تطوير مقايسات RT-qPCR متعددة الإرسال في الوقت الحقيقي للكشف عن SARS-CoV-2 وأنفلونزا A / B و MERS-CoV

Summary

نقدم مجموعتين داخليتين من RT-qPCR بخطوة واحدة قائمة على المسبار لفيروسات الجهاز التنفسي الشائعة. الفحص الأول هو ل SARS-CoV-2 (N) ، والإنفلونزا A (H1N1 و H3N2) ، والإنفلونزا B. والثاني هو ل SARS-Cov-2 (N) و MERS (UpE و ORF1a). يمكن تنفيذ هذه المقايسات بنجاح في أي مختبر متخصص.

Abstract

يشكل فيروس كورونا 2 المسبب لمرض فيروس كورونا 2019 (COVID-19) المسبب لمرض فيروس كورونا 2019 (COVID-19) تهديدا خطيرا لصحة عامة الناس. خلال مواسم الأنفلونزا ، قد يتسبب انتشار SARS-CoV-2 وفيروسات الجهاز التنفسي الأخرى في عبء أمراض الجهاز التنفسي على مستوى السكان يصعب إدارته. لذلك، ستحتاج فيروسات الجهاز التنفسي SARS-CoV-2 والإنفلونزا A والإنفلونزا B ومتلازمة الشرق الأوسط التنفسية (MERS-CoV) إلى مراقبة دقيقة في فصلي الخريف والشتاء المقبلين، لا سيما في حالة SARS-CoV-2 و Influenza A و Influenza B، التي تشترك في عوامل وبائية مماثلة مثل السكان المعرضين للإصابة وطريقة الانتقال والمتلازمات السريرية. بدون مقايسات محددة الهدف ، قد يكون من الصعب التمييز بين حالات هذه الفيروسات بسبب أوجه التشابه بينها. وفقا لذلك ، فإن مقايسة تعدد الإرسال الحساسة والمستهدفة التي يمكن أن تفرق بسهولة بين هذه الأهداف الفيروسية ستكون مفيدة لممارسي الرعاية الصحية. في هذه الدراسة ، قمنا بتطوير اختبار قائم على النسخ العكسي في الوقت الفعلي باستخدام مجموعة R3T بخطوة واحدة RT-qPCR المطورة داخليا للكشف المتزامن عن SARS-CoV-2 و Influenza A و Influenza B و SARS-CoV-2 و MERS-CoV. مع ما لا يقل عن 10 نسخ من الحمض النووي الريبي الاصطناعي ، يمكننا تحديد أهداف SARS-CoV-2 و Influenza A و Influenza B و MERS-CoV بنجاح في وقت واحد بدقة 100٪. تم العثور على هذا الفحص ليكون دقيقا وموثوقا وبسيطا وحساسا ومحددا. يمكن استخدام الطريقة المطورة كاختبار تشخيصي محسن ل SARS-CoV-2 و Influenza A و Influenza B و SARS-CoV-2 و MERS-CoV في المستشفيات والمراكز الطبية ومختبرات التشخيص وكذلك لأغراض البحث.

Introduction

تنجم جائحة مرض فيروس كورونا المستمر 2019 (COVID-19) عن فيروس كورونا الجديد المعروف باسم فيروس كورونا المسبب للمتلازمة التنفسية الحادة الوخيمة 2 (SARS-CoV-2) ¹. نظرا للعدوى القوية ل SAR-CoV-2 وقدرتها على الانتقال السريع ، ظهر جائحة COVID-19 في مدينة ووهان ، الصين ، وانتشر بسرعة في جميع أنحاء العالم. أدى هذا في النهاية إلى ظهور علامات الضائقة التنفسية وحتى الموت^2،3،4. تم إعلان COVID-19 جائحة في أكثر من 213 دولة ، متوقعا زيادة حادة في عدد الحالات المؤكدة ، كما يتضح من الأوراق المنشورة في دراسات بحثية مختلفة ^3,5

Protocol

1. تق البلمرة التعبير والتنقية

1. بناء البلازميد مع علامة سداسية الهستيدين قابلة للانقسام في المحطة C للإنزيم.
2. قم بتحويل 50 نانوغرام من متجه التعبير إلى سلالة E. coli BL21- (DE3) باتباع البروتوكول القياسي³⁸.
3. قم بتلقيح الخلايا المحولة في أربع قوارير سعة 6 لتر تحتوي كل منها على 2 لتر من مرق الوسائط 2YT عند 37 درجة مئوية مع الاهتزاز عند 170 دورة في الدقيقة حتى يتم الوصول إلى OD 600 من 0.8 أو رقم الخلية 6.4 × 10⁸ .
4. تحفيز تعبير Taq polymerase مع 0.5 mM من الأيزوبروبيل-β-د-ثيوغالاكتوبيرانوسيد (IPTG) واحتضانه عند 16 درجة مئوية لمدة 18 ساعة مع الرج.
5. احصد الخلايا عن طريق....

