في عبء أمراض الجهاز التنفسي على مستوى السكان يصعب إدارته. لذلك، ستحتاج فيروسات الجهاز التنفسي SARS-CoV-2 والإنفلونزا A والإنفلونزا B ومتلازمة الشرق الأوسط التنفسية (MERS-CoV) إلى مراقبة دقيقة في فصلي الخريف والشتاء المقبلين، لا سيما في حالة SARS-CoV-2 و Influenza A و Influenza B، التي تشترك في عوامل وبائية مماثلة مثل السكان المعرضين للإصابة وطريقة الانتقال والمتلازمات السريرية. بدون مقايسات محددة الهدف ، قد يكون من الصعب التمييز بين حالات هذه الفيروسات بسبب أوجه التشابه بينها. وفقا لذلك ، فإن مقايسة تعدد الإرسال الحساسة والمستهدفة التي يمكن أن تفرق بسهولة بين هذه الأهداف الفيروسية ستكون مفيدة لممارسي الرعاية الصحية. في هذه الدراسة ، قمنا بتطوير اختبار قائم على النسخ العكسي في الوقت الفعلي باستخدام مجموعة R3T بخطوة واحدة RT-qPCR المطورة داخليا للكشف المتزامن عن SARS-CoV-2 و Influenza A و Influenza B و SARS-CoV-2 و MERS-CoV. مع ما لا يقل عن 10 نسخ من الحمض النووي الريبي الاصطناعي ، يمكننا تحديد أهداف SARS-CoV-2 و Influenza A و Influenza B و MERS-CoV بنجاح في وقت واحد بدقة 100٪. تم العثور على هذا الفحص ليكون دقيقا وموثوقا وبسيطا وحساسا ومحددا. يمكن استخدام الطريقة المطورة كاختبار تشخيصي محسن ل SARS-CoV-2 و Influenza A و Influenza B و SARS-CoV-2 و MERS-CoV في المستشفيات والمراكز الطبية ومختبرات التشخيص وكذلك لأغراض البحث.

Introduction

تنجم جائحة مرض فيروس كورونا المستمر 2019 (COVID-19) عن فيروس كورونا الجديد المعروف باسم فيروس كورونا المسبب للمتلازمة التنفسية الحادة الوخيمة 2 (SARS-CoV-2) 1. نظرا للعدوى القوية ل SAR-CoV-2 وقدرتها على الانتقال السريع ، ظهر جائحة COVID-19 في مدينة ووهان ، الصين ، وانتشر بسرعة في جميع أنحاء العالم. أدى هذا في النهاية إلى ظهور علامات الضائقة التنفسية وحتى الموت2،3،4. تم إعلان COVID-19 جائحة في أكثر من 213 دولة ، متوقعا زيادة حادة في عدد الحالات المؤكدة ، كما يتضح من الأوراق المنشورة في دراسات بحثية مختلفة 3,5

Protocol

1. تق البلمرة التعبير والتنقية

  1. بناء البلازميد مع علامة سداسية الهستيدين قابلة للانقسام في المحطة C للإنزيم.
  2. قم بتحويل 50 نانوغرام من متجه التعبير إلى سلالة E. coli BL21- (DE3) باتباع البروتوكول القياسي38.
  3. قم بتلقيح الخلايا المحولة في أربع قوارير سعة 6 لتر تحتوي كل منها على 2 لتر من مرق الوسائط 2YT عند 37 درجة مئوية مع الاهتزاز عند 170 دورة في الدقيقة حتى يتم الوصول إلى OD 600 من 0.8 أو رقم الخلية 6.4 × 108 .
  4. تحفيز تعبير Taq polymerase مع 0.5 mM من الأيزوبروبيل-β-د-ثيوغالاكتوبيرانوسيد (IPTG) واحتضانه عند 16 درجة مئوية لمدة 18 ساعة مع الرج.
  5. احصد الخلايا عن طريق....

النتائج

في السنوات الأخيرة ، كان هناك تقدم كبير في النهج التشخيصي للكشف عن فيروسات الجهاز التنفسي الشائعة باستخدام نهج تفاعل البوليميراز المتسلسل21،22،23،24،25. ومع ذلك، وعلى الرغم من هذه التطورات، فإن النهج ال.......

