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  • Introducción
  • Protocolo
  • Resultados
  • Discusión
  • Divulgaciones
  • Agradecimientos
  • Materiales
  • Referencias
  • Reimpresiones y Permisos

Resumen

Presentamos dos kits internos de RT-qPCR de un solo paso basados en sondas para virus respiratorios comunes. El primer ensayo es para SARS-CoV-2 (N), influenza A (H1N1 y H3N2) e influenza B. El segundo es para SARS-Cov-2 (N) y MERS (UpE y ORF1a). Estos ensayos se pueden implementar con éxito en cualquier laboratorio especializado.

Resumen

El coronavirus 2 del síndrome respiratorio agudo severo (SARS-CoV-2) que causa la enfermedad por coronavirus 2019 (COVID-19) es una grave amenaza para la salud pública en general. Durante las temporadas de influenza, la propagación del SARS-CoV-2 y otros virus respiratorios puede causar una carga de enfermedades respiratorias en toda la población que es difícil de manejar. Para ello, los virus respiratorios SARS-CoV-2, gripe A, gripe B y síndrome respiratorio de Oriente Medio (MERS-CoV) deberán vigilarse cuidadosamente en las próximas temporadas de otoño e invierno, especialmente en el caso del SARS-CoV-2, la gripe A y la gripe B, que comparten factores epidemiológicos similares como las poblaciones susceptibles, el modo de transmisión y los síndromes clínicos. Sin ensayos específicos de objetivos, puede ser difícil diferenciar entre los casos de estos virus debido a sus similitudes. En consecuencia, un ensayo múltiple sensible y dirigido que pueda diferenciar fácilmente entre estas dianas virales será útil para los profesionales sanitarios. En este estudio, desarrollamos un ensayo basado en PCR con transcriptasa inversa en tiempo real utilizando un kit de RT-qPCR de un solo paso R3T desarrollado internamente para la detección simultánea de SARS-CoV-2, influenza A, influenza B y SARS-CoV-2, MERS-CoV. Con tan solo 10 copias de sus ARN sintéticos, podemos identificar con éxito los objetivos del SARS-CoV-2, la gripe A, la gripe B y el MERS-CoV simultáneamente con un 100% de especificidad. Se ha comprobado que este ensayo es preciso, fiable, sencillo, sensible y específico. El método desarrollado se puede utilizar como un ensayo de diagnóstico optimizado para SARS-CoV-2, influenza A, influenza B y SARS-CoV-2, MERS-CoV en hospitales, centros médicos y laboratorios de diagnóstico, así como con fines de investigación.

Introducción

La pandemia de la actual enfermedad por coronavirus 2019 (COVID-19) está causada por el nuevo coronavirus conocido como coronavirus 2 del síndrome respiratorio agudo grave (SARS-CoV-2)1. Debido a la fuerte contagiosidad del SAR-CoV-2 y a su capacidad de transmisión rápida, la pandemia de COVID-19 surgió en la ciudad de Wuhan, China, y se propagó rápidamente por todo el mundo. Con el tiempo, esto condujo al inicio de signos de dificultad respiratoria e incluso a la muerte 2,3,4. La COVID-19 ha sido declarada pandemia en más de 213 países, previéndose un fuerte aumento en el número de casos confirmados, como lo demuestran los trabajos publicados por diferentes estudios de investigación 3,5. El COVID-19 se transmite principalmente por pequeñas gotitas respiratorias que las personas infectadas liberan al medio ambiente y luego se exponen a las personas vulnerables a través de la inhalación o el contacto cercano con superficies contaminadas. Cuando estas gotitas entran en contacto con la mucosa de los ojos, la boca o la nariz, una persona puede infectarse6. Las estadísticas publicadas por la Organización Mundial de la Salud (OMS) muestran que ha habido más de 76 millones de casos confirmados de la pandemia en todo el mundo, con la asombrosa cifra de 7 millones de muertes7. Así, las Naciones Unidas clasificaron la pandemia causada por la enfermedad COVID-19 como un desastre debido a su impacto directo en la vida de miles de millones de personas en todo el mundo y tuvo efectos económicos, ambientales y sociales de gran alcance.

Se ha demostrado que las iniciativas de salud pública, incluidas las pruebas exhaustivas, la detección temprana, el rastreo de contactos y el aislamiento de casos, son cruciales para mantener esta pandemia bajo control 8,9,10,11. Los meses de invierno aumentarán la circulación de otros virus respiratorios como la influenza A y B con síntomas similares a los de COVID-19, lo que dificultará la identificación, el seguimiento y el aislamiento temprano de los casos de COVID-19. Cada año, el brote de influenza A y B comienza a fines del otoño o principios de enero con una estacionalidad predecible12. Numerosos rasgos epidemiológicos son compartidos por los virus SARS-CoV-2 y Influenza. Además, comparte similitudes en las poblaciones susceptibles, que incluyen niños, ancianos, inmunodeprimidos e individuos con comorbilidades crónicas como asma, enfermedad pulmonar obstructiva crónica, insuficiencia cardíaca y renal o diabetes12,13. Estos virus no solo comparten poblaciones vulnerables, sino también vías de transmisión de contacto y gotitas respiratorias14. Se anticipa que es probable que los pacientes contraigan más de uno de estos virus respiratorios a medida que se acerca la temporada de influenza14. Para ello, es necesario realizar el cribado del SARS-CoV-2 y de los virus de la gripe en pacientes sintomáticos antes de aislarlos. No es posible realizar pruebas separadas para los tres virus (SARS-CoV-2, Influenza A e Influenza B) debido a la falta mundial de recursos para la extracción y el diagnóstico de ácidos nucleicos. Con el fin de examinarlos todos en una sola reacción, es necesario desarrollar un método o prueba.

El síndrome respiratorio de Oriente Medio (MERS)-CoV es un miembro de la familia del coronavirus humano (CoV). Las primeras cepas aisladas del virus MERS-CoV procedían de un paciente hospitalizado en Arabia Saudí que había fallecido en septiembre de 2012 debido a problemas respiratorios agudos15. Hay pruebas que sugieren que un huésped importante del MERS-CoV son los dromedarios. Se ha comprobado que los virus de dromedarios infectados son zoonóticos y, por lo tanto, pueden infectar a los humanos16,17. Los seres humanos infectados con este virus pueden transmitirlo a otras personas a través del contacto cercano18. Hasta el 26 de enero de 2018, se habían registrado 2143 casos de infección por MERS-CoV confirmados mediante pruebas de laboratorio, incluidas 750 muertes en todo elmundo. Los síntomas más típicos del MERS-CoV son tos, fiebre y dificultad para respirar. También se ha notificado que las infecciones por MERS-CoV presentan síntomas de neumonía, diarrea y enfermedades gastrointestinales20. En la actualidad, no se dispone de una vacuna comercial ni de un tratamiento específico para el MERS-CoV. Por lo tanto, el diagnóstico rápido y preciso es esencial para prevenir los brotes generalizados de MERS-CoV y diferenciar el MERS-CoV de la enfermedad por SARS-CoV-2.

Hasta la fecha, se han propuesto muchos enfoques para detectar estos virus, como la RT-PCRmultiplex 21,22,23,24,25, CRISPR/Cas1226,27, CRISPR/Cas928 y CRISPR/Cas329, inmunoensayo de flujo lateral30, sensores biomoleculares en papel31, pruebas SHERLOCK en un bote32, aptámero de ADN33, isoterma mediada por bucle amplificación (LAMP)19,34, etc. Cada uno de los métodos mencionados anteriormente tiene ventajas e inconvenientes únicos en términos de sensibilidad y especificidad. Entre estos métodos, la prueba basada en la amplificación de ácidos nucleicos: qRT-PCR multiplex, es la más común y se considera el estándar de oro para el diagnóstico de SARS-CoV-2, Influenza A, Influenza B y MERS-CoV.

En este estudio, diseñamos y evaluamos varias combinaciones de cebadores y sondas para la detección efectiva, precisa y simultánea de SARS-CoV-2, influenza A, influenza B y SARS-CoV-2, MERS-CoV utilizando ARN virales sintéticos de torsión estándar. La Organización Mundial de la Salud (OMS) recomienda los ensayos multiplexados desarrollados para los genes diana del MERS-CoV o del SARS-CoV-2. Por lo general, estos genes codifican proteínas y complejos que contribuyen a la formación de un complejo de replicación/transcripción (RTC)35, como la región dentro del marco de lectura abierto 1a (ORF1a) que se utiliza para el ensayo del MERS-CoV. Además, las proteínas estructurales están codificadas por los genes utilizados en los ensayos de diagnóstico, como la región ascendente del gen de la envoltura (upE) y el gen de la nucleocápside (N), que se utilizan para los ensayos de MERS-CoV y SARS-Cov-2, respectivamente35,36. Utilizamos el kit interno de RT-qPCR de un solo paso R3T para establecer la RT-qPCR para la detección de virus37. La detección de virus, la sensibilidad, la especificidad y el rango dinámico de nuestro kit de RT-qPCR de un solo paso R3T y los conjuntos de cebadores se probaron y evaluaron utilizando diluciones en serie de 10 veces de los ARN sintéticos de torsión estándar. El límite de detección práctico más bajo fue de aproximadamente 10 copias de transcripción por reacción. Como resultado, el kit interno de RT-qPCR de un solo paso R3T y los conjuntos de cebadores/sondas se pueden utilizar e implementar con éxito para el diagnóstico simultáneo rutinario de SARS-CoV-2, influenza A, influenza B y SARS-CoV-2, MERS-CoV.

Protocolo

1. Expresión y purificación de la polimerasa Taq

  1. Construya un plásmido con una etiqueta de hexa-histidina escindible en el extremo C de la enzima.
  2. Transformar 50 ng del vector de expresión en cepa BL21-(DE3) de E. coli siguiendo el protocolo estándar38.
  3. Inocular las células transformadas en cuatro matraces de 6 L, cada uno de los cuales contiene 2 L de caldo de 2YT a 37 °C con agitación a 170 rpm hasta alcanzar el OD 600 de 0,8 o el número de celda 6,4 x 108 .
  4. Inducir la expresión de la polimerasa Taq con 0,5 mM de isopropil-β-d-tiogalactopiranósido (IPTG) e incubar a 16 °C durante 18 h con agitación.
  5. Coseche las células girándolas a 4 °C a 7808 x g durante 10 min. Resuspender los gránulos en 200 ml de un tampón de lisis de polimerasa Taq helado (Tabla 1) en 5 ml/g de gránulos celulares.
  6. Incubar las células con lisozima (2 mg/ml de tampón de lisis) e inhibidores de la proteasa durante 45 min y luego pasar el lisado a través de un disruptor celular a 30 kPsi y centrifugar a 22.040 x g durante 30 min a 4 °C para separar los restos celulares.
  7. Calentar el sobrenadante durante 15 min a 85 °C. Centrifugar a 95.834 x g durante 1 h a 4 °C. Recoja el sobrenadante y fíltrelo en hielo con un filtro de 0,45 μm.
  8. Realice la purificación de proteínas mediante cromatografía líquida rápida de proteínas (FPLC) pasando primero la muestra a través de una columna de Ni-NTA HP de 5 ml a un caudal de 4 ml/min utilizando el tampón de polimerasa Taq A (Tabla 2; Figura 1A).
  9. Lavar con 10 volúmenes de columna (CV) de tampón de polimerasa Taq A y 4% de tampón de polimerasa B de Taq (Tabla 2). Eluir la proteína unida con un gradiente lineal utilizando el tampón B de la polimerasa Taq durante 20 CV en un frasco de 100 ml.
  10. Pasar el eluyente en el frasco de 100 mL a través de una columna de intercambio catiónico de 5 mL a 4 mL/min utilizando el tampón de polimerasa Taq C (Tabla 2; Figura 1A).
  11. Lavar con 20 CV de tampón de polimerasa Taq C al 100% y tampón polimerasa D de Taq al 5% (Tabla 2).
  12. Eluir con un gradiente lineal utilizando el tampón de polimerasa Taq D (Tabla 2) a partir del 5% al 100%.
  13. Compruebe las fracciones eluidas realizando la electroforesis en gel SDS-PAGE 39 seguida de la tinción en gel 40 como se ha descrito anteriormente. Brevemente, tome 10 μL de cada fracción y agregue un volumen igual de 2x SDS de tinte de carga. Desnaturalizar la muestra a 90°C durante 10 min. Cargue las muestras en un gel SDS-PAGE al 10% y deje pasar el gel durante 25 minutos a 200 V. Tiña el gel con Coomassie Brilliant Blue y luego quita las manchas.
  14. Recoger todas las fracciones que contienen la polimerasa Taq purificada y dializarlas contra el tampón de almacenamiento de la polimerasa taq (Tabla 3) a 4 °C. Brevemente, prepare 2 L del tampón de almacenamiento y sumerja el casete de diálisis en el tampón durante 2 minutos para hidratarse. Inyecte las fracciones recogidas con una aguja en el casete de diálisis y déjelo toda la noche en el tampón de diálisis a 200 rpm en el agitador.
  15. Después de la diálisis, medir la concentración de proteínas con un espectrofotómetro, hacer alícuotas de 10 μL, congelar rápidamente en nitrógeno líquido y almacenar a -80 °C.
    NOTA: Filtre todos los tampones para la purificación utilizando un filtro de 0,45 μm antes de cargarlos en el sistema FPLC.

2. Expresión de MMLV-RT en el sistema de expresión y purificación de células de insectos

  1. Generación y aislamiento de ADN de Bacmid
    1. Clone la secuencia de MMLV-RT con una etiqueta TEV-8xHis-Strep escindible en el extremo C-terminal como se describió anteriormente41.
    2. Mezcle 100 ng del vector de expresión en 50 μL de células DH10Bac y mezcle suavemente golpeando el tubo.
    3. Incubar las células en hielo durante 15 min. Realice un choque térmico en las celdas durante 1 minuto a 42 °C.
    4. Transfiera inmediatamente a hielo y agregue 400 μL de medio S.O.C. Incubar a 37 °C con agitación durante 4 h.
    5. Placa de 10 μL y 15 μL de la mezcla en placas de agar LB que contienen tres antibióticos; 50 μg/mL de Kanamicina, 10 μg/mL de Tetraciclina y 7 μg/mL de Gentamicina junto con 40 μg/mL de IPTG y 100 μg/mL de X-Gal para la selección azul-blanca.
    6. Incubar las placas a 37 °C durante 48 h. Escoja varias colonias blancas y una colonia azul como control, y vuelva a colocarlas en placas frescas de agar LB que contengan los antibióticos anteriores. Incubar las placas durante la noche a 37 °C.
    7. Después de confirmar el fenotipo blanco, elija un par de colonias e inocule en 10 ml de medio LB que contenga 50 μg/ml de kanamicina, 10 μg/ml de tetraciclina y 7 μg/ml de gentamicina en tubos de 50 ml.
    8. Incubar el cultivo a 37 °C agitando a 170 rpm durante la noche. Pulveriza las células haciéndolas girar a 22.040 x g durante 10 min.
    9. Decantar el sobrenadante y volver a suspender el gránulo en 250 μL de solución de resuspensión del kit de minipreparación (esta solución debe manipularse de acuerdo con las instrucciones del fabricante), luego transferir la solución a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL.
    10. Añadir 250 μL de solución de lisis, mezclar suavemente e incubar durante 3 min. Añadir 350 μL de solución neutralizante, invertir 2x-3x y centrifugar a 22.040 x g durante 10 min.
    11. Transferir el sobrenadante a un tubo nuevo y añadir un volumen igual de isopropanol helado e incubar durante 30 min a -20 °C.
    12. Pulverizar el ADN precipitado girando a 22.040 x g durante 10 min. Deseche el sobrenadante y lave el pellet con 700 μL de etanol helado al 70%, 2x.
    13. Retire el sobrenadante con una pipeta sin tocar el gránulo. Deje que el pellet se seque al aire en la campana de flujo laminar durante 5-10 minutos o hasta que no se vea líquido en el tubo. Disolver el gránulo en 100 μL de tampón EB.
  2. Transfección de Bacmid y amplificación del virus
    1. Preparación del virus P1
      1. En una placa de cultivo de tejidos de 6 pocillos, siembre ~ 9 x 105 células/pocillo en 2 mL de medio de cultivo de células de insectos.
      2. Incube la placa durante ~ 30 minutos a temperatura ambiente para permitir que las células se adhieran.
      3. Prepare la mezcla de Bacmid/Fugene de la siguiente manera: mezcle 1 μg de ADN de Bacmid y 300 μL de medios de células de insectos en un tubo. En otro tubo, mezcle 8 μL de reactivo de transfección y 300 μL de medios de células de insecto. Mezclar ambas mezclas mediante un pipeteo suave y dejar reposar ~30 min a temperatura ambiente para que se forme el complejo de reactivos de bacmid/transfección.
      4. Agregue la mezcla de complejo de bacmid (~ 210 μL) a cada pocillo gota a gota y selle la placa con una película transparente.
      5. Incubar la placa a 27 °C durante 3-4 días.
      6. Tome el medio que contiene el virus, agregue FBS (concentración final 2%), filtre con un filtro de 0,45 μm y almacene a 4 ° C en la oscuridad como stock de virus P1.
    2. Preparación del virus P2
      1. Transfectar 50 mL de células de insecto a 2 x 106 células/mL con 3 mL de virus P1 en un matraz de cultivo.
      2. Incubar a 27 °C con agitación a 100 rpm durante 4-6 días hasta que el porcentaje de células muertas alcance el 25%-30%.
      3. Centrifugar a 300 x g durante 10 min y recoger el sobrenadante que contiene el virus.
      4. Añadir FBS hasta una concentración final del 2%, filtrar a través de un filtro de 0,45 μm y alícuotas de 1 ml cada uno y almacenar a -80 °C como caldo de virus P2.
    3. Preparación del virus P3
      1. Transfectar 100 mL de células de insecto a 2 x 106 células/mL con los 2 mL de virus P2 en un matraz de cultivo.
      2. Incubar a 27 °C con agitación a 100 rpm durante 3-4 días hasta que el porcentaje de células muertas alcance el 15%-20%.
      3. Centrifugar las células a 300 x g durante 10 min y recoger el sobrenadante que contiene el virus.
      4. Agregue FBS a una concentración final del 2%. Filtrar a través de un filtro de 0,45 μm. Se puede almacenar en la oscuridad a 4 °C durante 1 mes.
  3. Expresión y purificación de MMLV-RT en células de insectos
    1. Añadir 5 ml de virus P3 a las células frescas de insectos a una densidad de 2 x 106 células/ml (matraz de 700 ml/2 litros) en un total de 6 frascos.
    2. Cosechar las células después de 55-60 h de post-transfección girando a 7808 x g durante 10 min.
    3. Resuspender los gránulos celulares en 200 mL de tampón de lisis MMLV-RT (Tabla 4). Pasar el lisado a través de un disruptor celular a 15 kPsi y centrifugar a 22.040 x g durante 30 min a 4 °C.
    4. Trasvasar el sobrenadante a nuevos tubos y volver a centrifugar a 95,834 x g a 4 °C durante 1 h. Recoja el sobrenadante y fíltrelo en hielo con un filtro de 0,45 μm.
    5. Comience la purificación de proteínas mediante FPLC pasando primero la muestra a través de la columna de 5 ml de Ni-NTA Excel (Figura 1B) a un caudal de 4 ml/min utilizando el tampón A de MMLV-RT (Tabla 5).
    6. Lavar la columna con 10 CV de tampón MMLV-RT A y 4% de tampón MMLV-RT B (Tabla 5) y eluir la proteína con el gradiente lineal de tampón MMLV-RT B durante 20 CV en un frasco de 100 mL.
    7. Pasar la muestra eluida a través de la columna de estreptococo 5 mL (Figura 1B) equilibrada con el tampón MMLV-RT C (Tabla 5).
    8. Lavar la columna con 10 CV de tampón C MMLV-RT al 100% y eluir la proteína con un gradiente lineal con 20 CV de tampón D (Tabla 5).
    9. Verifique las fracciones eluidas realizando SDS-PAGE como se hace en los pasos 1.13.-1.14. y recoger las fracciones que contienen MMLV-RT purificado para dializarlas con el tampón de almacenamiento de MMLV-RT (Tabla 6) a 4 °C.
    10. Mida la concentración de proteínas con Nanodrop, alícuota, congele rápidamente en nitrógeno líquido y almacene a -80 °C.
      NOTA: Filtre todos los tampones para la purificación utilizando un filtro de 0,45 μm antes de cargarlos en el sistema FPLC.

3. Preparación de componentes internos del kit RT-qPCR de un solo paso R3T multiplex

  1. Preparación de la mezcla tampón
    1. Prepare el tampón 2x para la reacción RT-qPCR que contiene los reactivos mostrados anteriormente en elpunto 37. Preparar todos los reactivos en agua sin DNasa/RNasa y la mezcla tampón almacenada en un congelador a -20 °C.
  2. Preparación de la mezcla de cebadores y sondas y cebadores
    NOTA: Las sondas y cebadores utilizados se enumeran en la Tabla 7. El kit multiplexado contra la influenza y el SARS-CoV-2 contiene 3 sondas y 4 juegos de cebadores hacia adelante y hacia atrás. Las sondas se marcan en los extremos 5′ utilizando reporteros 6-carboxifluoresceína (FAM) para InfA, Texas Red-XN para SARS-CoV-2 (gen N) y Yakima Yellow para InfB. El kit multiplexado para el MERS-CoV y el SARS-CoV-2 contiene 3 sondas y 3 juegos de cebadores directos e inversos. Las sondas también se marcan en los extremos 5′ utilizando reporteros Texas Red-XN para MERS-CoV (gen ORF1a), VIC para MERS-CoV (gen UpE) y 6-carboxifluoresceína (FAM) SARS-CoV-2 (gen N).
    1. Prepare una mezcla de cebadores que contenga todos los cebadores y sondas enumerados en la Tabla 7 con una concentración final de 6,7 μM para cada cebador directo e inverso y 1,25 μM para cada sonda en un tubo de 1,5 mL. Guarde la mezcla de imprimación en el congelador a -20 °C. Utilice el tampón de elución para compensar el volumen requerido.
  3. Preparación de la mezcla de enzimas
    1. Prepare la mezcla de enzimas Taq polimerasa (30 U/μL) y MMLV-RT (60 ng/μL) en el tampón de almacenamiento de la polimerasa Taq como se muestra en la Tabla 3 para completar el volumen requerido. Realice este paso en hielo y almacene la mezcla de enzimas a -20 °C.
  4. Plantilla de ARN
    1. Resuspender los ARN sintéticos del SARS-CoV-2, la gripe A H1N1, la gripe A H3N2, la gripe B y el MERS-CoV por separado en 100 μl de 1 tampón Tris-EDTA (10 mM de Tri-Cl y 1 mM de EDTA (pH 8,0) para obtener un stock de 1 x 106 6 copias de ARN/μL.
    2. Mezclar ARN sintéticos para RT-qPCR en las siguientes configuraciones: 1) SARS-CoV-2, Influenza A e Influenza B agregando 5 μL de cada stock de virus a un volumen de 50 μL para hacer 1 x 105 copias de ARN/μL; 2) SARS-CoV-2, MERS-CoV añadiendo 5 μL de cada stock de virus a un volumen de 50 μL para hacer 1 x 105 copias de ARN/μL. Hacer diluciones seriadas 10 veces de cada mezcla de ARN sintético que van desde 1 x 105 copias de ARN/μL hasta 10 copias de ARN/μL.
      NOTA: Asegúrese de utilizar agua helada sin DNasa/RNasa para preparar la dilución en serie de las plantillas.

4. Prueba de RT-qPCR de un solo paso para SARS-CoV-2, influenza A, influenza B y SARS-CoV-2, MERS-CoV multiplexada internamente

NOTA: Desinfecte las superficies de la estación de trabajo y utilice una plantilla de placa de 96 pocillos para planificar el diseño de la placa de PCR.

  1. Preparación de la placa de 96 pocillos
    1. Descongele 2 veces la mezcla de tampón e imprimación. Mantenga la mezcla de enzimas en hielo.
    2. A cada pocillo, agregue 10 μL de mezcla tampón 2x, 1,5 μL de la mezcla de cebadores, 1 μL de mezcla de enzimas, 6,5 μL de agua libre de DNasa/RNasa y 1 μL de la mezcla de ARN correspondiente que debe analizarse. El volumen final en cada pocillo es de 20 μL. Consulte el diseño preparado para obtener ayuda con este paso.
      NOTA: Se recomienda hacer una mezcla maestra basada en el número de reacciones que contienen todos los reactivos excepto la muestra de ARN para evitar el sesgo de pipeteo. Además, realiza las reacciones por duplicado o triplicado para evitar errores técnicos.
    3. Selle la placa con un sello adhesivo de placa PCR y centrifugue brevemente durante 1 minuto para recoger todo el líquido en el fondo de la placa. Asegúrese de que cada pocillo tenga el mismo volumen de líquido y esté libre de burbujas antes de transferir las muestras a la máquina de qPCR.
      NOTA: Todas las reacciones de PCR deben configurarse en hielo.
  2. Programa de PCR
    1. Abra el programa de máquina de qPCR en tiempo real y elija las siguientes propiedades experimentales:
      El tipo de bloque: Rápido de 96 pocillos (0,1 ml)
      Configuración del experimento: Curva estándar
      Reactivos: Reactivos TaqMan
      Propiedades de ejecución: Estándar.
    2. Defina todas las dianas génicas y su colorante reportero como se presenta en la Tabla 7. Además, defina los nombres de las muestras para cada reacción que se va a probar para facilitar el análisis de las curvas de amplificación.
    3. Asigne objetivos y muestras al diseño de la placa del programa en función de la placa de 96 pocillos.
    4. Configure el siguiente programa de ciclo en el instrumento de PCR de la siguiente manera:
      55 °C durante 10 min
      40 ciclos: 94 °C durante 1 min
      94 °C durante 10 s
      68 °C durante 10 s
      68 °C durante 20 s; Aquí adquieren fluorescencia.
    5. Transfiera la placa a la máquina de qPCR en tiempo real y colóquela en el soporte asegurando la correcta orientación de la placa e inicie la corrida.
    6. Elija la ubicación del archivo para guardar los datos experimentales.
  3. Análisis de datos
    1. Es esencial examinar primero los gráficos de amplificación producidos por el programa qPCR. Analizar el límite de detección para evaluar la concentración mínima de ARN que se puede detectar.
    2. Grafique el logaritmo del número de copias de ARN en el eje x y el valor medio de Ct correspondiente en el eje y para evaluar la sensibilidad del ensayo. La pendiente y la R2 indican la fiabilidad y eficiencia de la reacción.

Resultados

En los últimos años, se han producido avances significativos en el abordaje diagnóstico para la detección de virus respiratorios comunes mediante abordajes de PCR 21,22,23,24,25. Sin embargo, a pesar de estos avances, el enfoque multiplexado, que permite detectar múltiples virus en una sola prueba, no se ha implementado ampliamente, particularmente en la ...

Discusión

Existe una pesada carga económica para el sistema de salud en todo el mundo como resultado de las altas tasas de infección y mortalidad debido a la propagación de virus respiratorios comunes como el SARS-CoV-2, la influenza A/B y las variantes del MERS-CoV 12,19,20. Motivados por el sentido de responsabilidad para aliviar esta carga, nos dimos cuenta de la necesidad de un ensayo de diagnóstico rápido, preciso y accesible, c...

Divulgaciones

Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.

Agradecimientos

Este trabajo fue apoyado por la Universidad de Ciencia y Tecnología Rey Abdullah a través de fondos básicos y el National Term Grand Challenge (NTGC) a S.M.H.

Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
0.45 μm filter cupsThermo Scientific291-4545
10X Tris-Glycine SDS running bufferNovexLC2675
6-well tissue culturing platesCorning353046
Ammonium sulfateFisher ScientificA701-3
AmpicillinCorning61-238-RH
Cation exchange (HiTrap SP HP) 5 mLCytiva17-1152-01
D-(+)-Biotin, 98+%Thermo ScientificA14207.60
DH10Bac competent cellsFisher Scientific10361012
Dialysis bag (Snakeskin 10,000 MWC)Thermo Scientific68100
Dithiothreitol (DTT)Thermo ScientificR0862
Dnase/Rnase Free Distilled WaterAmbionAM9930
dNTPsThermo ScientificR0192
E. coli BL21(DE3) competent cellsInvitrogenC600003
EDTAFisher ScientificBP120-1
Elution BufferQiagen19086
ESF 921 insect cell culture medium (Insect cells media)Expression Systems96-001-01
FBS SolutionGibcoA38400-01
Fugene (transfection reagent)PromegaE2311
GentamicinFisher Scientific15750060
GlycerolSigma AldrichG5516-500
IGEPAL CA-630Sigma AldrichI8896-100ml
ImidazoleSigma Aldrich56750-1Kg
Influenza A (H1N1) synthetic RNATwist Bioscience103001
Influenza A (H3N2)  synthetic RNATwist Bioscience103002
Influenza B synthetic RNATwist Bioscience103003
IPTGGold BiotechnologyI3481C100
KanamycinGibco11815-032
LB AgarFisher ScientificBP1425-500
LB Broth mediaFisher ScientificBP1426-500
LysozymeSigma AldrichL6876-10G
Magnesium ChlorideSigma Aldrich13152-1Kg
MERS-CoV synthetic RNATwist Bioscience103015
MicroAmp Fast Optical 96-well Reaction plates with Barcode (0.1 mL)Applied Biosystems10310855
Mini- PROTEAN TGX Precast GelBio-Rad456-1093
Miniprep kitQiagen27106
Ni-NTA Excel (HisTrap Excel) 5 mLCytiva17-3712-06
Ni-NTA HP (HisTrap HP) 5 mLCytiva17-5248-02
Optical Adhesice Covers (PCR Compatible,DNA/Rnase/PCR Inhibitors FreeApplied Biosystems4311971
Potassium ChlorideFisher BioreagentsBP366-1
Primers and ProbesIntegrated DNA Technologies, Inc.
Protease Inhibitor Mini tablets EDTA-FreeThermo ScientificA32955
Protein markerFermentas26616
RT-qPCR machine (QuantStudio 7 Flex)Applied Biosystems
S.O.C mediumFisher Scientific15544034
SARS-CoV-+A2:C442 synthetic RNATwist Bioscience102024
Sf9 insect cellsGibcoA35243
Sodium ChlorideSigma AldrichS3014-1Kg
StrepTrap XT 5 mLCytiva29401323
TetracyclineIBI ScientificIB02200
Tris Base Molecular Biology GradePromegaH5135
Tris-HClAffymetrix22676
Tween 20Sigma AldrichP1379-100ml
X-GalInvitrogenB1690

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