النتائج

في السنوات الأخيرة ، كان هناك تقدم كبير في النهج التشخيصي للكشف عن فيروسات الجهاز التنفسي الشائعة باستخدام نهج تفاعل البوليميراز المتسلسل^{21،22،23،24،25}. ومع ذلك، وعلى الرغم من هذه التطورات، فإن النهج ال.......

Discussion

هناك عبء اقتصادي ثقيل على نظام الرعاية الصحية في جميع أنحاء العالم ناتج عن ارتفاع معدلات العدوى والوفيات بسبب انتشار فيروسات الجهاز التنفسي الشائعة مثل SARS-CoV-2 و Influenza A / B ومتغيرات MERS-CoV^12،19،20. بدافع من الشعور بالمسؤولية تجاه تخفيف هذا العب?.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.45 μm filter cups	Thermo Scientific	291-4545
10X Tris-Glycine SDS running buffer	Novex	LC2675
6-well tissue culturing plates	Corning	353046
Ammonium sulfate	Fisher Scientific	A701-3
Ampicillin	Corning	61-238-RH
Cation exchange (HiTrap SP HP) 5 mL	Cytiva	17-1152-01
D-(+)-Biotin, 98+%	Thermo Scientific	A14207.60
DH10Bac competent cells	Fisher Scientific	10361012
Dialysis bag (Snakeskin 10,000 MWC)	Thermo Scientific	68100
Dithiothreitol (DTT)	Thermo Scientific	R0862
Dnase/Rnase Free Distilled Water	Ambion	AM9930
dNTPs	Thermo Scientific	R0192
E. coli BL21(DE3) competent cells	Invitrogen	C600003
EDTA	Fisher Scientific	BP120-1
Elution Buffer	Qiagen	19086
ESF 921 insect cell culture medium (Insect cells media)	Expression Systems	96-001-01
FBS Solution	Gibco	A38400-01
Fugene (transfection reagent)	Promega	E2311
Gentamicin	Fisher Scientific	15750060
Glycerol	Sigma Aldrich	G5516-500
IGEPAL CA-630	Sigma Aldrich	I8896-100ml
Imidazole	Sigma Aldrich	56750-1Kg
Influenza A (H1N1) synthetic RNA	Twist Bioscience	103001
Influenza A (H3N2)  synthetic RNA	Twist Bioscience	103002
Influenza B synthetic RNA	Twist Bioscience	103003
IPTG	Gold Biotechnology	I3481C100
Kanamycin	Gibco	11815-032
LB Agar	Fisher Scientific	BP1425-500
LB Broth media	Fisher Scientific	BP1426-500
Lysozyme	Sigma Aldrich	L6876-10G
Magnesium Chloride	Sigma Aldrich	13152-1Kg
MERS-CoV synthetic RNA	Twist Bioscience	103015
MicroAmp Fast Optical 96-well Reaction plates with Barcode (0.1 mL)	Applied Biosystems	10310855
Mini- PROTEAN TGX Precast Gel	Bio-Rad	456-1093
Miniprep kit	Qiagen	27106
Ni-NTA Excel (HisTrap Excel) 5 mL	Cytiva	17-3712-06
Ni-NTA HP (HisTrap HP) 5 mL	Cytiva	17-5248-02
Optical Adhesice Covers (PCR Compatible,DNA/Rnase/PCR Inhibitors Free	Applied Biosystems	4311971
Potassium Chloride	Fisher Bioreagents	BP366-1
Primers and Probes	Integrated DNA Technologies, Inc.
Protease Inhibitor Mini tablets EDTA-Free	Thermo Scientific	A32955
Protein marker	Fermentas	26616
RT-qPCR machine (QuantStudio 7 Flex)	Applied Biosystems
S.O.C medium	Fisher Scientific	15544034
SARS-CoV-+A2:C442 synthetic RNA	Twist Bioscience	102024
Sf9 insect cells	Gibco	A35243
Sodium Chloride	Sigma Aldrich	S3014-1Kg
StrepTrap XT 5 mL	Cytiva	29401323
Tetracycline	IBI Scientific	IB02200
Tris Base Molecular Biology Grade	Promega	H5135
Tris-HCl	Affymetrix	22676
Tween 20	Sigma Aldrich	P1379-100ml
X-Gal	Invitrogen	B1690