Discussion

هناك عبء اقتصادي ثقيل على نظام الرعاية الصحية في جميع أنحاء العالم ناتج عن ارتفاع معدلات العدوى والوفيات بسبب انتشار فيروسات الجهاز التنفسي الشائعة مثل SARS-CoV-2 و Influenza A / B ومتغيرات MERS-CoV12،19،20. بدافع من الشعور بالمسؤولية تجاه تخفيف هذا العب?.......

Disclosures

ويعلن صاحبا البلاغ أنه ليس لهما مصالح مالية متنافسة.

Acknowledgements

تم دعم هذا العمل من قبل جامعة الملك عبد الله للعلوم والتقنية من خلال التمويل الأساسي والتحدي الوطني الكبير (NTGC) ل SMH.

....

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
0.45 μm filter cupsThermo Scientific291-4545
10X Tris-Glycine SDS running bufferNovexLC2675
6-well tissue culturing platesCorning353046
Ammonium sulfateFisher ScientificA701-3
AmpicillinCorning61-238-RH
Cation exchange (HiTrap SP HP) 5 mLCytiva17-1152-01
D-(+)-Biotin, 98+%Thermo ScientificA14207.60
DH10Bac competent cellsFisher Scientific10361012
Dialysis bag (Snakeskin 10,000 MWC)Thermo Scientific68100
Dithiothreitol (DTT)Thermo ScientificR0862
Dnase/Rnase Free Distilled WaterAmbionAM9930
dNTPsThermo ScientificR0192
E. coli BL21(DE3) competent cellsInvitrogenC600003
EDTAFisher ScientificBP120-1
Elution BufferQiagen19086
ESF 921 insect cell culture medium (Insect cells media)Expression Systems96-001-01
FBS SolutionGibcoA38400-01
Fugene (transfection reagent)PromegaE2311
GentamicinFisher Scientific15750060
GlycerolSigma AldrichG5516-500
IGEPAL CA-630Sigma AldrichI8896-100ml
ImidazoleSigma Aldrich56750-1Kg
Influenza A (H1N1) synthetic RNATwist Bioscience103001
Influenza A (H3N2)  synthetic RNATwist Bioscience103002
Influenza B synthetic RNATwist Bioscience103003
IPTGGold BiotechnologyI3481C100
KanamycinGibco11815-032
LB AgarFisher ScientificBP1425-500
LB Broth mediaFisher ScientificBP1426-500
LysozymeSigma AldrichL6876-10G
Magnesium ChlorideSigma Aldrich13152-1Kg
MERS-CoV synthetic RNATwist Bioscience103015
MicroAmp Fast Optical 96-well Reaction plates with Barcode (0.1 mL)Applied Biosystems10310855
Mini- PROTEAN TGX Precast GelBio-Rad456-1093
Miniprep kitQiagen27106
Ni-NTA Excel (HisTrap Excel) 5 mLCytiva17-3712-06
Ni-NTA HP (HisTrap HP) 5 mLCytiva17-5248-02
Optical Adhesice Covers (PCR Compatible,DNA/Rnase/PCR Inhibitors FreeApplied Biosystems4311971
Potassium ChlorideFisher BioreagentsBP366-1
Primers and ProbesIntegrated DNA Technologies, Inc.
Protease Inhibitor Mini tablets EDTA-FreeThermo ScientificA32955
Protein markerFermentas26616
RT-qPCR machine (QuantStudio 7 Flex)Applied Biosystems
S.O.C mediumFisher Scientific15544034
SARS-CoV-+A2:C442 synthetic RNATwist Bioscience102024
Sf9 insect cellsGibcoA35243
Sodium ChlorideSigma AldrichS3014-1Kg
StrepTrap XT 5 mLCytiva29401323
TetracyclineIBI ScientificIB02200
Tris Base Molecular Biology GradePromegaH5135
Tris-HClAffymetrix22676
Tween 20Sigma AldrichP1379-100ml
X-GalInvitrogenB1690

References

  1. Hu, B., Guo, H., Zhou, P., Shi, Z. L. Characteristics of SARS-CoV-2 and COVID-19. Nat Rev Microbiol. 19 (3), 141-154 (2021).
  2. Zhu, N., et al. A novel Coronavirus from patients with Pneumonia in China, 2019. N Eng....

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

JoVE 201 Taq polymerase MMLV RT COVID 19 SARS CoV 2 A B RT qPCR

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Research

Education

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved